このプロトコルは、蛍光Ca2+ センサーGCaMP5Gを使用して、天然尿路上皮細胞における機械的に活性化されたイオンチャネルの機能を評価する方法論を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
機械的に活性化されたイオンチャネルは、伸張力やせん断力などの機械的刺激を電気的および生化学的信号に変換する生物学的トランスデューサです。哺乳類では、機械的に活性化されたチャネルは、触覚、聴覚、赤血球体積調節、基礎血圧調節、および膀胱充満感の感覚などの多様なプロセスにおける外部および内部刺激の検出に不可欠です。機械的に活性化されたイオンチャネルの機能は、パッチクランプ法を用いてin vitro設定で広く研究されてきましたが、多くの場合、これらのチャネルの発現部位(例えば、求心性末端、メルケル細胞、圧受容器、および尿細管)へのアクセスが制限されているため、またはパッチクランプ技術を適用することが困難であるため(例えば、 尿路上皮傘細胞の頂端表面)。このプロトコルは、ex vivo尿路上皮調製物における蛍光センサーGCaMP5Gを使用して機械的に誘発されたCa2+過渡現象を評価する手順を説明しており、他の天然組織調製物における機械的に誘発されたCa2+事象の研究に容易に適合できる技術である。
概要
尿路の上皮細胞は、尿路がネフロンを通って移動し、尿が腎盂から汲み出され、尿管を通って膀胱に貯蔵されるときに機械的な力を受けます。尿路を覆う上皮細胞に流体が及ぼす機械的力(せん断応力や伸張など)が、近位尿細管のタンパク質と遠位ネフロンの溶質の再吸収を調節することが長い間認識されてきました1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11、12,13、ならびに膀胱および排尿における尿の貯蔵14,15,16,17。
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プロトコル
動物の世話と取り扱いは、ピッツバーグ大学施設動物管理および使用委員会に従って実施されました。本研究では、生後2〜4か月のC57Bl / 6Jマウスの雌を使用しました。マウスは商業的に入手した( 材料表参照)。
1.機器の組み立てとセットアップ
- 高解像度カメラと安定した光源を備えた正立顕微鏡でCa 2+ イメージングを実行します( 材料表を参照)。
- USBデジタルI/Oデバイス を介して カメラ、光源、ピエゾアクチュエータを直接制御できる顕微鏡互換ソフトウェアを使用して画像を取得します( 材料表を参照)。
メモ: 図1 は、セットアップの回路図を表しています。GCaMP5Gは、470nmのピーク励起波長と497nmのピーク発光波長28を有する。GCaMP5Gイメージングに適したフィルターキューブを使用してください。
- USBデジタルI/Oデバイス を介して カメラ、光源、ピエゾアクチュエータを直接制御できる顕微鏡互換ソフトウェアを使用して画像を取得します( 材料表を参照)。
- 膀胱粘膜調製物中の個々の尿路上皮細胞の刺激(ステップ2を参照)には、単一チャネル開ループピエゾコントローラによって制御される圧電アクチュエータを使用します( 材料の表を参....
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結果
本プロトコルは、蛍光Ca2+センサーGCaMP5Gを用いてアンブレラ細胞における機械的に誘発されたCa2+過渡現象を評価する技術を記載する。アデノウイルス形質導入は、その高い効率と高レベルの発現を生じるため、尿路上皮細胞でGCaMP5Gを発現するために採用されました。形質導入された膀胱からの染色された凍結切片の蛍光画像を図2Dに示す。これらの実験では、GCaMP5G発現はアンブレラ細胞層において最も高い。傘細胞を突いた実験中に撮影された一連の代表的な画像を図3Aに示す。図3Aの第1の画像は、GCaMP5Gを発現する膀胱粘膜の傘細胞の上部に位置する刺激ピペットの蛍光図を示す。GCaMP5Gを発現するアンブレラ細胞の機械的刺激は変形を引き起こし(12.5秒の画像図3Aを参照)、続いて蛍光発光が急速に増加します(13.5秒の画像図3Aを参照)。
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ディスカッション
すべての生物、そして一見ほとんどの細胞型は、機械的刺激に応答するイオンチャネルを発現する20、33、34、35、36、37。これらの機械的に活性化されたチャネルの機能は、主にパッチクランプ技術で評価されています。しかし、アクセシビリティの問題により、機械的に活性化されたイオンチャネルのパッチクランプ研究は、解離した細胞と細胞株に大きく制限されてきました。機械的に活性化されたイオンチャネルの多くはCa2+を透過するため、顕微鏡、バイオセンシング、マイクロマニピュレーションの最近の進歩を利用して、ex vivo尿路上皮製剤における機械的に活性化されたチャネルの機能を評価するイメージング法を開発しました。このプロ.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)およびS10OD028596(G.A.へ)、およびピッツバーグ腎臓研究センターの細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコア(P30DK079307)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 20x 対物レンズ | Olympus UMPlanFL N | ||
| 24 G ¾”カテーテル | Medline | Suresite IVスライド | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| アナログ/デジタルコンバータ | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | AB6556 | |
| ビームスプリ | |||
| バイポーラ温度コントローラー | ワーナーインスツルメンツ | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M溶液 |
| cellSensソフトウェア | オリンパス | イメージングソフトウェア | |
| CMOSカメラ | 浜松 | オルカ融合 | |
| ロバ 抗ウサギ Alexa Fluor 488 | ジャクソン・イムノリサーチ | 711-545-152 | |
| Excel | マイクロソフト・コーポレーション | ||
| ・フィルター | クロマ | ET470/40X | |
| ガラスキャピラリー Corning 8250 ガラス | ワーナーインスツルメンツ | G85150T-4 | |
| グルコース Σ | G8270 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| インラインヒーター | ワーナーインスツルメンツ | SH-27B | |
| KCl | シグマ | 793590 | |
| 光源 | サッターインスツルメン | ツ ラムダ XL | |
| マニホールドポンプチューブ | フィッシャーブランド | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| マニホールドポンプチューブ | フィッシャーブランド | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| マウス | ジャクソンラボ | 664 | 生後2-4ヶ月 メス C57BL/6J |
| Microforge | 成重 | MF-830 | |
| マイクロマニピュレーター | サッター機器 | MP-285 | |
| 顕微鏡 | オリンパス | BX51W | |
| DAPI封入剤 | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI(ダピ付き |
| NaCl | シグマ | S7653 | |
| pClamp ソフトウェア | Molecular Devices | バージョン 10.4 | パッチクランプ電気生理学データ収集および分析ソフトウェア |
| 蠕動ポンプ | Gilson | Minipuls 3 | |
| 圧電アクチュエータ | Thorlabs | PAS005 | |
| ピペットホルダー | World Precision Instruments | ||
| ピペットプーラー | 成重 | PP-830 | |
| クイック交換加熱ベース 灌流・アダプターリングキット付 | ワーナーインスツルメンツ | QE-1 | クイック交換プラットフォーム 35mmディッシュに適合 |
| ローダミンファロイジン | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | 科学グラフ作成およびデータ解析ソフトウェア |
| シリコーンエラストマー | ダウ | シルガード 184 | |
| シングルチャンネル オープンループ ピエゾコントローラー | Thorlabs | MDT694B | |
| スクエアグリッドホルダーパッド | テッド・ペラ | 10520 | |
| 縫合 | AD 外科 | S-S618R13 | 6-0 シルク |
| テフロン取り付けロッド | カスタムメイド | マイクロマニピュレーターに圧電アクチュエータを取り付けるために使用します | |
| チューブ | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | ナショナルインスツルメンツNI | USB-6501 |
参考文献
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C.
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再版と許可
