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方法論記事

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

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DOI:

10.3791/65618

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2023年10月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

この記事について

サマリー

ここでは、ヒトの辺縁ニッチ細胞を単離して同定するためのプロトコルを紹介します。

要約

ここでは、辺縁ニッチ細胞(LNC)の単離と同定のための標準的な手順を報告します。アイバンクから得られた辺縁部組織をLNCの単離に使用しました。組織を無菌条件下で12個に分割し、コラゲナーゼAを使用して細胞培養インキュベーターで37°Cで18時間消化し、LNCおよび辺縁上皮前駆細胞を含む細胞クラスターを得ました。細胞クラスターを0.25%トリプシン-EDTAを用いて37°Cで15分間消化し、単一細胞を得た後、5%マトリゲルでコーティングされたプラスチック表面上の改変胚性幹細胞培地(MESCM)で培養しました。細胞は70%のコンフルエンスで継代し、免疫蛍光法、リアルタイム定量PCR(qPCR)、およびフローサイトメトリーを用いてLNCを同定しました。一次LNCを単離し、12回以上継代した。P4からP6にかけてのLNCの増殖活性が最も高かった。LNCは、BMMSC(SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR、およびPDGFRβ)よりも高い幹細胞マーカーを発現していました。さらに、P4 LNCはVIM、CD90、CD105、PDGFRβを均一に発現するが、LNCの同定マーカーとして使用できるPan-CKは発現しないことが示された。 フローサイトメトリー解析では、LNCの約95%、97%、92%、および11%がそれぞれCD73、CD90、CD105、およびSCFを発現し、BMMSCでは68%、99%、20%、および3%であることが示されました。LNCの単離と同定のための標準的なプロセスは、LNCを広く使用するための信頼できる実験室基盤を提供する可能性があります。

概要

角膜上皮幹細胞欠損症(LSCD)1、角膜上皮再生症(CES)の発生率は、角膜感染症や外傷によりますます緊急性を増しています。適切に治療しないと、CESDは角膜移植を必要とする失明につながる可能性があります。その結果、CESの再生はより重要になってきています。辺縁ニッチ細胞(LNC)と呼ばれる支持細胞のグループがあり、CES機能に不可欠なサポートを提供します。辺縁間質幹細胞は、Polisettyらによって最初に単離され2、Xieら3によって、辺縁の下皮および辺縁の間質に局在するLNCとして同定されました。LNCは角膜縁を支える幹細胞であり、骨髄由来MSC(BMMSC)の機能を持ち、角膜上皮細胞や角膜間質細胞などに成長を誘導する可能性があります3,4,5,6,7。これまでの研究で、LNCの幹細胞の質は、すでに臨床で広く使用されているBMMSC8よりも原始的であることが示されました。LNCは、特にCESDの治療において、MSCに次ぐ実行可能な選択肢になる可能性さえあります。CESの重要な支持細胞であるLNCは、辺縁部の「ニッチ」構造に由来する幹細胞でもあります。LNCは、成熟角膜上皮細胞(MCEC)のCES9への脱分化に重要な役割を果たす可能性があります。しかし、LNCに関する研究はまだ比較的不十分であり、LNCの用語、単離、精製、同定、および特性に関するコンセンサスはありません。一部の研究者は、LNCを辺縁生検由来間質幹細胞10、辺縁間葉系幹細胞11、辺縁線維芽細胞12、および辺縁間葉系間質細胞13と名付けました。LNCの増殖特性は詳細に記述されておらず、科学的および臨床的応用が有望であり、将来的に最も重要な臨床ツールの1つとなる可能性があるため、LNCの単離、精製、同定、および特性を要約する必要があります。

以前の研究14によると、LNCは主に辺縁の下皮と辺縁の間質に存在します。このプロトコルには、コラゲナーゼAを使用して辺縁組織を処理し、LEPCとLNCからなるクラスターを取得し、0.25%トリプシンEDTA(TE)で単一細胞に消化することが含まれます。次いで、LNCを改変胚性幹細胞培地(MESCM)で選択的に培養し、精製した。この論文で報告されているプロトコルは単純で、ヒトLNCを大量に入手するのに高い効率を持っています。

LNCの単離、培養、同定の詳細な手順は、LNC研究に関心のある科学者のためにビデオに記録されており、必要に応じて便利に繰り返すことができます。

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プロトコル

50歳から60歳までのドナーからの辺縁部組織は、赤十字眼科銀行、同済病院(中国、武漢)から入手しました。この議定書は同済倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。

1. アイソレーション

  1. 中期角膜保存培地から辺縁部組織を採取し、超クリーンな作業台で無菌条件下で操作します。
  2. 角膜の周りの虹彩と内皮を、滅菌した外科用丸い刃でこすり落とし、取り除きます。
  3. 角膜と強膜の両側に1mmを残した外科用ブレードで、辺縁組織を12の等しい大きさに切断します。
  4. 辺縁部組織を3.5cmの培養プレートに移し、1 mLのコラゲナーゼA(2 mg/mL、DF-12培地中)を加えて、すべての組織を浸して消化します。
  5. プレートを37°Cの細胞インキュベーターに入れ、辺縁組織を18時間消化します。
    注意: フォローアップ手順は通常、2日目に実行されます。
  6. 5%基底膜マトリックス(マトリゲル)でコーティングされた6ウェル培養プレートを調製します。
    1. ウェルの底に5%基底膜マトリックス(MESCMに溶解[表1])をコーティングします。
    2. 200 μL と 1 mL チップ、15 mL 遠心チューブ 1 本、6 ウェルプレート 1 枚を滅菌バッグに入れて調製します。
    3. 滅菌したバッグ(チップと遠心チューブを含む)と新しい6ウェルプレートを-20°Cまたは-80°Cの環境で20分間置きます。基底膜マトリックスを冷蔵庫で4°Cで解凍します。
    4. -20°Cまたは-80°Cの環境から予冷したチップ、遠心チューブ、6ウェルプレートを取り出し、ウルトラクリーンワークベンチで以下の操作を行います。
    5. 200 μL チップを使用して 5% 基底膜マトリックス 50 μL を 1 mL MESCM に移し、穏やかかつ均一に混合します。
    6. 予冷した 1 mL チップを使用して、5% 基底膜マトリックス(MESCM に溶解)を 6 ウェル培養プレートの 1 つのウェルに移します。
    7. 6ウェルプレートを静かに水平に振とうし、6ウェル培養プレートを37°Cの細胞インキュベーターに約1時間入れてから、次のステップを実行します。
  7. 18時間消化後、コラゲナーゼA消化された辺縁組織を取り出すと、目に見える小さな塊と未消化の強膜組織のみが残ります。
    注:高倍率顕微鏡では、多くの高密度に充填された細胞(LNCを含む)で構成されるクラスターが明らかになります。
  8. 200 μLのピペットチップを使用して、実体顕微鏡下で未消化の強膜組織からクラスターを剥離します。
  9. クラスターを3.5cmの培養プレートに移し、0.25%TEに浸漬してから、プレートを細胞インキュベーターに15分間入れます。
  10. 1 mL MESCM と 10% ノックアウト血清を添加して細胞消化を停止し、1 mL のピペットチップを使用してクラスターを個々の細胞に再懸濁するために、静かに上下にピペットで移動します。
  11. 細胞懸濁液を 15 mL 遠心チューブに移し、200 x g で 5 分間遠心分離します。
  12. 細胞沈殿を妨げずに上清を慎重に除去し、1 mL MESCM を添加して細胞を再懸濁します。
  13. 1 mLのピペットチップを使用して、下部の細胞沈殿物がMESCMに均一に懸濁するまで2〜3回ピペットを上下させ、20 μLの細胞懸濁液を採取して細胞をカウントします。
  14. 細胞懸濁液を 1 mL のピペットチップで 5% 基底膜マトリックスコーティング 6 ウェルプレートに移し、MESCM の容量を 2.5 mL に増やします。
  15. 6ウェルプレートを水平に静かに振とうし、細胞を均等に分散させます。
  16. 細胞を画像化して記録した後、培養インキュベーターに移します。細胞を毎日観察して写真に撮り、3〜4日ごとに培地を交換します。

2. LNCの識別

  1. 免疫蛍光染色
    1. 1 mL 0.25% TE を使用して 37°C のセルインキュベーターで 5 分間、プレートの底部から LNC を消化します。
    2. 1 mL MESCM(ノックアウト血清を含む)を添加して消化を終了し、細胞懸濁液を 200 x g で 5 分間遠心分離し、上清を注意深く吸引します。
    3. 1 mL の MESCM を加えて、細胞を懸濁液に再懸濁します。80 μLの細胞懸濁液(スライドあたり4×103 細胞)を4枚のスライド(20 μL/スライド)用に調製し、遠心分離システムを使用して、メーカーの指示に従って細胞を顕微鏡スライドに沈着させます。
    4. 4%パラホルムアルデヒドで細胞(ステップ3でスライドに接着)を約10分間固定した後、0.2% Triton X-100 in PBSで15分間スライド上の細胞を透過処理します。
    5. 2%ウシ血清アルブミン(BSA)で細胞を1時間ブロックしてから、一次抗体(Pan-CK [1:1000]、Vim [1:100]、CD90 [1:100]、CD105 [1:200]、SCF [1:100]、PDGFRβ [1:100])と4°Cで一晩インキュベートします。 インキュベーション後、スライドをPBST(PBS + 0.1% Tween 20)で洗浄(5分/回、3回)して、結合していない一次抗体を除去します。
    6. 対応する二次抗体(ロバ抗マウスIgG二次抗体TRITC [1:1000]、ロバ抗ウサギIgG FITC [1:500]、ロバ抗マウスIgG 488 [1:300]、ロバ抗ウサギIgG 594 [1:400])を適切なIgG非特異的IgG抗体と1時間インキュベートします。PBST(5分/洗浄、3回)を使用して、結合していない二次抗体を除去します。
    7. 核を 5 μg/mL DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)で対比染色し、スライドを密封します。
    8. 蛍光顕微鏡(倍率400倍;ばく露時間: 50 ms)。
  2. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)
    1. RNA Isolation Kit を使用して、製造元の指示に従って全 RNA を抽出します。
    2. 大容量cDNA転写キットを使用して、1〜2μgのトータルRNAをcDNAに逆転写します。
    3. cDNA(100 ng)、TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL)、ユニバーサル PCR マスターミックス (10 μL)、ddH 2 O (20 μL まで) を含む 20 μL 溶液中で、逆転写 (42 °C、2分、50 °C、85 分) および qPCR (95 °C、5 分、95 °C、10 秒、40 サイクル) を実行します。
    4. 比較CT法(ΔΔCT)4,9を用いて、相対的な遺伝子発現を調べます。

3. LNCの特性評価

  1. 細胞カウント(血球計算盤)
    1. プレートの底部から0.25%TEを用いて、37°Cの細胞インキュベーターで5分間LNCを消化します。
    2. 1 mL MESCM(ノックアウト血清を含む)を添加して消化を終了し、細胞懸濁液を 200 x g で 5 分間遠心分離し、上清を注意深く吸引します。
    3. 1 mL の MESCM を加えて細胞を再懸濁し、0.5 mL の遠心チューブで 10 μL の細胞懸濁液を採取します。等量の0.4%トリパンブルー染色溶液を加えます。
    4. 染色した細胞懸濁液10 μLを血球計算盤の計数領域に置き、計数用のカバースリップで覆います。
      注:中央の5つの正方形の領域のセル数は「A」として定義されます。1 mLの細胞数は、5A × 104 × 2として計算されます。
  2. フローサイトメトリーによるLNCおよびBMMSCマーカーの検査15
    1. フローサイトメトリー15(2-4 × 106イベント/サンプル、各サンプルから2,000個の細胞が得られ、同時にゲーティングされた合計550,000個の細胞)を使用して、LNCおよびBMMSCにおけるSCF、CD73、CD90、およびCD105の発現を検出します。
    2. キットの説明書に従って、ブロッキングバッファー(3% BSAおよび0.05% Tween-20 in PBS)中で細胞を採取し、染色します。
    3. フローサイトメーターを用いた蛍光活性化セルソーティング(FACS)解析を実施します。本研究では、FACS DivaソフトウェアとFlowJoソフトウェアを使用した。サンプルごとに 10,000 個のイベントを記録し、生細胞をゲートして解析します。

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結果

LNCの成長
LNCは、上記のように、角膜強膜縁組織のコラゲナーゼA(2 mg/mL)消化の消化法に従って正常に単離されました(図1)。以前に報告された研究3と同様に、コラゲナーゼA消化後、イモムシのようなクラスターが顕微鏡下で可視化されました(図2)。紡錘体細胞の割合は、細胞の継代とともに徐々に増加しました。紡錘形の細胞は、コーティングされた基底膜マトリックス3のないプラスチックで培養された対応する細胞とは異なり、コーティングされた5%基底膜マトリックスプレートで増殖する可能性があります。P1からP12までの細胞は均一な増殖速度を示し、細胞倍加時間は2〜7日でした(表2)。本研究では、LNCを13継代、34倍に培養しました(図3)3。LNCは初...

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ディスカッション

角膜の透明性は、通常、角膜間質における小さな線維(直径25〜30 nm)の規則的な配置と分布によって維持され、これは正常な視力に不可欠です16。世界には2億5,300万人の視覚障害者がおり、そのうち3,600万人が17歳の視覚障害者です。世界保健機関(WHO)は、角膜失明を人間の視力に対する最も深刻な危険の1つと見なしており、世界の全失明の5.1%を占めています16。正常なCESの角膜上皮欠損症は、瘢痕を残さずに迅速に治癒することができます18。世界中で1,270万人以上の患者が、中等度から重度の視力低下のために角膜移植を必要としていると推定されています19。角膜移植失敗の30%はCESD20によって引き起こされました。しかし、世界のほとんどの国で角膜提供が不足しているため、最終的に角膜移植を受けることができたのは、角膜失明患者の70人に1人だけでした<...

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開示事項

どの著者も関連する財務情報開示を行っていません。

謝辞

本書の指導をしてくれたWei Wang氏、Lingjuan Xu氏、Rong Liu氏、資料の一部を提供してくれたYongyao Tan氏、Bihui Jin氏、Chunxiu You氏、Li Guigang氏、原稿を書いてくれたGuanyu Su氏、原稿の添削をしてくれたXiao Zhou氏、Yihong Xiong氏、Huatao Xie氏、そして完全な指導をしてくれたGuigang Li氏に感謝します。本研究は、中国国家自然科学基金会(第82070936号、81470606年、81570819年)、湖北省保健家族計画科学研究プロジェクト(第1号)の支援を受けて行われました。WJ2017M073)、同済医院のトランスレーショナルメディカル研究プロジェクトトップ10(No.2016ZHYX20)、武漢市若手医療パイオニア育成プロジェクト(No.2015whzqnyxggrc10)、グローバル人材採用プログラム(G2022154028L)、2022年湖北省国家衛生健康委員会プロジェクト(WJ2021ZH0005)、2022年湖北省財政部主題建設財団(42000022815T000000102)

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールサーモフィッシャーD13065μg/mL
アムホテリシン BシグマV9009191.25 μg/mL
抗 CD73Abcamab2021221:50
ウシ血清アルブミンMERCKA1933-CD105
Proteintech67075-1-Ig1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-Ig1:100
CD90Abcamab3077361:50
セルインキュベーターShanghai LishenK1119K4644HF90(HT)
遠心分離機StatSpin StatSpin CytoFuge12-Collagenase
ARoche101035780012 mg/mL
共焦点顕微鏡Zeiss LSM700-
培養プレートリヤ350035635 mm
DME/F-12 1:1 (1x) cytivaSH30023.0190%
ロバ抗マウスIgG (H + L) 二次抗体ThermoFisherA160161:1000
ロバ抗ウサギIgG (H + L) 二次抗体ThermoFisher315681:1000
FACS Diva sofwareBD BiosciencesTreeStar-Flow
CytometerBD BiosciencesBecton Dickinson LSRII-
蛍光顕微鏡olympuscx31 
ゲンタマイシンΣG191450 μg/mL
血球計算盤MERCKZ359629Bright-Line
大容量cDNA転写キットThermoFisher4374966
倒立位相差顕微鏡 UOPDSZ2000X
ITS(インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム)SigmaI31465 μg/mL インスリン、5 μg/mL トランスフェリン、5 ng/mL 亜セレン酸ナトリウム
KnockOut SR Serum Serum Replacement for ESCs/iPSCsgibco10828-02810%
MatrigelBioCoat356234-Pan-CK
Abcamab77531:1000
パラホルムアルデヒドNoninBioNBS01354.00%
パラホルムアルデヒドMKBioMM-15054%
PDGFRβAbclonalA14441:100
リアルタイム蛍光定量PCR装置Applied BiosystemsStep One Plus-
組換えヒトFGF-ベーシックPeprotech100-18B4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)Peprotech300-0510 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation KitQiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
実体顕微鏡ZEISSSteREO Discovery.V8
滅菌外科用丸刃Careforde29500サイズ 10
TaqMan 遺伝子発現アッセイ ミックスApplied Biosystems4448489
Triton X-100MERCKX1000.20%
トリパンブルーThermoFisher152500610.40%
Trypsin-EDTAGenviewGP31080.25%
Tween 20MERCKP9416-Ultra
Clean BenchLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
ユニバーサル PCR マスターミックスApplied Biosystems4304437
Vim アブカムab925471時100
ビ分

参考文献

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