方法論記事

高生存率組織採取のためのげっ歯類における低侵襲脳腫瘍切除術の実施

DOI：

10.3791/64048

⸱

2022年5月9日

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1Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurosurgery, University of Maryland School of Medicine, 3Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 4Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 5Pontifical Catholic University of Parana, 6Department of Pathology, University of Maryland School of Medicine, 7Departments of Ophthalmology, Oncology and Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、統合された組織保存システムを用いた低侵襲アプローチによるげっ歯類の脳腫瘍の標準化された切除を記載する。この技術は、げっ歯類や他の動物モデルにおける標準治療を正確に反映するための意味を持ちます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、げっ歯類脳腫瘍切除および組織保存のための標準化されたパラダイムを記載する。臨床診療では、最大腫瘍切除術はほとんどの脳腫瘍の標準治療です。ただし、現在利用可能なほとんどの前臨床脳腫瘍モデルには切除が含まれていないか、時間がかかり、術後の罹患率、死亡率、または実験の変動性が大きい外科的切除モデルを利用しています。さらに、げっ歯類の切除を行うことは、臨床的に比較可能な手術器具またはプロトコルの欠如、標準化された組織収集のための確立されたプラットフォームの欠如など、いくつかの理由で困難な場合があります。このプロトコルは、多機能、非切除切除装置の使用と、デバイスの臨床バージョンから適応された統合組織保存システムを強調しています。本研究で適用する装置は、調整可能な吸引と開口部の円筒形のブレードを組み合わせて、組織を正確にプローブ、切断、および吸引します。低侵襲切除装置は、最初の腫瘍移植に使用されるのと同じバリ穴 を介して その機能を実行します。このアプローチは、生検または切除手術中の局所解剖学的構造の変化を最小限に抑え、重大な失血のリスクを軽減します。これらの因子は、手術時間(<2分/動物)を大幅に短縮し、術後の動物の生存率を改善し、実験群の変動性を低下させ、将来の分析のために切除された組織および細胞の高い生存率をもたらしました。このプロセスは、~1,400サイクル/分のブレード速度によって促進され、選択した生理学的溶液で満たすことができる滅菌閉鎖システムに組織を採取することができます。手術の影響を研究し、正確にモデル化することの重要性が高まっていることを考えると、局所化された腫瘍切除標本の保存と厳密な比較分析、および腔内送達治療、このユニークなプロトコルは、周術期管理と脳腫瘍患者の治療法の発見に関する未回答の質問を探求する機会を拡大します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

膠芽腫(GBM)は、成人で最も一般的で攻撃的な原発性脳腫瘍です。脳神経外科、標的薬開発、放射線療法の最近の進歩にもかかわらず、GBM患者の5年生存率は5%未満であり、この統計は30年以上にわたって有意に改善されていません1。したがって、より効果的な治療戦略が必要です。

新しい治療法を開発するためには、治験実施計画書が(1)腫瘍の不均一性と微小環境を正確に再現する翻訳可能な前臨床モデルを利用し、(2)現在手術、放射線療法、化学療法を含むGBM患者で使用されている標準的な治療レジメンを反映し、(3)切除されたコアと残存の違いを説明する必要があることがますます明らかになっています。 浸潤性腫瘍組織2,3,4,5。しかし、現在利用可能な前臨床脳腫瘍モデルのほとんどは、外科的切除を実施していないか、比較的時間のかかる外科的切除モデルを利用しているため、かなりの量の失血につながるか、標準化が不足しています。さらに、げっ歯類脳腫瘍の切除を行うことは、臨床的に比較可能な手術器具またはプロトコルの欠如、および体系的な組織収集のための確立されたプラットフォーム6の欠如のために困難であり得る(表1)。

本プロトコルは、多機能非切除低侵襲切除システム(MIRS)および統合組織保存システム(TPS)を使用したげっ歯類脳腫瘍切除および組織保存のための標準化されたパラダイムを記述することを目的としています(図1)。本技術により、GBMをはじめとする脳腫瘍モデルの前臨床研究における様々な研究に活用できる標準化されたプラットフォームが提供されることが期待されます。脳腫瘍の治療法または診断法を調査している研究者は、このプロトコルを実装して、研究で標準化された切除を達成することができます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物実験は、メリーランド大学とジョンズホプキンス大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。C57BL/6雌マウス、6〜8週齢を本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。マスク、手袋、ガウンの使用を含む、すべてのバイオセーフティレベル2(BSL-2)規制が守られました。

1.最初の頭蓋内腫瘍移植

  1. 研究の初期段階では、以前に発表された第7相に続いて、4 μLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)に懸濁した100,000個の細胞(GL261マウスグリオーマ細胞株)を各マウスに2.5 mmの深さまで頭蓋内注射します。
  2. 腫瘍移植後8から9日目のin vivoイメージングシステムを用いて各マウスにおける腫瘍シグナルを定量化する。
    注:必要に応じて、腫瘍量に基づいてマウスを2つのグループに層別化します。本研究では、2つのグループは、(1)腫瘍量が比較的小さいマウス(平均生物発光シグナル= 5.5e + 006 ± 0.1e + 006光子/ s、n = 10)および(2)比較的大きな腫瘍量を持つマウス(平均生物発光シグナル= 1.69e + 007 ± 0.2e + 007光子/ s、n = 10)、(p < 0.05、マンホイットニー検定)9。
  3. 各グループを2つの比較可能なサブグループに分けます。
    注:この研究では、2つのサブグループは、未治療のマウス(n = 5)と、MIRSを使用して外科的切除を受けている腫瘍のあるマウス(n = 5)、(p > 0.05、マンホイットニー検定)9でした。
  4. 切除の日から開始して、腫瘍成長パターンに基づく頻度で in vivo イメージングシステムを使用して腫瘍進行を追跡する。
    注:GL261細胞株の場合、切除当日の腫瘍の進行を追跡し、その後3〜6日ごとに追跡します。

2. MIRSを用いた腫瘍切除術

  1. 誘導チャンバー内のイソフルラン-O2 ガス混合物またはキシラジン/ケタミン溶液の腹腔内注射を使用してマウスを麻酔します。
    1. ガス麻酔薬を使用する場合は、麻酔誘導のためにガス流量を1.0 mL / minに設定し、気化器を2.0%に設定し、通常チャンバー内で3〜5分かかります(材料の表を参照)。
    2. 注射可能な麻酔薬を使用する場合は、0.2 mLの麻酔液(80〜100 mg / kgのケタミンと10〜12.5 mg / kgのキシラジン、 材料の表を参照)を腹腔内に注射してマウスに麻酔をかけます。.
  2. つま先をつまんで動物の適切な鎮静を評価します。角膜の乾燥を避けるために眼科用軟膏を目に塗ります。手順の前に鎮痛薬(0.03-0.06 mg / kgブプレノルフィンを皮下投与)を投与します。.
  3. 完全な鎮静が確認されたら、マウスを定位フレーム( 材料の表を参照)に置きます。
    注:ガス麻酔薬を使用する場合は、マウスの鼻をノーズコーンに入れ、手順中にイソフルラン-O2 混合物(1.5%)を受け取り続けます。
  4. 前のステープルを取り除き、脱毛クリームまたはひげそりで髪を取り除きます。クロルヘキシジン/ベタジンベースのスクラブとアルコールの交互のサイクルで皮膚を消毒します。.次に、滅菌メスを使用して、前の外科的瘢痕に沿って1cmの縦正中線切開を作成します。
  5. MIRSハンドピースをステージアダプター/ハンドピースホルダーを介して定位アームに取り付け、安定性と精度を高めます。
  6. 次の設定を使用して、MIRSマシン( 材料表を参照)をセットアップします(図1)。
    1. 背面パネルにセットされている電源コードを電源コードレセプタクルに挿入します。切り替えて、システムの電源をオンまたはオフにします(1 =オン、0 =オフ)。
    2. 窒素ホース(本体に付属)の一端を本体の背面パネルのオスフィッティングに挿入します。接続ナットを時計回りに回して接続を締めます。
      注意: ホースの反対側の端を窒素供給に接続する必要があります。
    3. ホースを窒素供給に取り付ける前に、供給圧力がコンソールに推奨される入力供給圧力である 100 psig を超えていないことを確認してください。
      注意: 窒素がコンソールに供給されると、フットペダルで作動すると、コンソールは独自の吸引を生成します。
    4. 真空ポートの蓋を固定し、真空システムの漏れを防ぐために密閉します。吸引システムのリークは、MIRSコンソールのパフォーマンスに影響します。
    5. セットアップ中またはプライミング中に吸引量が17未満の場合は、コンソールの前面にある吸引ノブが最大レベル(100)に設定されていることを確認し、吸引システムに漏れがないことを確認し、窒素入力供給圧力が正しいことを確認します。
    6. フット ペダルを本体に接続するには、灰色のフット ペダル コネクターをカチッと所定の位置に収まるまで灰色のレセプタクルに挿入します。
      メモ: フットペダルコネクタは、コンソールに一方向で接続され、キーが付けられています。
    7. ハンドピースを本体に接続するには、青色のハンドピース コネクタを青色のレセプタクルにカチッと音がして所定の位置に収まるまで挿入します。
      メモ: ハンドピースコネクタは、コンソールに一方向で接続され、キーが付けられています。
    8. システムを使用する前に、小さなボウルから開口部、チューブとハンドピース、キャニスターに滅菌液を吸引して、各ハンドピースをプライミングし、チューブとハンドピースの内側が潤滑され、組織の閉塞を減らします。
    9. コンソールのフロントパネルで適切なモードを選択して、吸引のみまたは切断を伴う吸引の準備をします。フットペダルの使用を開始します。
  7. 23 G MIRSカニューレをバリ穴に2.5 mmの深さまで挿入します。
  8. カニューレに接続されているフットペダルを押して、切除プロセスを開始します。ハンドピースのコントロールノブを使用して、1サイクル(360°)以上の切除を行います。
    注:実行されるサイクルが多いほど、切除される腫瘍組織の量が多くなります。
  9. 切除プロセスが完了したら、23 G MIRSカニューレをバリ穴から引き出し、5 mLの1x PBSを使用してチューブを洗い流し、残留破片を取り除きます。
  10. マウスを定位フレームから取り外し、ホッチキスまたは4-0縫合材料で傷を閉じます( 材料の表を参照)。
  11. マウスをケージに戻す前に、麻酔からの回復中に加熱パッドの上または暖かい光の下に置きます。
  12. 実験が完了したら、フラッシングによってカニューレをパージ します 。冷やした培地と空気を交互に使用して、切除されたすべての組織を収集キャニスターに「押し戻します」。システムから回収キャニスターを取り外し、付属のキャップでキャップを外します。
  13. ステップ2.12を完了した後、カニューレの遠位先端を3%H 2 O2に配置し、24〜25インチHgで吸引を適用して吸引ラインを吸引収集キャニスターに戻し、60〜90秒間放置します。空気と媒体を断続的にパルスする滅菌媒体で洗い流します。
  14. 手順に従って、神経学的兆候(異常な不規則な動きまたは発作)がないかマウスを監視します。
  15. 重度の神経障害(無気力になる、罵倒された外観、腰を下ろす、または不規則な動きをする)を持つマウスを安楽死させます。
    注:本研究では、市販の安楽死溶液200 mg / kg( 材料の表を参照)を使用して、各マウスを安楽死させました。

3. TPS による 組織採取

  1. 腫瘍サンプルをRBC溶解培地( 材料の表を参照)を含む組織培養皿に室温で5分間浸します。
    注:MIRSからTPSに採取された組織は、主に組織の小さな塊とともに単一細胞の形になります。
  2. 70 μmのフィルター( 材料の表を参照)を50 mLのコニカルチューブに置き、5 mLシリンジのプランジャーを使用して腫瘍サンプルをフィルターに通します。
  3. トランスファーピペットでは、RPMI-1640培地を使用して、細胞や組織塊をフィルターに通すことができます。
  4. 428 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清をピペットで捨てる。
  5. 各サンプルを調製したRPMI-1640培地5 mLに再懸濁します。
  6. 組織の生存率を高めるには、特に最初の印象で大きな組織チャンクを視覚化する場合は、必要な量の酵素カクテル(DNAアーゼI、コラゲナーゼIV、ディスパーゼ、パパイン、EDTAを含む、 材料表を参照)を各サンプルに追加します。渦を使用して溶液を混合します。
    メモ: ステップ 3.6 はオプションです。酵素カクテルの組成(総容量5 mL/サンプル):300 μLのDNAアーゼIグレードII、150 μLのコラゲナーゼ/ディスパーゼ(フィブロネクチン、コラゲナーゼIV、I、および非極性アミノ酸を切断)、250 μLのパパイン(非特異的プロテアーゼ)、および6 μLの0.5 M EDTA。
  7. サンプルを200rpm、37°Cに設定したシェーカーインキュベーターに20分間入れます。
  8. 20分後、サンプルを428 x g で4°Cで5分間回転させます。 上澄み液を捨てる。
  9. 70 μmのセルストレーナーで単一細胞をろ過し、274 x g で4°Cで3分間スピンダウンします。 トリパンブルーと血球計算盤を使用して細胞生存率分析10 を実施します( 材料の表を参照)。
    注:0日目の生存率は30%〜70%の範囲で、2〜3日以内に大幅に増加します。
  10. 必要な生存率テストに応じて、手順 4、5、または 6 に進みます。

4. 接着培養における細胞の増殖

  1. 認定された層流フードで、ペレットを血清含有付着培地(DMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)溶液など)に再懸濁し、接着細胞フラスコ内の細胞をプレートします。
  2. 細胞を制御されたインキュベート環境(37°C、5%CO2)に維持する。

5. 浮遊培養(ニューロスフェア)での細胞増殖

  1. 認定された層流フードで、ペレットを無血清完全幹細胞培地11 に再懸濁し、懸濁フラスコにプレートします。
  2. 細胞を制御されたインキュベート環境(37°C、5%CO2)で2〜3日間維持して、ニューロスフェアの形成を可能にします。
  3. 培地中のニューロスフェアを可視化した後、トリプシン-EDTAまたはアキュターゼ( 材料表を参照)を使用して、継代用の単一細胞懸濁液を取得します。
    注:採取時に特別な注意が払われ、神経幹細胞をサポートする適切な培地が使用される限り、採取された組織の幹細胞は数日以内にニューロスフェアを形成する必要があります。

6.再移植のための細胞の準備

  1. 1x PBSの4 μLあたり100,000生細胞の濃度でペレットを再懸濁します。
  2. 頭蓋内腫瘍移植法を用いてナイーブマウスに直ちに注射する(ステップ1)。

7.組織学的分析

  1. 切除直後に、脳を抽出し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で24時間12時間固定します。
  2. 脳をスクロースで飽和するまで30%スクロース溶液に移します(容器の底まで沈みます)。
  3. 脳を70%エタノール溶液に移します。
  4. 以前に発表された第13報告書に続いて、パラフィンブロック包埋、切片化、および標準的なヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色を実行します。
    注:染色のために採取した各切片の厚さは10μmであった。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MIRSを用いた外科的切除は腫瘍量の有意な減少をもたらす
腫瘍量が少ないグループでは、平均ベースライン生物発光シグナルは5.5e + 006光子/秒±切除を受けたサブグループでは0.2e + 006でした。切除後、平均生物発光シグナルは0.3e+006±3.09e+006光子/秒に減少しました(p <0.0001、マン・ホイットニー検定)9 (図2)。生物発光シグナルは、マウスが安楽死するまでの次の数日で増加した。同様に、腫瘍量が多いグループでは、平均ベースライン生物発光シグナルは、切除を受けたサブグループでは1.68e + 007光子/秒±0.1e + 007でした。切除後、平均生物発光シグナルは0.2e+006±5.19e+006光子/sに減少した(p <0.0001、マン・ホイットニー検定)9。生物発光シグナルは、マウスが安楽死するまでの次の数日で増加した。...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腫瘍切除は、低悪性度と高悪性度の両方の脳腫瘍に対する脳神経外科腫瘍治療計画の基礎です。腫瘍の細胞縮小および減量は、脳腫瘍患者の神経機能および全生存期間の改善と相関する1,2,5,6。外科的切除のプロトコルはげっ歯類モデルで以前に説明されていますが、これらのプロトコルは、生成された結果と前臨床モデルの全体的な翻訳可能性を混乱させる可能性のあるいくつかの制限に苦しんでいます。たとえば、以前に報告された外科的切除プロトコルには、骨皮弁を作成するための3〜4個の小さなバリ穴を備えた開頭術が含まれ、正常な脳組織と比較して腫瘍の色と一貫性を巧みに区別および区別します6。これらのプロトコルは時間がかかり、研究担当者は、手術用顕微鏡の利用、手術器具の取り扱い、周囲の正常な脳組織に関する腫瘍の境界の特定、および適切な恒常性の実現に関する高度なスキルを持っ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BTはNIHから研究資金を受けており、Acceleration Combination Therapies*の共同所有者であり、Ashvattha Therapeutics Inc.は彼女の特許の1つをライセンスしています。GWにはNIHの資金があります(R01NS107813)。HBは、Insightecの有給コンサルタントであり、同社の医療諮問委員会の会長です。この取り決めは、利益相反ポリシーに従ってジョンズホプキンス大学によってレビューおよび承認されています。HBは、NIH、ジョンズホプキンス大学、および慈善活動から研究資金を受けており、CraniUS、Candel Therepeutics、Inc.、Acceleration Combination Therapies*、Catalio Nexus Fund II、LLC*、LikeMinds、Inc*、Galen Robotics、Inc.*、Nurami Medical*のコンサルタントです。(*エクイティまたはオプションを含む)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mLシリンジBD309628
15 mLコニカルチューブCorning430052
200プルーフエタノールPharmCo111000200
5 mLピペットCoStar4487
70ミクロンフィルターFisher08-771-2
AccutaseMillipore SigmaSIG-SCR005
Anased (キシラジン注射、100 mg/mL)Covetrus33198
麻酔システムパターソン サイエンティフィック78935903
麻酔ガス廃棄物容器パターソン サイエンティフィ78909457
ベンチ プロテクター アンダーパッドCovidien10328
C57Bl/6、6-8 週齢マウスチャールズ リバー ラボラトリーズ株コード 027
ChroMini ProMoserType 1591-Q
Collagenase-DispaseRoche#10269638001
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher
Countess II FL HemacytometerThermo FisherA25750
Debris Removal SolutionMiltenyi Biotech#130-109-398
D-LuciferinGoldbioLUCK-1G
DMEM F12 メディアCorning10-090-CV
DMEM メディアCorning10-013-CV
DNAse ISigma Aldrich#10104159001
Eppendorf tubesPosi-Click1149K01
安楽死ソリューションHenry Schein71073
FBSMilliporeSigmaF4135
ウシ胎児血清サーモフィッシャー10437-028
ホルマリンInvitrogenINV-28906
ガーゼヘンリー・シャイン101-4336
hEGFPeproTech EC100-15
ヘパリンΣH-3149
hFGF-bPeproTech EC1001-18B
誘導室パターソン・サイエンティフィック・イ
イソフルランベトラ11695-6777-2
イソフルラン気化器パターソン・サイエンティフィック・イ78916954
ケタミン・コベトラス11695-0703-1
コップフ定位フレームコップフ・インスツルメン5001
ライトフィールド顕微鏡BioTekCytation 5
マイクロインジェクションユニットKopf5001
マイクロモータードリルForedomF210418
MRI システムBruker7T Biospec Avance III MRI スキャナー
NICO Myriad SystemNICO Corporation
眼科用軟膏Puralube 獣医軟膏
PapainSigma Aldrich#P4762
PBSInvitrogen#14190250
PenStrepMillipore SigmaN1638
Percoll solutionSigma Aldrich #P4937
Pipette controllerFalconA07260
Povidone-iodine solutionAplicare52380-1905-08
プロゲステロンΣP-8783
プトレシンシグマP-5780
RPMI MediaInvitrogenINV-72400120
メス刃Covetrus7319
メスハンドルファインサイエンスツール91003-12
スキンマーカータイムアウトD538,851
ステープルリムーバーMikRonACR9MM
ステープラーMikRonACA9MM
ステープルズ クレイ アダムス427631
定位フレームコップフ インスツルメンツ5000
ショ糖シグマ アルドリッチS9378
縫合糸、ビクリル 4-0エチコンJ494H
T-75 培養フラスコSarstedt83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x)LonzaBP10-548E
Trypsin-EDTACorningMDT-25-053-CI
ック ソフルラン・コベトラス 78933388 ・コス ツ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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