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方法論記事

がんの患者由来オルガノイドモデルにおける薬物反応のための多重化生細胞イメージング(英語)

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DOI:

10.3791/66072

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2024年1月5日

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1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

患者由来の腫瘍オルガノイドは、基礎研究およびトランスレーショナル研究のための高度なモデルシステムです。この手法では、異なるオルガノイド表現型の同時速度論的評価のためのマルチプレックス蛍光生細胞イメージングの使用について詳しく説明します。

要約

がんの患者由来オルガノイド(PDO)モデルは、がん細胞株と比較してヒトの疾患をよりよく再現する多機能研究システムです。PDOモデルは、細胞外基底膜抽出物(BME)で患者の腫瘍細胞を培養し、それらを3次元ドームとしてプレーティングすることによって生成できます。しかし、単層培養における表現型アッセイ用に最適化された市販の試薬は、多くの場合、BMEに適合しません。本稿では、PDOモデルをプレーティングし、自動生細胞イメージングシステムを用いて薬物効果を評価する方法について説明する。さらに、速度論的測定と互換性のある蛍光色素を塗布して、細胞の健康状態とアポトーシスを同時に定量化します。イメージ キャプチャは、数日間にわたって一定の時間間隔で行われるようにカスタマイズできます。ユーザーは、個々のZ平面画像または複数の焦点面からの連続画像のZ投影で薬物効果を分析できます。 マスキングを使用して、PDO番号、面積、蛍光強度など、関心のある特定のパラメータが計算されます。細胞毒性物質が細胞の健康、アポトーシス、生存率に及ぼす影響を示す概念実証データを提供しています。この自動キネティックイメージングプラットフォームは、がんのPDOモデルにおける多様な治療効果を理解するために、他の表現型読み出しに拡張することができます。

概要

患者由来腫瘍オルガノイド(PDO)は、がんの発生と治療反応を研究するための堅牢なモデルシステムとして急速に浮上しています。PDOは、原発腫瘍の複雑なゲノムプロファイルと構造を再現する3次元(3D)細胞培養システムです1,2。不死化がん細胞株の従来の2次元(2D)培養とは異なり、PDOは腫瘍内の不均一性を捕捉して維持するため3,4、機構研究とトランスレーショナル研究の両方にとって貴重なツールとなります。PDOはますます普及しているモデルシステムになりつつありますが、PDO培養に適合する細胞効果の市販の試薬や分析法は限られています。

治療反応の微妙な変化を解析する頑健な方法がないため、臨床翻訳が妨げられています。3D培養におけるゴールドスタンダードの細胞健康試薬であるCellTiter-Glo 3Dは、細胞生存率の決定要因としてATPレベルを利用しています5,6。この試薬はエンドポイントアッセイに有用ですが、いくつかの注意点があり、最も顕著なのは、アッセイの完了後にサンプルを他の目的に使用できないことです。

生細胞イメージングは、蛍光試薬と組み合わせることで、アポトーシス7,8,9や細胞毒性10など、PDOモデル内のさまざまな細胞の健康状態を定量化できる高度な速度論顕微鏡です。実際、生細胞イメージングは、2Dプラットフォームにおける化合物のハイスループットスクリーニングに不可欠である11,12。Incucyteなどのシステムにより、この技術は手頃な価格になり、さまざまな環境で研究グループが利用できるようになりました。しかし、これらのシステムを3D培養の分析に応用することは、まだ初期段階にあります。

本稿では、マルチプレックス生細胞イメージングを用いて、がんのPDOモデルにおける薬物反応を評価する方法について述べる(図1)。明視野画像の解析により、PDOのサイズと形態の変化を動力学的に監視できます。さらに、アポトーシス用のAnnexin V Red Dyeや細胞毒性用のCytotox Green Dyeなどの蛍光試薬を使用して、細胞プロセスを経時的に同時に定量することができます。ここで紹介する方法は、Cytation 5生細胞イメージングシステム用に最適化されていますが、このプロトコルは、異なる生細胞イメージングプラットフォームに適合させることができます。

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プロトコル

ヒト腫瘍標本を用いた研究は、アイオワ大学治験審査委員会(IRB)のプロトコル#201809807によって審査および承認され、1964年のヘルシンキ宣言およびその後の改訂で定められた倫理基準に従って実施された。インフォームドコンセントは、研究に参加したすべての被験者から得られました。選択基準には、がんの診断と腫瘍標本の利用可能性が含まれます。

1. 無傷のPDOを96ウェルプレートにめっきする

  1. 試薬を調製します。
    1. 96ウェルプレートを37°Cで一晩予熱し、BMEを4°Cで一晩解凍します。
    2. 目的のがん種を培養するために最適化された完全なオルガノイド培養培地を調製します。本明細書に示す実験に用いる具体的な培地は、 付表1に記載する。
      注:培地成分は、腫瘍の種類によって異なる場合に変更する必要がある場合があります。例えば、オルガノイド培養培地には、婦人科腫瘍に対する100nMのエストラジオールが添加されている13。調製した培地は4°Cで1ヶ月間安定です。長期保存の場合は、培地を50 mLチューブに分注し、-20°Cで保存します。
  2. オルガノイド培養培地のアリコートを4°Cと37°Cで2つに分けて調製します。 例えば、60ウェルを96ウェルプレートに播種する場合は、6 mLの温かいオルガノイド培養培地と150 μLの氷冷オルガノイド培養培地を使用します。
  3. オルガノイド洗浄バッファーの調製:1x PBSに10 mM HEPES、1x Glutamax、5 mM EDTA、および10 μM Y-27632を添加します。4°Cで保存
  4. 24ウェルプレートで培養したPDOを回収します。特に断りのない限り、すべてのステップを氷上または4°Cで実行してください。
    1. 真空ラインシステムを使用して各ウェルから培地を吸引します。
    2. 500 μLの氷冷オルガノイド洗浄バッファーを加え、1000 μLのピペッターを使用して2〜3回静かにピペットします。プレートを氷上で10分間インキュベートします。
    3. 各ウェルの内容物を50 mLのコニカルチューブに移します。すべてのPDOが懸濁状態にあることを確認するには、さらに300 μLのオルガノイド洗浄バッファーで各ウェルをすすぎ、50 mLのコニカルチューブに移します。4°C、350 x g で5分間遠心分離します
    4. 真空ラインシステムを使用してBME/オルガノイドペレットから上清を吸引し、チューブ内に~5 mLを残します。20 mLのオルガノイド洗浄バッファーを加え、10 mLの血清ピペットを使用してペレットを静かに再懸濁します。氷上で10分間インキュベートします。
    5. 4°C、350 x g で5分間遠心分離します。 PDOペレットを破壊しないように注意しながら、真空ラインシステムで上清を吸引します。
  5. 96ウェルプレートへのPDOのプレーティング:特に断りのない限り、すべてのステップを氷上で実行してください。
    1. PDOペレットを適量の氷冷オルガノイド培養培地に再懸濁し、PDO懸濁液を作成します。PDO懸濁液を氷冷した1.5 mL微量遠心チューブに移します。
      注:オルガノイド培養培地の量を計算するには、PDOがオルガノイド培養培地とBMEの比率が1:1の比率で5 μLドームに播種されることを考慮して、96ウェルプレートに播種するウェルの数を決定します。例えば、1枚の96ウェルプレートをめっきし、内側の60ウェルのみを使用する場合、必要なPDO懸濁液の総量は300μLになります:150μLのオルガノイド培養培地と150μLのBMEです。BMEの異なる割合で最適な増殖を示すモデルの場合、このステップでBME:培地の比率を変更することができますが、特定のモデルごとにすべてのアッセイで比率を標準化することが重要です。ピペッティングエラーを考慮するには、各成分に10%の量を追加します。
    2. PDO の数を数えます。
      1. 2.5 μL の PDO 懸濁液を氷冷した 1.5 mL 微量遠心チューブに移し、2.5 μL の BME と混合します。5 μLの混合物を清潔なガラス顕微鏡スライドに移します。スライドをカバースリップしないでください。混合物はドーム状に固まります。
      2. 明視野顕微鏡を使用して4倍で可視化します。5 μLの混合物中のPDOの数を数えます。目標は、5μLドームあたり約25〜50個のPDOを持つことです。
        注:試験混合物で所望の密度が得られない場合は、オルガノイド培養培地をさらに添加するか、PDO懸濁液を遠心分離し、PDOペレットを少量の氷冷オルガノイド培養培地に再懸濁することにより、PDO懸濁液の最終容量を調整します。このステップでPDOサスペンションがどのように変更されるかに関係なく、ステップ1.5.3のBMEの最終的な比率:PDOサスペンション。1:1 にする必要があります。
    3. ボアチップの広い200 μLピペッターを使用して、PDO懸濁液を同量のBMEと慎重に混合し、オルガノイド培養培地とBMEの比率が1:1になるようにします。ドームの完全性を損なう気泡は避けてください。
    4. 20 μL のピペッターを使用して、予熱した 96 ウェルプレートの各ウェルの中央に 5 μL のドームを播種し、内側の 60 ウェルのみに播種します。PDOを均等に分配するために、1.5 mLチューブの内容物をワイドボアチップの200 μLピペッターで定期的にピペッティングします。
    5. すべてのウェルが播種されたら、プレートに蓋をして静かに反転させます。倒さしたプレートを組織培養インキュベーターで37°Cで20分間インキュベートし、ドームを固化させます。
      注:プレートを反転させることで、BME/オルガノイド培養培地ドームが3D構造を保持し、PDO形成に十分なスペースを確保することができます。
    6. 蓋を立てた状態でプレートをひっくり返し、37°Cで5分間インキュベートします。

2. マルチプレックス化のための処理と蛍光色素の添加

  1. BMEドームが96ウェルプレートで固化している間に、蛍光生細胞イメージング試薬の希釈液を調製します。アネキシンV赤色素およびサイトトックス緑色色素をマルチプレックス化するための特異的パラメータを本明細書に記載する。
  2. 蛍光試薬の調製(-1日目):各ウェルを100 μLの色素投与培地で処理すると仮定して、処理するウェルの数に基づいてオルガノイド培養培地の適切な量を計算します。予め温めたオルガノイド培養培地で色素を所望の濃度に希釈します。
    注:必要な培地の総量は、実験によって異なります。ピペッティングエラーを考慮して、最終容量に10%を追加します。例えば、96ウェルプレートの内側の60ウェルを処理するには、6.6 mLの色素を添加した培地を調製します(表1)。
  3. 各ウェルを100 μLの2x色素投与オルガノイド培養培地で処理します。200 μL の滅菌済み 1x PBS をプレートの外側の空のウェルに加えます。37°Cで一晩インキュベートします。
    注:ペリフェラルウェル内のPBSは、内側ウェルからの培地の蒸発を減少させます。
  4. 薬剤/治療薬の追加(0日目):予熱したオルガノイド培養培地で、ウェルあたり100μLの容量で2倍の濃度で薬剤を調製します。
    注:DMSOは、高濃度の細胞に対して毒性を持つ可能性があります。この研究で実施された実験では、0.1%DMSOの濃度を超えていません。薬物に加えて、一部の蛍光試薬はDMSO溶液として配布されています。このような試薬を扱う際には、DMSOの総濃度を考慮することが重要です。
  5. 100 μLの2x色素添加培地を各ウェルに加えます。泡の作成は避けてください。

3. イメージングパラメータの設定

  1. プレートをCytation 5に入れます。開ける Gen5 ソフトウェア。[New Task > Imager Manual Mode] をクリックします。[今すぐキャプチャ]を選択し、次の設定を入力します。 フィルター(マイクロプレートを選択)。マイクロプレートフォーマット(ウェル数を選択)。と容器タイプ(プレートタイプを選択)。[Use Lid] と [Use slower carrier speed] をクリックします。[OK] をクリックします。
    注:容器の種類:ソフトウェアは、プラスチックのプレートの種類と厚さごとに対物レンズからプレートの底部までの特定の距離に校正されるため、プレートに関する情報を選択するときはできるだけ具体的にしてください。
    Slower Carrier Speed: プレートの積み下ろし時にドームが乱れないようにするには、このボックスを選択します。
  2. BMEドーム全体をイメージ化するZスタックを作成します。
    1. 表示するウェルを選択します(左パネル、ヒストグラムの下)。
    2. 明視野チャンネル(左パネル、上)を選択します。[自動公開] をクリックし、必要に応じて [設定] を調整します。
    3. Zスタックの下部と上部を設定します:[ イメージングモード ]タブ(左側のパネル、中央)を展開します。[ Z-Stack ] チェックボックスをオンにします。コース調整矢印(左パネル、中央)を使用して、すべてのPDOがピントが合わず、ぼやけるまで下方向の調整をクリックします。これをZスタックの一番下に設定します。コース調整矢印を使用して反対方向に繰り返し、Zスタックの上部を設定します。
    4. Zスタックの設定が他の対象ウェルに適していることを確認するには、別のウェル(左パネル、ヒストグラムの下)を選択し、Zスタックの上部と下部を視覚化します。
    5. 焦点位置を手動で入力するには、微調整の横にある 3 つのドット (左パネル、上) をクリックします。ウィンドウが開きます。一番上のZスタック値を入力します(左側のパネル中央の [イメージングモード]の下にあります)。一番下のZスタック値についても繰り返します。必要に応じて調整し、手順3.2.3を繰り返して目的のZ範囲をキャプチャします。調整が必要な場合は、別のウェルを選択して設定を確認します。
  3. 蛍光チャンネルの露出設定を行います。設定は、2つの蛍光チャンネル(GFPおよびTRITC)について記述されています。蛍光チャンネルの具体的な数は、実験と、生細胞イメージングシステムにどの蛍光キューブが設置されているかによって異なります。
    注:実験の最後に信号強度が大幅に高くなると予想される場合は、テスト実験を実行して、実験の最後に最適な露出設定を決定し、初期パラメータの設定時に適用できるようにすることを検討する必要があります。
    1. [ イメージングモード ]タブ(左側のパネル、中央)を展開し、[ イメージングの編集]ステップを開きます。ポップアップウィンドウが表示されます。
    2. [チャネル] で、目的のチャネル数のバブルをクリックします。明視野用に1つのチャンネルを指定し、蛍光チャンネルごとに追加のチャンネルを指定します。この例では、チャンネル 1 = 明視野。チャネル 2 = GFP;チャネル 3 = TRITC。ドロップダウンのカラーメニューを使用して、各チャンネルに適切な設定を選択します。[OK] をクリックして編集ウィンドウを閉じます。
    3. 各蛍光チャンネルを設定します。
      1. チャンネルをGFPに切り替えます(左パネル、上)。
      2. [ 自動露出](左パネル上)をクリックします。[ 露出 ]タブ(左パネル、中央)を展開し、露出設定を調整してバックグラウンド信号を最小限に抑えます。
      3. 手順3.3.3.3-3.3.3.6に従って、露出設定を [画像モード ]タブにコピーします。
      4. [Edit Imaging Step]ボックスの横にある[Copy]アイコンをクリックします。[イメージングステップの編集]をクリックすると、別のウィンドウが開きます。
      5. GFP チャンネルで、露出ラインのクリップボード アイコンをクリックして、イルミネーション、積分時間、カメラ ゲインの設定をチャンネルに追加します。
      6. TRITCチャネルに対して手順3.3.3.4-3.3.3.5を繰り返します。「 OK 」をクリックしてウィンドウを閉じます。
  4. イメージの前処理と Z 投影のステップを設定して、イメージの前処理を自動化します。
    1. カメラアイコン(左パネル、下隅)をクリックします。新しいウィンドウが開きます。
    2. [処理ステップの追加](左側のパネル、下部)で、[画像の前処理]をクリックします。新しいウィンドウが開きます。
    3. 「明視野」タブで、「画像前処理を適用」の選択を解除します。
    4. 「 蛍光チャンネル 」タブごとに、「 画像前処理を適用 」が選択されていることを確認します。「 チャンネル 1 と同じオプションを使用 」の選択を解除し、「 OK」をクリックします。ウィンドウが閉じます。
    5. [ Add Processing Step] で [Z Projection] をクリックします。新しいウィンドウが開きます。必要に応じて、スライス範囲を調整します(たとえば、Z範囲を狭くします)。[ OK] を選択してウィンドウを閉じます。
  5. プロトコルを作成します。
    1. ツールバーの 「画像セット 」をクリックします。プルダウン メニューで、[ この画像セットから実験を作成] をクリックします。 イメージングウィンドウ が閉じ、 手順ウィンドウ が開きます。
      注: イメージャー手動モードで 選択したパラメータは、自動的に新しいウィンドウにロードされ、実験的なプロトコルを作成できます。
    2. 温度と勾配を設定する: 「アクション」見出し(左)の下にある「温度を設定」をクリックします。新しいウィンドウが開きます。Incubator Onを選択し、Temperature(温度)に希望の温度を手動で入力します。次に、[グラデーション]に手動で「1」と入力します。[OK] を選択してウィンドウを閉じます。
      注意: 1°Cのグラジエントを作成すると、プレートの蓋に結露が発生するのを防ぐことができます。
    3. イメージにウェルを指定します。
      1. [説明]の下の[画像]ステップをダブルクリックします。フルプレート(右隅、上)をクリックします。これにより、[プレート レイアウト] ウィンドウが開きます。
      2. カーソルを使用して目的の井戸をハイライトします。[ OK] をクリックします。必要に応じて、[ オートフォーカスビニング ]ボックスと [キャプチャビニング ]ボックスをオンにします。「 OK 」をクリックしてウィンドウを閉じます。
        注意: ビニングには、上記の手順3.3.3.2で説明したように、露出調整が必要です。この機能が使用される可能性のある特定のシナリオについては、「ディスカッション」セクションを参照してください。
    4. キネティックイメージングの間隔を設定します。
      1. [その他]見出し(左)の下にある[オプション]をクリックします。Discontinuous Kinetic Procedureにチェックを入れます。
      2. [推定合計時間] で、テストの実行時間を入力します(例: 5 日間)。推定間隔(Estimated Interval)で、プレートを画像化する間隔(例:6時間ごと)を入力します。
      3. 各分析後にPause(一時停止)をクリックし、プレートがインキュベーターに移される時間を確保します。[OK] を選択してウィンドウを閉じます。
    5. データ削減手順を更新します。
      1. 「 OK 」をクリックして「 プロシージャー」ウィンドウを閉じます。タブが開き、データ削減手順を更新できます。[ はい] を選択します。 [画像の前処理] をダブルクリックします。さまざまなチャネルをクリックして設定を確認し、[ OK]をクリックします。
      2. Z Projectionをダブルクリックします。さまざまなチャネルをクリックして、設定を確認します。[OK] をクリックします。次に、もう一度 [OK] をクリックして [データ削減] ウィンドウを閉じます。
    6. プレート レイアウトを書式設定します。
      1. プレート レイアウト ウィザードを開き、手順 3.6.2-3.6.3 に従って井戸タイプを指定します。
      2. ツールバーの[ プレート レイアウト ]アイコン(左隅、上部)をクリックして、 プレート レイアウト ウィザードを開きます。
      3. 実験で使用した井戸タイプの横にあるチェックボックスをオンにします。 Assay Controls(アッセイコントロール)で、矢印を使用して異なるコントロールタイプの数を入力します。 Next をクリックして、 Assay Control #1 ウィンドウを開きます。
      4. ステップ3.6.5-3.6.8に従ってアッセイコントロールウェル条件を設定します。
      5. Assay Control #1 ウィンドウで、Plate Layout ID ボックスにコントロールラベルを入力します。必要に応じて、横のボックスにフルネームを入力します。矢印を使用して、それぞれの制御条件の反復数を選択します。
      6. コントロール内で複数の濃度または希釈系列を使用する場合は、 希釈/濃度の定義 をクリックし、ドロップダウンメニューを使用して タイプを選択します。各濃度/希釈率の値を表に入力します。
        注意: 自動機能は、濃度が一定の増分で変化する場合に使用できます。
      7. ツールバーの「 色 」タブを選択します。ドロップダウンメニューで、コントロールするテキストの色と背景色を選択します。「 次へ」をクリックします。
      8. 必要に応じて、追加のコントロールで繰り返します。
      9. 3.6.10-3.6.12に従ってサンプルウェル条件を設定します。
      10. [サンプル設定]ページで、サンプルのIDプレフィックス(例:SPL)を入力します。矢印を使用して反復数を選択します。処理濃度の異なるサンプルを使用する場合は、[タイプ]ドロップダウンメニューで[濃度]または[希釈]を選択します。表に希釈率/濃度を入力し、[単位]ボックスに単位を入力します。
      11. ツールバーの [識別フィールド ] を選択します。目的の カテゴリ名 (サンプルID、薬剤など)を表に入力します。
      12. ツールバーの「 色 」タブを選択します。治療グループ/サンプルごとに異なる色を選択します。「 終了」をクリックします。これにより、[プレート レイアウト] ページが開きます。
        注:左側の数字は、さまざまなサンプル番号と相関しています。
      13. 手順 3.6.14-3.6.16 に従ってサンプル ID を割り当てます。
      14. 選ぶ 左パネルからSPL1。カーソルを使用してウェルを選択します。
        メモ: 自動選択ツールは、シリアル割り当てボックスで調整できます。反復数とレイアウトの向きを事前に指定することができます。
      15. 他のサンプルで繰り返して、プレートレイアウトを完成させます。満足したら 、[OK]をクリックします 。
      16. ファイルツールバーで、サンプルIDを選択します。サンプルID列に、各サンプルの適切な情報(薬剤の種類など)を入力します。OKを押します。
    7. プロトコルを保存します。
      1. ツールバーで、[File] > [ Save Protocol as] をクリックします。ファイルを保存する場所を選択します。ファイル名を入力します。「保存」をクリックしてウィンドウを閉じます。
      2. ツールバーの 「ファイル」>「終了 」をクリックします。 イメージャー手動モード への変更を保存するためのタブが開きます。[ いいえ] を選択します。
      3. 実験 1 への変更を保存するためのタブが開きます。[ いいえ] を選択します。プロトコル定義を更新するためのタブが開きます。[ 更新] を選択します。ソフトウェアを閉じます。
  6. プロトコルをBioSpa OnDemandにインポートし、実験のセットアップを完了します。
    1. BioSpa OnDemand(スケジューリングソフトウェア)ソフトウェアを開きます。
    2. ソフトウェアで使用可能なスロットを選択します。
    3. プレートを生細胞イメージングシステムから取り外します。 [引き出しを開く ]をクリックして、スケジューリング ソフトウェアの適切なスロットにアクセスし、プレートを挿入します。[ Close Drawer] をクリックします。
      注:この手順は、上記の手順3.5.7でプロトコルを作成した後、いつでも実行できます。ただし、以下のステップ3.6.4.3でタイミングを実行するには、プレートがCytation 5にある必要があります。
    4. プロトコルをインポートします。
      1. 「 プロシージャー情報 」タブで、ドロップダウンメニューから「 ユーザー 」を選択します。[プロトコル ] スロットの横にある [ 選択] > [新しいエントリの追加] をクリックします。
      2. [Protocol] スロットの横にある [Select] をクリックします。これにより、新しいウィンドウが開き、ファイルアーキテクチャ内の目的のプロトコルに移動します。 [開く(Open )] をクリックして、プロトコルをスケジューリング ソフトウェアにインポートします。
      3. プレートのイメージングに必要な時間を入力します。[ OK ] をクリックして [ Gen5 プロトコル リスト ] ウィンドウを閉じます。
        注: この手順は、一度に複数の実験を実行する場合に特に重要です。のイメージングに必要な時間を決定するには、[ Perform a timing run now] をクリックします。[ OK] をクリックします。
    5. イメージング間隔を設定し、実験をスケジュールします。
      1. [間隔]で、手順3.5.4で指定したイメージング間隔を入力します。
      2. 「開始時刻オプション」で、「使用可能な場合」を選択します。「期間」で、「固定」または「連続」を選択します。
        注: 次に使用可能な時間にプロトコルを実行する代わりに、特定の開始時刻を指定できます。 [固定期間 ] を選択すると、実験に特定のエンドポイントが設定され、ユーザーは実験期間を指定する必要があります。 継続期間 では、エンドポイントなしで実験を実行でき、ユーザーが実験を停止することによってのみ終了できます。
      3. [ Schedule Plate/Vessel]をクリックします。これにより、プレート検証シーケンスが開きます。タブが開き、提案された初回読み取り時刻が表示されます。「 はい 」をクリックして、このスケジュールを受け入れます。

4. Gen5ソフトウェアでの画像解析 (図2)

  1. 画像解析モジュールを開きます。
    1. Gen5 を開きます。タスク マネージャーで、[実験] > [開く] を選択します。実験を選択してファイルを開きます。ツールバーの[プレート>ビュー]をクリックします。
    2. [ データ] ドロップダウン メニューを [Z 投影法] に変更します。目的の井戸をダブルクリックします。[ 分析] > [新しい画像分析データ削減ステップを設定する] を選択します。[ OK] をクリックします。
  2. 細胞解析
    1. プライマリーマスク
      1. [Analysis Settings] で、Type: Cellular Analysis and Detection Channel: ZProj[Tsf[Bright Field]](左パネル中央)を選択します。
      2. [ オプション] をクリックします。これにより、[ Primary Mask and Count ] ページが開きます。[ Threshold ] ボックスで [ Auto ] をオンにして [Apply] をクリックします。[ オブジェクトをハイライト表示 ]ボックス(右パネル下部)をクリックして、指定したしきい値内のオブジェクトを表示します。必要に応じて調整し、対象のオブジェクトを含めます。
        注: しきい値の設定は、ピクセル強度に基づきます。たとえば、閾値を 5000 に設定すると、強度が 5000 を超えるピクセルが解析に含まれます。
      3. [オブジェクトの選択]で、最小および最大のオブジェクト サイズ(μm)を指定します。必要に応じて調整し、細胞の破片/単一細胞を除外します。
        注意: PDOのサイズは、モデルやタイプによって大きく異なる場合があります。Gen5ソフトウェアの測定ツールを使用して、各モデルのPDOサイズの最小および最大しきい値を決定します。ユーザーは、薬物治療後の後の時点でPDOフラグメントが除外されるのを防ぐために、測定ツールによって提供される値に対してより小さい最小PDOサイズ閾値を選択することができます。
      4. 解析をウェルの特定の領域に制限するには、「 画像全体を解析」 の選択を解除し、「 プラグ」をクリックします。 イメージ プラグ(Image Plug )ウィンドウで、ドロップダウン メニューを使用してプラグ シェイプ( Plug shape)を選択します。必要に応じてサイズと位置のパラメータを調整し、関心領域に合わせます。
        メモ: プラグ内の PDO の数を最大化すると同時に、バックグラウンドを最小限に抑えるために PDO のない領域を除外することが重要です。レプリケート間で対象オブジェクトの大部分を一貫してキャプチャするプラグサイズを指定します。ドームのエッジも除外するプラグを生成することは、エッジの周りのドームの極端な曲率による光の屈折によって歪んで見える可能性のあるオブジェクトを除外するため、重要です。「 プライマリ エッジ オブジェクトを含める 」の選択を解除して、プラグ内の PDO 全体のみをキャプチャすることもできます。
    2. 部分母集団分析。サブポピュレーション指定の例を 図3に示します。
      1. [Cellular Analysis] ツールバーの [Calculated Metrics] をクリックします。[関心のあるオブジェクトレベルの指標を選択または作成]をクリックします(右下隅)。[Available Object metrics] で、関心のある指標 (循環性など) を選択し、[Insert] ボタンをクリックします。[OK] をクリックします。
        注:各PDOモデルの形態と密度は、亜集団を区別するために関心のある最良の指標を決定します。
      2. Cellular AnalysisツールバーのSubpopulation Analysisをクリックします。「追加」をクリックして、新しい部分母集団を作成します。ポップアップウィンドウが開きます。
      3. 必要に応じて、部分母集団の名前を入力します。 [Object Metrics] で、目的のメトリックを選択し、[ Add Condition] を押します。[ Edit Condition ] ウィンドウで、選択した オブジェクト メトリックのパラメータを入力します。必要に応じて、追加のメトリックで繰り返します。
        注意: パラメータは手動で調整するか、ファインダーツールを使用して設定できます。たとえば、瓦礫を除外するには、オブジェクト メトリックとして [面積] を追加し、800 未満のオブジェクトを選択できます。オブジェクト メトリックとしての真円度は日常的に使用され、モデルに応じて 0.2 から 0.5 を超える真円度を持つオブジェクトが含まれます。
      4. ウィンドウ下部の表で、表示する結果を確認します。[ OK] > [適用] をクリックします。
      5. 部分母集団内のオブジェクトを表示するには、[ オブジェクトの詳細 ] ドロップダウン メニュー (右側のパネル、中央) を使用して、部分母集団を選択します。パラメータに該当するオブジェクトは、画像内で強調表示されます。
        注:プライマリマスクとサブポピュレーションのハイライトカラーを変更するには、[ 設定 ](右パネル、下)をクリックします。
      6. サブポピュレーション パラメーターを調整するには、[セル解析] ツールバーから [サブポピュレーション解析] ウィンドウを再度開きます。部分母集団を選択し、「編集」をクリックします。[ステップの追加] をクリックします。
        注:これにより、実験内のすべてのウェルにすべての時点で同じ分析が適用されます。[マトリックス] ページのドロップダウン メニューでは、個々の表示に対して異なるメトリックを選択できます。

5. Gen5 から Excel へのデータのエクスポート

  1. エクスポートするデータ・ファイルをカスタマイズするには、ツールバーの 「レポート/エクスポート・ビルダー」 アイコンを選択します。ポップアップウィンドウで、[ Excelへの新規エクスポート]をクリックします。
  2. ポップアップ ウィンドウの [プロパティ ] ページで、[ プレート>スコープ] と [カスタム>コンテンツ] を選択します。ツールバーの[ コンテンツ ]オプションをクリックします。[ テンプレートの編集] をクリックすると、Excel プログラムが開きます。
  3. スプレッドシート内で、[ Add-ins > Table > Well Data (井戸データのテーブルアドイン)] を選択します。さまざまな選択にカーソルを合わせると、エクスポートのオプションが表示されます。関心のあるメトリックを選択します(例:Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]])。
    注: プレート レイアウトは、[ アドイン] > [プロトコルの概要] > [レイアウト] を選択することで、スプレッドシート分析テンプレートに追加できます。
  4. [編集] ウィンドウが開きます。[ウェル]ボックスで、エクスポートするウェルを Well-ID または Well # で指定します。[OK] を選択します。テンプレートがスプレッドシートファイルに読み込まれます。スプレッドシートを閉じます。テンプレートは自動的に保存されます。
  5. 「Excel への新規エクスポート」ウィンドウで「OK」をクリックし、「レポート/エクスポート・ビルダー」ウィンドウを閉じます。
  6. Gen5ツールバー のエクスポートアイコン をクリックします。目的のエクスポートファイルの横にあるチェックボックスをオンにします。[ OK] をクリックします。Gen5 では、スプレッドシート テンプレートが自動的に入力され、Excel でファイルが開きます。

6. 外部データ分析

  1. Excel でエクスポート ファイル (.xlsx) を開きます。
  2. 各井戸について、個々の値をその井戸の 0:00 の時点の値で割ります。これにより、時点 0 が 1 に設定され、それを超える各値は最初の読み取り値に対して相対的になります。
  3. データ解析ソフトウェアで新しいファイルを開きます。 [XY レイアウト ] オプションを選択します。
    注:このプロトコルでは、GraphPad Prism(バージョン9.5.1)が使用されました。
  4. 各データグループの入力ラベル。各処理グループの時点と対応する正規化された値をコピーして、プリズム表に貼り付けます。データのグラフが自動的に生成され、[ グラフ] の下にあります。

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結果

私たちの目的は、PDO治療反応を評価するためにマルチプレックス生細胞イメージングを使用することの実現可能性を実証することでした。子宮内膜がんの2つの別々のPDOモデル、ONC-10817およびONC-10811で概念実証実験が実施された(ONC-10811データについては補足 図1 および 補足図2 を参照のこと)。アポトーシス(アネキシンV染色)および細胞毒性(Cytotox Green取り込み)は、アポトーシス誘導剤であるスタウロスポリンに応答して動態的にモニターされました。具体的には、PDOを96ウェルプレートに播種し、Annexin V RedおよびCytotox Green色素で処理し、 図1に示すように37°Cのインキュベーターに一晩入れました。2つの独立したPDOモデルにおいて、アネキシンVおよびCytotox Green色素による治療は毒性がないことを確認しました(補足図2)。翌日、PDOはスタウロスポリンの濃度(0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 n...

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ディスカッション

PDO培養は、細胞の応答や挙動を反映する能力があるため、in vitroモデルシステムとしてますます人気が高まっています2。PDOの生成、培養、増殖技術は大きく進歩しましたが、治療反応を解析する方法は遅れていました。市販の3D生存率キットは溶解性エンドポイントアッセイであり、潜在的に貴重な速度論的反応データを見逃し、他の方法によるその後の分析を制限します8。新しい研究では、PDOモデルにおける薬物反応を評価するために生細胞イメージングを適用しています。ここでは、マルチプレックス蛍光生細胞イメージングを利用して、PDO治療反応を経時的に評価する方法を紹介します。マルチプレックス蛍光色素により、異なる細胞応答を同時に定量化することができます。アポトーシスと細胞毒性に加えて、このアプローチは将来の研究で拡張され、PDOにおける他の表現型の影響を調べることができると想定しています。

本明細書に提示するプロトコールは、96ウェルプレートにドームとしてプレーティングされたPDOのキネティック明視野お...

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開示事項

KWTはImmortagen Inc.の共同所有者であり、CJDはAgilentの従業員です。JSdBは、アムジェン社、アストラゼネカ社、アステラス製薬、バイエル社、バイオクセル・セラピューティクス社、ベーリンガーインゲルハイム社、セルセントリック社、第一社、エーザイ社、ジェネンテック/ロシュ社、ゲンマブ社、GSK、ハープーン社、イムチェック・セラピューティクス社、ヤンセン社、メルク・セローノ社、メルク・シャープ・アンド・ドーム社、メナリニ/シリコン・バイオシステムズ社、オリオン社、ファイザー社、キアゲン社、サノフィ・アベンティス社、シエラ・オンコロジー社、大鵬社、テルモ社、バーテックス・ファーマシューティカルズ社から報酬を受け取っています。AZ、アステラス製薬、バイエル、セルセントリック、第一、ジェネンテック、ゲンマブ、GSK、ヤンセン、メルクセローノ、MSD、メナリニ/シリコンバイオシステムズ、オリオン、サノフィアベンティス、シエラオンコロジー、大鵬、ファイザー、バーテックスから研究活動に対する資金提供またはその他の支援を受けているがん研究所(ICR)の従業員であり、アビラテロン、DNA修復欠陥のある癌におけるPARP阻害に商業的関心を持っています。 およびPI3K / AKT経路阻害剤(個人所得なし);は、ヤンセンが提出した、コルチコステロイドによる酢酸アビラテロンの使用を対象とする特許8,822,438について、金銭的利害関係のない発明者として名前が挙がりました。多くの業界が後援する臨床試験のCI / PIを務めています。国立衛生研究所(NIHR)の主任研究員です。他の著者は、開示すべき潜在的な利益相反を持っていません。

謝辞

患者の腫瘍標本を提供してくれたアイオワ大学のTissue Procurement CoreとKristen Coleman博士、PDOモデルの生成を支援してくれた産婦人科のSofia Gabrilovich博士に感謝します。また、論文の批判的分析をしてくれたValerie Salvatico博士(Agilent、米国)にも感謝します。我々は、以下の資金源を認める:NIH/NCI CA263783及びDOD CDMRPはKWTにCA220729P1する。Cancer Research UK、Prostate Cancer UK、Prostate Cancer Foundation、Medical Research CouncilからJSdBへ。資金提供者は、実験の設計や分析、出版の決定に何の役割も果たしていなかった。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL マイクロセントフュージチューブDot Scientific Inc1008113
15 mL 円錐形遠心分離チューブSarstedt62.554.100
554 NM LED CubeAgilent1225012
96 ウェルプレートCorning Costar359637 °C;C
96ウェルプレートAgilent204626-10037°Cに予温;C
A83-01Tocris2939最終濃度は 500 nM (オルガノイド培養培地の成分)
Advanced DMEM/F-12Gibco12634-010オルガノイド培養培地の成分
B27 SupplementGibco17504044最終濃度は 1x (オルガノイド培養培地の成分)
BioTek BioSpa 8 自動インキュベーターAgilentBIOSPAG-SN卓上インキュベーター;BioSpa OnDemandスケジューリングソフトウェアは、Gen5と連携してBioSpaとCytation 5の間でプレートを転送し、イメージングを行います(このプロトコルはバージョン1.01.10を使用します)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderAgilentCYT5PW-SNPlate reader;このデバイスにはGen5ソフトウェアが使用されます(このプロトコルはバージョン3.12.08を使用します)
Cultrex UltiMatrix低成長因子基底膜抽出物R&D SystemsBME001-10
Daunorubicin HClSigma-AldrichS3035DMSOで再構成
メチルスルホキシドSigma-AldrichD2438
EDTA (0.5 M)Thermo Fisher
ForskolinTocris1099最終濃度は10 & マイクロです。M (オルガノイド培養培地の成分)
GlutamaxGibco35050-061最終濃度は1倍(オルガノイド培養培地の成分)
HEPESGibco15630-080最終濃度は10 mM (オルガノイド培養培地の成分)
ヒトEGF、アニマルフリー組換えタンパク質GibcoAF-100-15-1MG最終濃度は0.5 ng/mL(オルガノイド培地の成分)
ヒトFGF-10組換えタンパク質Gibco100-26-1MG最終濃度は10 ng/mL(オルガノイド培養培地の成分)
ヒトR-Spondin 1組換えタンパク質Gibco120-38-5UG最終濃度は250 ng/mL(オルガノイド培養培地の成分)
ドロコルチゾンストック溶液StemCell Technologies7926最終濃度は500 ng/mL(オルガノイド培養培地の成分)です
イメージングフィルターキューブ - GFPアジレント1225101
イメージングフィルターキューブ - TRITCアジレント1225125
イメージング LED GFP/CFPアジレント1225001
アネキシンV 赤色色素ザルトリウス4641オルガノイド培養培地で再構成
細胞毒 グリーン色素ザルトリウス4633DMSO溶液
N-アセチル-L-システインSigma-AldrichA7250最終濃度は 1.25 mM (オルガノイド培養培地の成分)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI 染色液フィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティフィック133661691:50 容量を追加
ニコチンアミドSigma-AldrichN0636最終濃度は 10 mM (オルガノイド培養培地の成分)
NogginR&D Systems6057-NG最終濃度は 100 ng/mL (オルガノイド培養培地の成分)
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140122最終濃度は 10 単位/mL (オルガノイド培養培地の成分)
リン酸緩衝生理食塩水 (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05最終濃度は 100 & マイクロ;g/mL (オルガノイド培養培地の成分)
組換えヒトヘレグリン&β;-1Pepro Tech100-03最終濃度は37.5 ng/mL (オルガノイド培養培地の成分)
Streptomyces sp.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632、CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000最終濃度は 5 & マイクロです。M(オルガノイド培養培地の成分)
&β;-エストラジオールSigma-AldrichE2758最終濃度は100 nM(オルガノイド培地の成分)
ジ AM9260G ヒ

参考文献

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