ブタ大動脈弁をパルスデュプリケーターに取り付けて、その流体力学的特性をテストする方法を紹介します。この方法は、大型動物モデルで使用する前に、実験手順または新しい医療機器を適用した後の流体力学の変化を決定するために使用できます。
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この記事について
サマリー
要約
動物モデルで使用する前に、新しい心臓手術や治験医療機器をテストするための選択肢は限られています。本研究では、ブタ大動脈弁をパルスデュプリケーターに取り付け、その流体力学的特性を評価する方法を提示する。これらの特性は、調査中の手順が実行される前と後に評価され、および/または調査医療機器が適用される前に評価できます。流入セグメントの固定は、左心室流出路に円周方向心筋がないため、いくらか困難を呈する。この方法は、僧帽弁の前尖を使用して流入セグメントを固定し、流入固定具の周囲に左心室の自由壁を縫合することで、この問題に対処します。流出セグメントは、大動脈弓の上側の切開部にフィクスチャーを挿入するだけで固定されます。その結果、標本は組織固定前後で流体力学的特性が大きく異なることがわかった。この発見により、試験では新鮮な試験片を使用することになり、この方法を使用する際には考慮する必要があります。本研究では、この方法を用いて、装着されたブタ大動脈弁に大動脈弁の新尖弁形成術(尾崎法)を行うことにより、弁膜位置で使用するための新しい心臓内パッチ材料を試験しました。これらのバルブは、ネイティブバルブと比較して流体力学的特性の変化を評価するために、手順の前後にテストされました。ここでは、実験的な大動脈弁手順の流体力学的テストのためのプラットフォームを報告します ネイティブ弁との比較、および調査中の手順に使用されるさまざまなデバイスと技術間の比較を可能にします。
概要
大動脈弁疾患、特に大動脈弁狭窄症は公衆衛生上の大きな負担であり、世界中で900万人が罹患しています1。この疾患に対処するための戦略は現在進化しており、大動脈弁修復術や大動脈弁置換術などがあります。特に小児集団では、現在利用可能なプロテーゼは構造弁変性(SVD)を起こしやすく、成長耐性がなく、患者の成長に合わせて再置換のための再手術が必要になるため、弁を交換するのではなく修復する大きなインセンティブがあります。罹患した大動脈弁(AV)を生来の肺動脈弁(PV)に置き換えるロス手術でさえ、肺の位置にプロテーゼまたは移植片を必要としますが、これもSVDの対象となり、多くの場合、成長耐性が制限されます2。大動脈弁疾患に対する新しいアプローチが開発されており、大動物モデルに適用する前に、生物学的に関連性のある状況でテストする必要があります。
私たちは、新しい医療機器の治験手順または適用の前後の弁の機能に関する洞察を提供できるブタAVをテストする方法を開発しました。市販のパルス複写機にブタAVを搭載することで、逆流率(RF)、有効オリフィス面積(EOA)、平均陽圧差(PPD)など、人工弁の調査と最終的な承認に一般的に使用される流体力学的特性を比較することができます3,4.この介入は、大型動物モデルで使用する前に、生物学的に関連する状況で微調整できるため、ヒトで使用できる手順やプロテーゼを作成するために必要な動物の数を制限することができます。この実験に用いた心臓は、地元の屠殺場や他の実験で出た廃組織から採取することができるので、この実験のためだけに動物を生贄に捧げる必要はない。
私たちの研究では、この方法を使用して、バルブの修理と交換のための新しいパッチ材料を開発しました。ブタAVに大動脈弁新尖化術(尾崎法5,6,7)を行い、施術前後にパルスデュプリケーターで試験することにより、様々なパッチ材料の流体力学的機能を検証した。これにより、流体力学的性能に基づいて材料を微調整することができました。したがって、この方法は、大型動物モデルに適用する前にAVで使用するための実験手順と新しい医療機器の流体力学的試験のためのプラットフォームを提供します。
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プロトコル
すべての研究は、動物の世話に関する施設のガイドラインに準拠して行われました。
1. 実験の検討と準備
- AVを介した心拍出量のシミュレーションに適したパルスデュプリケーター(PD)を利用します。PDは、生物学的物質を収容でき、洗浄できる必要があります。
- AV のテストに適した PD 設定を利用します: 70 mL の変位量と毎分 70 拍数 (5 L/分の心拍出量)、収縮期の心周期の 35%、平均 100 mmHg 経弁圧勾配、120 最大圧力勾配、および 80 最小圧力勾配。
- 室温(RT)の生理食塩水(0.9%NaCl)を流体媒体として使用します。
- PDでテストするためにブタAVを取り付けるのに適した固定具を(3Dプリントまたは同様の方法を使用して)見つけるか作成します。
- 次の仕様のパルスデュプリケーターに付属するフィクスチャをモデルにしたフィクスチャを利用します:フィクスチャの内径が調査対象のAVの直径と類似していること、取り付け長さが2cm以上であること、使用可能な取り付け幅が4cm以上であることを確認してください(図1)。
- 固定具の端にゴム製のOリングをガスケットとして使用します。
- 軟骨切除術後に心臓標本を採取する(図2A)。
- 屠殺場のブタの心臓標本、または他の点では健康で、心臓に影響を与える実験プロトコルの一部ではない動物の老廃組織を使用します。
- 軟骨切除術後に標本を取得するか、上大静脈、下大静脈、主肺動脈(PA)、すべての肺静脈、および大動脈弓の遠位側の大動脈の離断を含む死後軟肉切除術を実施します。
注:生後6時間未満の新鮮な検体、または1%抗生物質溶液(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を含む滅菌生理食塩水で4 °C冷蔵庫で最大7日間保管された新鮮な検体を、この実験に使用する必要があります。ホルマリンまたはグルタルアルデヒドで固定された組織は、剛性の増加により流体力学的結果の変化を引き起こします。
図1:ブタ大動脈弁をパルスデュプリケーターに取り付けるためのカスタム3Dプリントされた器具。 プロトコルに記載されているように、アタッチメントの長さは少なくとも2 cm、使用可能なアタッチメント幅は少なくとも4 cmである必要があります 。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.右側構造の切除
- 心室組織が見えるまで、メッツェンバウムのハサミで大動脈からPAを解剖します(図2B)。
- 大動脈洞からの起点にある両方の冠状動脈を絹の結束で解剖し、結紮し、副鼻腔を狭くしないように注意します。
- 絹のタイの遠位の冠状動脈を切除します。
- メッツェンバウムのハサミを使用して、肺動脈弁の基部にある大動脈とPAの間の右心室(RV)を切開します(図2C)。
- 前方から始めて、心室中隔に沿って円周方向に切開を続け、RV自由壁を取り除きます(図2D、E)。
- 心房間中隔に沿って三尖弁輪を後方に切開し、右心房組織をすべて切除します(図2F)。
図2:軟肉切除標本と右側構造の切除 。 (A)軟肉切除標本。(B)心室組織が見えるまで大動脈から解剖された主肺動脈。(C)肺動脈弁の基部にある右心室(RV)を切開する。(D)心室中隔に沿って前方に切開を続けます。(E)心室中隔に沿って円周方向に切開を続けることにより、RVフリーの壁を除去する。(F)右側構造を取り除いた試験片。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
3.PDフィクスチャーによるカニューレ挿入のための左心室流出路(LVOT)の準備
- メッツェンバウムのハサミを使用して、大動脈と平行な右肺静脈口から左心房(LA)を切開します(図3A)。
注:限られた変動性が存在しますが、ブタ肺静脈の解剖学的構造は、通常、LA8に入る2つの肺静脈口で終了します。 - 僧帽弁の前外側交連(MV)に向かって切開を続け、大動脈側に少なくとも3mmの心房組織のカフを残します。
- 大動脈とMV輪の3mmの心房組織のカフを円周方向に維持して、余分なLA組織をトリミングします(図3B)。
- MVの前外側交連を通して左心室(LV)に切開を伸ばし、前外側乳頭筋を温存するように注意します(図3C)。
- 脊索腱を前外側乳頭筋から後MV弁尖に分割し、前MV弁尖への付着物を保存します。
- 心臓の頂点まで切開を続けます。
- 乳頭筋の下の余分なLV組織をトリミングし、両方の乳頭筋を温存します(図3D)。
図3:パルスデュプリケーターフィクスチャーによるカニューレ挿入のための左心室流出路の準備。 (A)右肺静脈の口から左心房(LA)を切開する。(B)過剰なLA組織をトリミングし、大動脈に少なくとも3mmの心房組織のカフを維持し、僧帽弁輪を円周方向に維持します。(C)僧帽弁の前外側交連を介して左心室(LV)に切開を伸ばします。(D)乳頭筋の下の余分なLV組織を除去する。画像の右上隅にハサミが表示されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
4. PDフィクスチャーによるカニューレ挿入のための大動脈の準備
- 大動脈から余分なリンパ管、結合管、または肺動脈組織を切り取ります(図4A)。
- メッツェンバウムのハサミを使用して、下行大動脈から左鎖骨下動脈までの大動脈弓の上面を切開します(図4B)。
- 左鎖骨下動脈から腕頭幹までの大動脈弓の上側の切開を続けます(図4C、D)。
注:ブタ大動脈弓の遠位から近位への枝には、左鎖骨下動脈と腕頭幹があり、右鎖骨下動脈、右頸動脈、左頸動脈9を生じさせる。
図4:パルスデュプリケーターフィクスチャーによるカニューレ挿入のための大動脈の準備。 (A)余分な組織を切除した大動脈弓。ブタ大動脈弓、腕頭幹、および左鎖骨下動脈の2つの弓血管に注目してください。(B)下行大動脈から左鎖骨下動脈までの大動脈弓の上側に沿って切開を開始します。(C)左鎖骨下動脈から腕頭幹までの大動脈弓の上側に沿って切開を続けます。(D)大動脈弓切開が完了した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
5. PDフィクスチャによるLVOTのカニューレ挿入
- LVOTでのフィクスチャーの位置をテストし、余分なLV組織をトリミングします。
- フィクスチャをMVの前部リーフレットの下のLVOTに挿入します。
- LVフリーの壁を器具に巻き付けます。
- 余分なLV組織をトリミングして、フィクスチャをしっかりと包み込みます。
- LV自由壁の厚さの半分を心室中隔から取り除き、縫合線の完全性を維持するために、自由縁に少なくとも1cmの心外膜を維持します(図5A)。
- LVフリーウォールラップの上隅から1cmの組織を切り取ります(図5A)。
- LV切開部の1cm後ろに支持ロッド取り付け穴があるLVOTに固定具を配置します(図5B)。
- フィクスチャをLVOTに挿入しすぎて、AVアニュラスが拡張しないように注意してください。
- リーフレットの脊索腱の間に配置された1つまたは2つの6インチの結束バンドを使用して、MVの前リーフレットを固定具に固定します(図5C)。
- フィクスチャーの周りのLVフリー壁を縫合します(図5D)。
- まず、大動脈のLA組織のカフを、テーパーポイント針による簡単なランニング縫合糸を使用してMV輪に縫合します。
- LV組織を引き裂かずに、LVにランニングステッチを続けます。
図5:パルスデュプリケーターフィクスチャによる左心室流出路のカニューレ挿入。 (A)LV自由壁の半分の厚さを除去し、自由縁に1cmの心外膜を維持しました。点線は、LVフリーウォールラップの上隅から取り外す1cmの領域を示しています。(B)LV自由壁切開の1cm後方に位置する支持ロッド取り付け穴。(C)MVの前部弁尖を近位固定具に固定する結束バンド。(D)固定具の周囲に縫合されたLVフリーウォール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
6.PDフィクスチャーによる大動脈のカニューレ挿入とPD検査の最終準備
- PDテストの結果の解釈を支援するために、Hegarダイレーターを使用してAVの直径を測定します。
- 大動脈をつかんで標本をテーブルから持ち上げて、大動脈の中立位置を特定します(図6A)。
- PDフィクスチャーを大動脈に挿入し、ロッド取り付け穴を大動脈の中立位置に合わせるように注意します。
- 支持棒を挿入して試験片の長さを確認します。
- 1つまたは2つの6インチの結束バンドを使用してPDフィクスチャを大動脈に固定します(図6B)。
- 1つまたは2つの8インチの結束バンドを使用して、PDフィクスチャの周りにLVOTを固定します。
- PDセットに付属のネジを使用して、サポートロッドを所定の位置に固定します。
- 試験片をPDに置き、試験を開始します(図6C、ビデオ1、およびビデオ2)。
- 必要に応じて漏れを縫合します。
図6:大動脈のカニューレ挿入とパルスデュプリケーターでの検査。 (A)大動脈で標本をテーブルから持ち上げて、大動脈の中立位置を特定します。(B)結束バンドで大動脈に固定された遠位固定具。(C)流体力学試験用のパルスデュプリケーターに取り付けられた試験片。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
7.実験手順を実行します
注:前述の5,6,7の尾崎手順などの実験手順を実行し、PDテストを繰り返します。
- 処置中に組織が乾燥した場合は、結束バンドを締め、必要に応じて縫合線を補強します。
8.検体の長期保管(必要に応じて)
- 検体をホルマリン10%に168時間(1週間)入れます10,11。
- 組織固定後、検体を脱イオン水で洗浄し、エタノール70%に入れて長期保存します。
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結果
パルスデュプリケーターから収集される代表的なデータには、逆流率(RF)、有効オリフィス面積(EOA)、および平均陽圧差(PPD)が含まれます。特にRFとEOAは、人工弁のISO規格(ISO 5840)で使用されており、補綴弁製品が調査中の場合は収集が重要になります。PPDは、弁を開くのに必要な圧力に関する情報を提供し、補綴弁の交換について議論する際に一般的に参照されます3,4。この実験で利用されたHDTi-6000パルスデュプリケーター(BDC Laboratories、Wheat Ridge、CO)は、必要に応じて、閉鎖量、漏れ量、総逆流量、総順方向流量、収縮期持続時間、最大陽圧差、平均順方向流量など、他の値を収集できます。
正しく実施された実験における天然大動脈弁(n = 20)の流体力学的試験(RF、EOA、およびPPD)の値を表1に示します。得られた値は、平均RFが5.74%12
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ディスカッション
ここで紹介する方法は、実験手順や新しい医療機器の効果を調べるために、AVの流体力学的試験のためのプラットフォームを提供します。ネイティブ大動脈弁をパルスデュプリケーターマシンに取り付けることで、新しい人工弁(ISO 5840)の調査と承認に使用されるすべての流体力学的パラメータに対する実験手順の効果を判断することができます。これにより、大型動物モデルで使用する前に手順やプロテーゼを微調整することができます。
流入セグメントの固定は、左心室流出路に円周方向心筋がないため、いくらか困難を呈する。この方法は、僧帽弁の前尖を使用して流入セグメントを固定し、流入固定具の周りの左心室自由壁を縫合し、心室カフに追加の結束バンドを適用することで、その問題に対処します。他の同様の方法は、ポリエチレンテレフタレート(ダクロン)チューブをLVOT15,16に縫合するか、またはAV環17,18の...
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開示事項
著者らは、開示すべき関連する金銭的利益相反を有していない。
謝辞
Julie Van Hassel氏、Mohamed Diane氏、Panpan Chen氏を含むGordana Vunjak-Novakovic博士の研究室には、実験で得られた心尿組織の使用を許可していただき、感謝いたします。この研究は、ニュージャージー州バトラーの先天性心疾患連合とメリーランド州ベセスダの国立衛生研究所(5T32HL007854-27)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3Dプリンター | Ultimaker | Ultimaker S5 | 流体力学試験用のカスタムフィクスチャの印刷に使用 |
| Crile-Wood ニードルドライバー | エメラルドインスツルメンツ | 2.0638.15 | 心室の縫合に使用 |
| Debakey鉗子 | Jarit | 320-110 | 解剖およびサンプル調製に使用(アシスタントと一緒に作業する場合は複数使用できます) |
| エタノール200プルーフ | Decon Labs Inc. | DSP-MD.43 | 固定組織保存に使用 |
| ホルマリン 10% | Epredia | 5701 | 組織固定に使用 |
| ジェラルド鉗子 | Jarit | 285-126 | 解剖およびサンプル調製に使用 |
| ガラス瓶 | QAPPDA | B07QCP54Z3 | 組織保存に使用 |
| グルタルアルデヒド 25% | 電子顕微鏡科学 | 16400 | 組織に使用固定 |
| HEPES 1 M 緩衝液 | フィッシャー | BP299-100 | グルタルアルデヒド 0.6% |
| メイヨー はさみ | Jarit | 099-200 | 縫合糸の切断に使用 |
| Metzenbaum はさみ | Jarit | 099-262 | 解剖およびサンプル調製に使用 |
| Oリング | スターリングシール &サプライ株式会社 | AS568-117 | 3Dプリントされたフィクスチャの端のガスケットとして使用 |
| ポリ乳酸樹脂 | Ultimaker | 1609 | 3Dプリントフィクスチャに使用 |
| ポリプロプレン縫合糸 | Covidien | VP-762-X | 心室、テーパー針の縫合に使用 |
| パルスデュプリケーター | BDCラボラトリ | HDTi-6000 | 流体力学試験に使用 |
| シルクタイ | Covidien | S-193 | 冠動脈の結紮に使用 |
| 扁桃腺クランプ | Aesculap | BH957R | 冠動脈解離に使用 |
| 結束バンド (6インチ) | Advanced Cable Ties, Inc. | AL-06-18-9-C | サンプルを固定具に固定するために使用、長さ 157.14 mm (6 インチ)、幅 2.5 mm |
| 結束バンド (8 インチ) | GTSE | GTSE-20025B.1000 | サンプルを固定具に固定するために使用、長さ 203 mm (8 インチ)、幅 2.5 mm |
参考文献
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