本プロトコルは、統合された組織保存システムを用いた低侵襲アプローチによるげっ歯類の脳腫瘍の標準化された切除を記載する。この技術は、げっ歯類や他の動物モデルにおける標準治療を正確に反映するための意味を持ちます。
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この記事について
サマリー
要約
本プロトコルは、げっ歯類脳腫瘍切除および組織保存のための標準化されたパラダイムを記載する。臨床診療では、最大腫瘍切除術はほとんどの脳腫瘍の標準治療です。ただし、現在利用可能なほとんどの前臨床脳腫瘍モデルには切除が含まれていないか、時間がかかり、術後の罹患率、死亡率、または実験の変動性が大きい外科的切除モデルを利用しています。さらに、げっ歯類の切除を行うことは、臨床的に比較可能な手術器具またはプロトコルの欠如、標準化された組織収集のための確立されたプラットフォームの欠如など、いくつかの理由で困難な場合があります。このプロトコルは、多機能、非切除切除装置の使用と、デバイスの臨床バージョンから適応された統合組織保存システムを強調しています。本研究で適用する装置は、調整可能な吸引と開口部の円筒形のブレードを組み合わせて、組織を正確にプローブ、切断、および吸引します。低侵襲切除装置は、最初の腫瘍移植に使用されるのと同じバリ穴 を介して その機能を実行します。このアプローチは、生検または切除手術中の局所解剖学的構造の変化を最小限に抑え、重大な失血のリスクを軽減します。これらの因子は、手術時間(<2分/動物)を大幅に短縮し、術後の動物の生存率を改善し、実験群の変動性を低下させ、将来の分析のために切除された組織および細胞の高い生存率をもたらしました。このプロセスは、~1,400サイクル/分のブレード速度によって促進され、選択した生理学的溶液で満たすことができる滅菌閉鎖システムに組織を採取することができます。手術の影響を研究し、正確にモデル化することの重要性が高まっていることを考えると、局所化された腫瘍切除標本の保存と厳密な比較分析、および腔内送達治療、このユニークなプロトコルは、周術期管理と脳腫瘍患者の治療法の発見に関する未回答の質問を探求する機会を拡大します。
概要
膠芽腫(GBM)は、成人で最も一般的で攻撃的な原発性脳腫瘍です。脳神経外科、標的薬開発、放射線療法の最近の進歩にもかかわらず、GBM患者の5年生存率は5%未満であり、この統計は30年以上にわたって有意に改善されていません1。したがって、より効果的な治療戦略が必要です。
新しい治療法を開発するためには、治験実施計画書が(1)腫瘍の不均一性と微小環境を正確に再現する翻訳可能な前臨床モデルを利用し、(2)現在手術、放射線療法、化学療法を含むGBM患者で使用されている標準的な治療レジメンを反映し、(3)切除されたコアと残存の違いを説明する必要があることがますます明らかになっています。 浸潤性腫瘍組織2,3,4,5。しかし、現在利用可能な前臨床脳腫瘍モデルのほとんどは、外科的切除を実施していないか、比較的時間のかかる外科的切除モデルを利用しているため、かなりの量の失血につながるか、標準化が不足しています。さらに、げっ歯類脳腫瘍の切除を行うことは、臨床的に比較可能な手術器具またはプロトコルの欠如、および体系的な組織収集のための確立されたプラットフォーム....
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プロトコル
すべての動物実験は、メリーランド大学とジョンズホプキンス大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。C57BL/6雌マウス、6〜8週齢を本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。マスク、手袋、ガウンの使用を含む、すべてのバイオセーフティレベル2(BSL-2)規制が守られました。
1.最初の頭蓋内腫瘍移植
- 研究の初期段階では、以前に発表された第7相に続いて、4 μLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)に懸濁した100,000個の細胞(GL261マウスグリオーマ細胞株)を各マウスに2.5 mmの深さまで頭蓋内注射します。
- 腫瘍移植後8から9日目のin vivoイメージングシステムを用いて各マウスにおける腫瘍シグナルを定量化する。
注:必要に応じて、腫瘍量に基づいてマウスを2つのグループに層別化します。本研究では、2つのグループは、(1)腫瘍量が比較的小さいマウス(平均生物発光シグナル= 5.5e + 006 ± 0.1e + 006光子/ s、n = 10)および(2)比較的大きな腫瘍量を持つマウス(平均生物発光シグナル= 1.69e + 007 ± 0.2e + 007光子/ s、n = 10)、(p
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結果
MIRSを用いた外科的切除は腫瘍量の有意な減少をもたらす
腫瘍量が少ないグループでは、平均ベースライン生物発光シグナルは5.5e + 006光子/秒±切除を受けたサブグループでは0.2e + 006でした。切除後、平均生物発光シグナルは0.3e+006±3.09e+006光子/秒に減少しました(p <0.0001、マン・ホイットニー検定)9 (図2)。生物発光シグナルは、マウスが安楽死するまでの次の数日で増加した。同様に、腫瘍量が多いグループでは、平均ベースライン生物発光シグナルは、切除を受けたサブグループでは1.68e + 007光子/秒±0.1e + 007でした。切除後、平均生物発光シグナルは0.2e+006±5.19e+006光子/sに減少した(p <0.0001、マン・ホイットニー検定)9。生物発光シグナルは、マウスが安楽死するまでの次の数日で増加した。.......
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ディスカッション
腫瘍切除は、低悪性度と高悪性度の両方の脳腫瘍に対する脳神経外科腫瘍治療計画の基礎です。腫瘍の細胞縮小および減量は、脳腫瘍患者の神経機能および全生存期間の改善と相関する1,2,5,6。外科的切除のプロトコルはげっ歯類モデルで以前に説明されていますが、これらのプロトコルは、生成された結果と前臨床モデルの全体的な翻訳可能性を混乱させる可能性のあるいくつかの制限に苦しんでいます。たとえば、以前に報告された外科的切除プロトコルには、骨皮弁を作成するための3〜4個の小さなバリ穴を備えた開頭術が含まれ、正常な脳組織と比較して腫瘍の色と一貫性を巧みに区別および区別します6。これらのプロトコルは時間がかかり、研究担当者は、手術用顕微鏡の利用、手術器具の取り扱い、周囲の正常な脳組織に関する腫瘍の境界の特定、および適切な恒常性の実現に関する高度なスキルを持っ.......
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開示事項
BTはNIHから研究資金を受けており、Acceleration Combination Therapies*の共同所有者であり、Ashvattha Therapeutics Inc.は彼女の特許の1つをライセンスしています。GWにはNIHの資金があります(R01NS107813)。HBは、Insightecの有給コンサルタントであり、同社の医療諮問委員会の会長です。この取り決めは、利益相反ポリシーに従ってジョンズホプキンス大学によってレビューおよび承認されています。HBは、NIH、ジョンズホプキンス大学、および慈善活動から研究資金を受けており、CraniUS、Candel Therepeutics、Inc.、Acceleration Combination Therapies*、Catalio Nexus Fund II、LLC*、LikeMinds、Inc*、Galen Robotics、Inc.*、Nurami Medical*のコンサルタントです。(*エクイティまたはオプションを含む)。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mLシリンジ | BD | 309628 | |
| 15 mLコニカルチューブ | Corning | 430052 | |
| 200プルーフエタノール | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mLピペット | CoStar | 4487 | |
| 70ミクロンフィルター | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (キシラジン注射、100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| 麻酔システム | パターソン サイエンティフィック | 78935903 | |
| 麻酔ガス廃棄物容器 | パターソン サイエンティフィ | 78909457 | |
| ベンチ プロテクター アンダーパッド | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6、6-8 週齢マウス | チャールズ リバー ラボラトリーズ | 株コード 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 メディア | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM メディア | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| 安楽死ソリューション | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | MilliporeSigma | F4135 | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャー | 10437-028 | |
| ホルマリン | Invitrogen | INV-28906 | |
| ガーゼ | ヘンリー・シャイン | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| ヘパリン | Σ | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| 誘導室 | パターソン・サイエンティフィック | ・イ | |
| イソフルラン | ベトラ | 11695-6777-2 | |
| イソフルラン気化器 | パターソン・サイエンティフィック | ・イ78916954 | |
| ケタミン | ・コベトラス | 11695-0703-1 | |
| コップフ定位フレーム | コップフ・インスツルメン | 5001 | |
| ライトフィールド顕微鏡 | BioTek | Cytation 5 | |
| マイクロインジェクションユニット | Kopf | 5001 | |
| マイクロモータードリル | Foredom | F210418 | |
| MRI システム | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI スキャナー | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| 眼科用軟膏 | Puralube 獣医軟膏 | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| プロゲステロン | Σ | P-8783 | |
| プトレシン | シグマ | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| メス刃 | Covetrus | 7319 | |
| メスハンドル | ファインサイエンスツール | 91003-12 | |
| スキンマーカー | タイムアウト | D538,851 | |
| ステープルリムーバー | MikRon | ACR9MM | |
| ステープラー | MikRon | ACA9MM | |
| ステープル | ズ クレイ アダムス | 427631 | |
| 定位フレーム | コップフ インスツルメンツ | 5000 | |
| ショ糖 | シグマ アルドリッチ | S9378 | |
| 縫合糸、ビクリル 4-0 | エチコン | J494H | |
| T-75 培養フラスコ | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
参考文献
- Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
- Miyai, M., et al. Current tr....
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再版と許可
