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方法論記事

Wistarアルビノラットにおける大腿骨骨切り術モデルを開発するためのプロトコル

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DOI：

10.3791/63712

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2022年8月31日

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1Department of Orthopedics, All India Institute of Medical Sciences (AIIMS), 2Department of Biochemistry, All India Institute of Medical Sciences (AIIMS), 3Department of Anaesthesiology Pain Medicine and Critical Care, All India Institute of Medical Sciences (AIIMS), 4Department of Radiodiagnosis, All India Institute of Medical Sciences (AIIMS), 5Department of Pathology, All India Institute of Medical Sciences (AIIMS), 6Central Council for Research in Homoeopathy (CCRH)

この記事について

サマリー

ここでは、Wistarアルビノラットの大腿骨のシャフトを医原性的に破壊し、カルスの発達を追跡するためのプロトコルを提示します。この大腿骨骨切り術モデルは、研究者が骨折治癒のプロセスを評価し、薬物が骨折治癒にどのように影響するかを研究するのに役立ちます。

要約

骨折治癒は、骨芽細胞と破骨細胞の協調作用によって骨欠損の再生をもたらす生理学的プロセスです。オステオアナボリック薬は骨折の修復を強化する可能性がありますが、高コストや望ましくない副作用などの制約があります。薬物の骨治癒の可能性は、最初はin vitro 研究によって決定することができますが、最終的な概念実証には in vivo 研究が必要です。私たちの目的は、研究者が大腿骨のシャフトの骨折後のカルス形成の発達を理解するのに役立ち、潜在的な薬物が骨治癒特性を持っているかどうかを確認するのに役立つ大腿骨骨切り術げっ歯類モデルを開発することでした。成体のオスのWistarアルビノラットは、施設動物倫理委員会の認可後に使用されました。げっ歯類は麻酔をかけ、無菌条件下では、大腿骨のシャフトの中央3分の1で完全な横骨折が開いた骨切り術を使用して作成されました。骨折は髄内Kワイヤーを使用して縮小および内部固定され、二次骨折治癒が行われました。手術後、腹腔内鎮痛薬と抗生物質を5日間投与しました。連続した毎週のX線はカルス形成を評価した。放射線学的に事前に決定された時点に基づいてラットを屠殺し、骨折カルスの発達を放射線学的および免疫組織化学を用いて分析した。

概要

骨は、骨形成細胞である骨芽細胞と骨吸収細胞である破骨細胞からなる密な結合組織です。骨折治癒は、骨芽細胞と破骨細胞の協調作用によって骨欠損の再生をもたらす生理学的プロセスである1。骨折がある場合、骨折部位の骨芽細胞および破骨細胞の活動は、骨治癒を決定する重要な要素のいくつかです2。骨折治癒が通常の経過から逸脱すると、結合の遅延、不和合、または非癒合が発生します。骨折は、骨折の癒合が9か月間失敗し、過去3か月間修復が進行しない場合、非癒合状態にあると言われます3。すべての骨折の約10%〜15%は、非癒合4に進行する可能性のある修復の遅延を経験します。すべての骨折の非癒合率は5%〜10%であり、関与する骨と骨折部位によって異なります5。

骨折非癒合の治療のための現在のレジメンは、外科的および/または医学的モダリティで構成されています。現在、骨折の遅延または非癒合は、骨移植などの外科的戦略によって克服することができます。ただし、骨移植には、移植組織の利用可能性、ドナー部位の痛み、罹患率、感染などの制限と合併症があります6。治療には、骨形成タンパク質(BMP)やテリパラチド(パラトホルモン類似体)などの骨同化薬が含まれます。現在使用されている骨同化剤は、骨折の修復を強化する可能性がありますが、法外なコストや望ましくない副作用などの制約があります7。したがって、骨治癒のための費用効果の高い非外科的代替案を特定する余地があります。薬物の骨治癒の可能性は、最初はin vitro 研究によって決定することができますが、最終的な概念実証には in vivo 研究が必要です。骨治癒を促進することが知られている薬物は in vitro で評価する必要があり、有望であることが判明した場合は、 in vivo 動物モデル研究に使用できます。薬物が in vivo モデルで骨形成とリモデリングを促進することが証明された場合、次の段階(すなわち、臨床試験)に進む可能性があります。

動物の骨折治癒を評価することは、ヒト試験を受ける前に骨治癒のために導入された新しい薬剤を評価するための論理的な前進です。骨折治癒の in vivo 動物モデル研究のために、げっ歯類はますます人気のあるモデル8になりました。げっ歯類モデルは、運用コストが低く、スペースの必要性が限られており、骨の治癒に必要な時間が短いため、関心が高まっています9。さらに、げっ歯類は広範囲の抗体と遺伝子標的を持っているため、骨の治癒と再生の分子メカニズムに関する研究が可能になります10。コンセンサス会議では、さまざまな小動物の骨治癒モデルを包括的に強調し、骨の治癒に影響を与えるさまざまなパラメーターに焦点を当て、いくつかの小動物の骨折モデルとインプラントを強調しました11。

基本的な破壊モデルは、開モデルと閉モデルに大きく分けることができます。閉鎖骨折モデルは、骨に3点または4点の曲げ力を使用し、従来の外科的アプローチを必要としません。それらは、ヒトの長骨骨折に似た斜めまたはらせん状の骨折を引き起こしますが、骨折の位置と寸法の標準化の欠如は、それらの交絡因子として機能する可能性があります12。開放骨折モデルは、骨の骨切り術のための外科的アクセスを必要とし、骨折部位においてより一貫した骨折パターンを達成するのを助けるが、閉鎖モデル13と比較して治癒の遅延と関連している。骨折治癒を研究するために使用される骨の選択は、それらの寸法とアクセシビリティのために、主に脛骨と大腿骨のままです。骨折部位の選択は通常、骨幹または骨幹です。骨端領域は、骨粗鬆症の影響を受けやすいため、骨粗鬆症の被験者で骨折治癒が研究されている場合に特別に選択されます14。髄内ピンや外部固定具などのいくつかのインプラントを使用して、骨折を安定させることができます11,15。

この研究の目的は、研究者が大腿骨骨折後のカルスの発達を理解するのに役立つだけでなく、潜在的な薬物が骨治癒特性を持っているかどうかを判断するのに役立つ、シンプルでわかりやすいげっ歯類モデルを開発することでしたそれが作用するメカニズムを理解することによって。

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プロトコル

動物実験は、インドのニューデリーにあるAIIMSの機関動物倫理委員会(IAEC)から倫理的承認を得た後に行われました(286 / IAEC-1 / 2021)。

1.術前処置

  1. 6〜8週齢のオスのWistarアルビノラットを、それぞれ体重150〜200 gの中央動物施設(CAF)で別々のケージに入れます。これにより、複数のラットがケージを共有するときに外科的/骨折部位の損傷がなくなります。
  2. ラットを相対湿度50%±5%の湿度制御された環境で23°C±2°Cの温度に保ち、12時間の暗/明サイクルにさらし、食物(標準的な半合成食):ペレット食(乾燥)と水。標準的な半合成食の組成は以下の通りである:ローストベンガルグラム小麦粉(60%)、小麦粉(22%)、カゼイン(4%)、脱脂粉乳(5%)、精製油(4%)、デンプンとの塩混合物(4.8%)、およびデンプンを含むビタミンコリン混合物(0.2%)。
  3. 手術前に少なくとも48時間ラットを順応させる。
  4. デジタル体重計で各ラットの体重を量り、体重を記録します。
  5. セフロキシム(100 mg / kg体重)、トラマドール(25 mg / kg体重)、およびケタミン(75 mg / kg体重)とキシラジン(10 mg / kg体重)の組み合わせの腹腔内(IP)注射をラットに投与します 外科的処置を開始する15分前に。.眼科用軟膏を両目に塗り、ドライアイを防ぎます。
  6. 右下肢から、脇腹領域から膝関節まで、脱毛クリームを局所塗布して脱毛します。
    注:血液(0.5 mL)は、さまざまなパラメーターのベースライン分析のために、各ラットの尾静脈から収集できます。手術後2週間ごとに再度採血することができます。

2.開腹骨切り術による完全横断骨折の外科的処置

注意: 手順を実行するには、手術台と最適な周囲温度(26°C)を備えた指定された操作室を使用してください。

  1. ワックスブロック(深さ2.5 cmまでのワックスを含む30 cm x 30 cm x 4 cmのアルミニウムトレイ)を手術台に置き、滅菌ドレープで覆います。ワックスブロックは、手術中の動物の位置の変化を防ぎます。
  2. 麻酔の開始を確認します(つま先のピンチの喪失を確認することによって)。麻酔をかけたラットを左横位置の滅菌ドレープの上に置きます。アシスタントに右下肢(膝と股関節)を伸ばすように依頼します。大腿骨を支えるために、右脚の下に滅菌済みのハードサポート(大理石のブロック)を保管してください。アルコールとベタジンで手術部位をきれいにします。
  3. 切開部位(右大腿部の外側)に局所麻酔(0.25mLの1%リグノカイン)を注射し、別の滅菌ドレープに穴を開け、ラットの右脚のみを手術のために露出させます。
  4. 右太ももの外側に1cmの垂直皮膚切開を行い、必要に応じて15番の手術用ブレードで伸ばします。
  5. メッツェンバウムハサミを使用して深部筋膜を分離することにより、外側広筋を露出させます。大腿骨の軸に達するまで、動脈鉗子を使用して筋線維に沿って外側広筋を分割します。
  6. 骨膜エレベーターを使用して、それに付着した筋肉から骨を解放します。
  7. 血管迷走神経反射を防ぐために、骨膜内およびその周囲に局所麻酔(0.2 mLの1%リグノカイン)を注入します。.
  8. 15番の手術刃で大腿骨の軸の真ん中3分の1にくぼみを作り、作ったくぼみにノミを置き(ノミが滑らないように)、ハンマーでノミを軽くたたくことで、シャフトの中央3分の1の骨を骨折します(完全骨折)。滅菌ハードサポート(大理石ブロック)を使用して、骨を骨折しながら骨を支え、きれいな破損を確保します。
    注意: 滅菌ハードサポートは通常、下の筋肉に重大な損傷を引き起こしません。
  9. バッテリー駆動の電動ドリルを使用して保持された滅菌K線(1.0 mm)を使用して、骨折を内部で固定します。Kワイヤーを骨折部位を通って遠位断片の髄管に通します。次に、電池式の電動ドリルを使用して、大腿骨の遠位端にKワイヤーをドリルで開けます。
    注意: 使用する前に、電動ドリルの表面をアルコールで消毒してください。Kワイヤーを固定した後、手袋を交換してください。
  10. 骨折を減少させた後、転子領域で購入が得られるまで、Kワイヤを遠位端から近位断片の管に進めます。ワイヤーカッターを使用して、皮膚から突き出ているKワイヤーの遠位部分を切り取ります。
  11. ペンチを使用してKワイヤーの先端を約90°に曲げ、ベタジンに浸したガーゼ包帯を使用してピンサイトドレッシングを行います。Kワイヤーは、骨折を縮小した位置に保つための髄内スプリントとして機能します。
  12. 3-0ナイロン縫合糸を使用して皮膚を閉じる前に、完全な止血を確認してください。滅菌ガーゼまたは動脈鉗子を使用して出血領域に圧力をかけ、出血を止めます。
  13. ベタジンで傷口をきれいにし、滅菌ガーゼとマイクロポア粘着テープで覆います。

3.術後ケア

  1. ラットをケージに戻し、通常の歩行を許可し、犠牲になるまで標準的な半合成食を与え続け、抗生物質(注射セフロキシム100 mg / kg)と鎮痛薬(注射トラマドール25 mg / kg /日を2回に分けて)手順後5日間腹腔内に投与します。.
    注:ラットは、特定の薬物をテストするために治療群と対照群に分けることができます。薬物が水溶性である場合、それは経管栄養を通して経口投与することができる。個々の動物の体重は、使用される薬物の用量を計算するために留意され得る。動物群の均質性を確保するために、包含基準および除外基準に従うことができる。
  2. 術前と同様の条件下で動物を個々のケージに収容する。手術部位を毎日検査して、術後の痛み、創傷感染、縫合糸の滑り、または腹部の腫れや不快感の兆候を探します。
  3. 骨折部位のX線による骨治癒を週に一度評価します。

4.放射線処置

  1. X線の前に、ケタミン(50 mg / kg体重)とキシラジン(5 mg / kg体重)の腹腔内注射でラットを麻酔します。.
  2. ラットの股関節を屈曲および外転した位置に保ち、膝関節を半屈曲させたままにして、次の露出設定で骨折した肢のX線を撮影します:参照kVp ≈ 62;参照 mAS = 6.4;および自動露出設定(参照mA = 160)。
    注:X線はベースライン時(手術後1日)に撮影され、その後、犠牲または5週間まで週に1回撮影されました。

5.動物の安楽死とカルス回収

  1. ソフトブリッジングカルスの放射線学的外観に基づいて、以前に決定された2つの時点で、二酸化炭素の過剰摂取(100%CO2 を7〜8 L / minの流量で1分間投与し、その後4〜5分の待機期間を投与)によってラットを犠牲にします。
  2. 大腿骨と平行に皮膚を切開し、カルス組織への損傷を避けるために、上にある筋肉を注意深く分離します。
  3. ハンマーとノミを使用して、股関節とカルス組織の間の骨を骨折します。同様に、カルスと膝関節の間の骨を骨折します。Kワイヤーを取り外し、生理食塩水で骨片をきれいにして、血栓と軟部組織を取り除きます。
  4. カルスを直ちに10%中性緩衝ホルマリン(サンプルあたり20 mL)を含むラベル付き容器に移し、室温(RT)で3日間保管します。

6.骨およびカルス組織の脱灰

  1. ホルマリンからカルス組織を採取し、骨組織の脱灰のために20%ETDA溶液、pH 7でRTに保ちます。
  2. 新鮮なEDTA溶液を2日ごとに約3週間交換し、カルス組織を乱さずに針で骨を突いて骨の脱灰を確認します。最適な脱灰は、骨組織の通常のざらざらした感覚の喪失によって示されます。
  3. 完全に脱灰した後、カルスの矢状部分を切断し、カルス組織のパラフィンブロックを調製する。病理組織16 およびその他の比較分析17のために、カルス組織の4μmの厚さの切片を切り取ります。

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結果

この研究は、Wistarアルビノラットの大腿骨骨切り術モデルを開発するために行われました。このモデルは、骨治癒、および骨治癒における有望な骨同化薬の骨形成効果を評価するために使用できます。標準的な外科的予防措置とプロトコルに従った。滅菌ガウン、ドレープ、および手術器具が手順に使用されました(図1)。装置(表1)は手術の48時間前に滅菌された。麻酔薬、鎮痛薬、および抗生物質は、動物が常に痛みや感染のない状態に保たれるようにするために、プロトコルに従って使用されました。血液(0.5 mL)を各ラットの尾静脈から採取して、ベースライン分析と、骨折治癒が発生したときのさまざまなパラメーターの時系列比較フォローアップを行うことができます。脱毛クリームを用いて脇腹領域から膝領域まで毛髪を除去した(図2)。骨切り術は、完了するまでに約10分かかりました(最初の切開から縫合まで)。無菌予防策に従うと、感染と死亡率はごくわずかでした。.局所麻酔(リグノカイン)後に切開を行い、外側広筋の線維を引っ込めた後...

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ディスカッション

この方法は、Wistarアルビノラットの骨折骨切りモデルを開発するために必要な詳細を明確に説明しています。このモデルは、骨折治癒における有望な骨同化薬の骨形成効果を評価し、骨治癒の複雑さを理解するために使用できます。この方法の顕著な特徴は、それが単純であり、あまり多くの時間や洗練された機器を必要としないことです。この方法では、成体の雄のWistarアルビノラットを実験のげっ歯類モデルとして選択した。性ホルモンに関連する骨治癒の交絡因子を除去するために、均一な性別が選択されました。

この研究は、他のグループや他の小動物モデルと同様に、開腹骨切り術の手順に従いました11、18、19。この方法で行われる開腹骨切り術が他の骨治癒モデルよりも優れている点は、損傷誘発性(完全皮質骨骨折)が通常の長骨骨折に似ていることであり、この方法の骨折治癒は、ドリル穴の骨損傷と比較して、カルス形成による二次骨治癒(軟骨骨化...

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開示事項

いずれの著者も、利益相反またはその他の財務開示を行っていません。

謝辞

著者らは、研究資金を提供してくれたAYUSH省のホメオパシー研究中央評議会(CCRH)に感謝したい。著者らは、ニューデリーのAIIMSの中央動物施設の支援と支援、およびニューデリーのAIIMSのCMETの写真とビデオ撮影の支援と支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルコールラマン&Ltd、ムンバイ、マハラシュトラ州、インドMFG/MD/2019/000189Sterillium手指消毒剤
動脈鉗子 Nebula surgical、グジャラート州、インドG.105.05S5 "、ストレート
バードパーカーハンドル 星雲外科、グジャラート州、インドG.103.03サイズ番号 3
ベタジン溶液Win-medicare ニューデリー、インドUP1425000000110% w/v ポビドン ヨウ素溶液
猫の足の皮膚リトラクター Nebula surgical, Gujarat, India908.SSmall
EDTASisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India43272二ナトリウム塩
EosinSigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India115935染色液の調製用 
鉗子(プレーン)星雲外科、グジャラート州、インド115.066インチ、プレーン
鉗子(歯付き)星雲外科、グジャラート州、インド117.066インチ、歯付き
ホルムアルデヒドSisco研究所Pvt.Ltd、マハラシュトラ州、インド84439性緩衝ホルマリンの調製用 
HaematoxylinSigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India104302染色液の調製用 
HammerNebula surgical, Gujarat, India401.M
Injection CefuroximeAkumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India48/UA/SC/P-2013セフロキシムナトリウム IP, 1.5 g/vial 
注射ケタミンBaxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, IndiaG/28-B/6ケタミン塩酸塩 IP, 50 mg/mL 
注射 キシラジンIndian Immunologicals Limited、ハイデラバード、テランガーナ州、インド28/RR/AP/2009/F/G塩酸キシラジン USP、20 mg/mL
注射リグノカインジャクソン研究所 Pvt Limited、パンジャブ州、インド 1308-B2%リグノカイン塩酸塩IP、21.3 mg / mL
注射トラマドール Intas Pharmaceuticals Limited、アーメダバード、グジャラート州、インドMB/07/500トラマドール塩酸塩 IP、50 mg/mL
K-wire 星雲外科、グジャラート州、インド166(1mm)12インチ、ダブルエンド
Kワイヤーを挿入するための機械式ドリル‎ボッシュ、ドイツ 06019F70K4GSR 120-LIプロフェッショナル
メッツェンバウムカッティングハサミ Nebula surgical、グジャラート州、インドG.121.06S6"、ストレート
ニードルホルダーNebula surgical、グジャラート州、インドG.108.066インチ、ストレート
眼科用軟膏 グラクソ・スミスクライン・ファーマシューティカル・リミテッド、バンガロール、カルナータカ州、インドKTK/28A/467/2001ネオマイシン、ポリミキシンB硫酸塩およびバシトラシン亜鉛眼科軟膏 USP
骨切り口(ノミ)星雲外科、グジャラート州、インド1001.S.1010 mm、ストレート
骨膜エレベーター Nebula surgical, グジャラート州, インド918.10.S10 mm, ストレート
プライヤー兼ワイヤーカッターNebula surgical, グジャラート州, インド604.65
Reynold'はさみ雲外科、グジャラート州、インドG.110.06S6 "、ストレート
標準半合成ダイエット Ashirvad Industries、チャンディーガル、インドカタログ番号なし詳細な組成 使用される材料で提供される スチール
カップ アプリケーション用ベタジンを保持するためのスチールカップローカル購入番号なし
オートクレーブ器具用の蓋付きスチールトレイローカル購入カタログ番号なし
滅菌ガーゼIdeal Healthcare Industries、デリー、インド E(0047)/14/MNB/7951滅菌済み、5cmx5cm、12プライ
サポート用滅菌大理石ブロック現地購入カタログ番号なし現地で製造済み; オートクレーブ可能
注射器と針 (1 mL) Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana,India REF 3030601 mL 滅菌シリンジ with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
シリンジと針 (2 mL) Becton Dickinson India Pvt. Ltd.、ハリヤナ州インド REF 3077492 mL滅菌シリンジ、24 G x 1インチ(0.55 mm x 25 mm)針
シリンジと針(10 mL) ヒンドゥスタンシリンジ&Medical Devices Ltd. ファリダバード、インド 334-B(H)10 mL滅菌シリンジ、21 G x1.5インチ(0.80 mm x 38 mm)針付き
用ブレード(サイズno.15)Paramount Surgimed Ltd、ニューデリー、インド、Medline Industries Inc、イリノイ州、米国参照滅菌、単回使用
外科用ブレード(サイズno.24)Paramount Surgimed Ltd、ニューデリー、インド Medline Industries Inc、イリノイ州、米国REFMDS15124E滅菌、 シングルユース
縫合糸HealthiumMedtech Pvt Ltd、バンガロール、カルナータカ州、インドSN 33184-0、16 mm、3/8サークルカッティングニードル、モノフィラメントポリアミド縫合 
アルミトレイ入りワックスブロック 現地で製造された番号はありません30 cm x 30 cm x 4 cm ワックス入りアルミニウムトレイ(動物の滑りを防ぐため)
X 線装置Philips India Ltd、グルグラム、ハリヤナ州SN19861013モデル: Philips Digital Diagnost R 4.2 
中星 カタログ、外科MDS15115Eカタログ

参考文献

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