大容量吸着抽出プローブとGC-MSを用いた、水および魚中のGeosminおよび2-メチルイソボルネオールの抽出と検出

サマリー

このプロトコールは、水および脂質が豊富な魚組織からのジオスミンおよび2-メチルイソボルネオールの抽出のための完全に自動化されたワークフローを示しています。この方法により、これらの分子が臭気の閾値に達する前に早期に検出できます。水産養殖環境からの代表的なデータが提供されます。

要約

ジオスミンと2-メチルイソボルネオールは、微生物起源の揮発性有機化合物であり、再循環養殖システムで頻繁に発生し、非常に低濃度であっても、その中の魚に不快な臭いと風味を与えます。魚中のこれらの化合物の既存の分析法は、十分なサンプルスループットを達成するのに苦労しており、多くの場合自動化されていないため、広範な実践的な調製が必要です。私たちは、高容量吸着抽出相を有する金属プローブを用いて、水組織と魚組織からそれぞれジオスミンと2-メチルイソボルネオールを解析する方法を開発しました。水組織と魚組織の両方から堅牢かつ定量的な検出が達成され、最小検出限界は水からのジオスミンで 1.2 ng/L、水からの 2-メチルイソボルネオールで 1.1 ng/L、魚組織からはそれぞれ 18.1 ng/kg と 13.6 ng/kg でした。これらの濃度は、人間の検出閾値をはるかに下回っていました。したがって、これらの方法は、ジオスミンと2-メチルイソボルネオールが人間に知覚可能になる前に検出できると結論付けました。攪拌子吸着抽出などの他の大容量吸着抽出技術とは対照的に、この技術は完全に自動化可能であり、スループットを劇的に向上させ、手動処理エラーを排除します。一方、プローブの耐久性のある設計により、固相マイクロ抽出(SPME)ファイバーによく見られるような破損を防ぎます。この方法は、すべての水質設定での臭気物質のモニタリングや、固体および半固体マトリックス中の異臭化合物の検出に適しています。

概要

ジオスミン(GSM)と2-メチルイソボルネオール(MIB)は、微生物代謝の副産物として水や土壌に自然に存在する^1,2。一般的に環境や人間の健康に害を及ぼすことはありませんが、水に不快な「土っぽい」臭いや「濁った」臭いや風味を与え、GSMとMIBでそれぞれ10ng/Lと20ng/Lという非常に低い濃度でも知覚できます^3,4。そのため、これらの臭気物質の存在は、知覚される水質を低下させ、ほとんどの状況で非常に望ましくありません。内陸水路では、臭気物質は訪問者への魅力を減らし、環境当局に苦情を引き起こす可能性があります⁵が、飲料水では、臭気物質は消費者が許容できないと感じる不快な臭いと味を与えます⁶。実際、多くの国が飲料水中の臭気物質レベルに規制制限を課しており、中国は最大GSM許容濃度として10 ng / Lを規定しています⁷。

再循環型養殖システム(RAS)は、魚の生産手段として、水産養殖業界でますます重要になっています。これらのシステムは陸上で稼働し、継続的に水を再利用することで環境負荷を低減していますが、魚の飼育に最適な条件を維持するためには、RAS水の広範なろ過が必要です。移動床バイオフィルターは、魚の糞便や食べられていない飼料に豊富な栄養素が含まれているため、微生物によってコロニーを形成するようになります⁸。これらの微生物は、窒素廃棄物や過剰な栄養素の除去に有益です。ただし、一部の種はGSM、MIB、およびその他の臭気物質を生成する場合があります⁴。その後、これらの臭気物質は水に浸出し、魚の肉に吸収され、消費者が不快に感じる不快な臭いと風味の特徴を与えることができます。魚肉の臭気閾値は種によって異なりますが、RASの一般的な種であるアトランティックサーモンの値は、GSMで44〜500 ng / kg、MIB⁴で>900 ng / kgです。したがって、RASオペレーターは、システム内のGSMおよびMIB濃度を定期的に監視して、これらが問題のあるレベル⁴に達しないようにする必要があります。影響を受けた魚は、収穫前に異臭の化合物を一掃して、切り身の品質を回復することができます。ただし、これは高価なプロセスであり、施設は水の再循環を停止し、代わりにシステムを介して新しい水を10〜14日間流す必要があります⁹。GSMとMIBが幅広い業界で永続的で経済的にコストのかかる問題を提示していることを考えると、検出のための分析方法を再評価し改善することは理にかなっています。理想的には、RASオペレーターは、問題が発生する前にGSMおよびMIB濃度の増加を特定するためにRAS水と、GSMおよびMIBレベルが製品の品質に影響を与えたかどうか、およびどの程度影響したかを判断するために魚組織の両方を監視できる必要があります。

GSMおよびMIBの検出方法のほとんどは、ガスクロマトグラフィー(GC)と質量分析計(MS)または水素炎イオン化検出器(FID)のいずれかを使用して分離および検出しますが、水マトリックスから臭気物質が最初に抽出される方法は大きく異なり、多くの方法が発表されています¹⁰。このようなさまざまな方法が試行され、実際に現在も日常的に使用されていることは、それぞれに重大な欠点があるという事実を物語っています。これらの欠点には、液液抽出(LLE)のように大きなサンプルサイズと大量の溶媒が必要であること、ヘッドスペースベースの方法のように感度が低く水の干渉があること、パージやトラップ(PおよびT)のようにキャリーオーバーやシステム汚染に関する広範な問題があることが含まれます。

吸着抽出は、固体吸着相を使用して、サンプルの上のヘッドスペースから直接浸漬を介してサンプル自体から臭気物質を抽出することができる抽出技術の範囲をカバーしている¹⁰。これらの手法は、他の手法よりも少量のサンプルに適合し、溶媒を必要とせず、通常は水の干渉によって深刻な影響を受けません。しかし、最も一般的な吸着抽出の形態である固相マイクロ抽出(SPME)は、少量の吸着相のみを使用し、分析対象物の容量が少ないため、抽出効率が制限されます。さらに、関与する脆い繊維が損傷したり壊れたりする可能性があります¹¹、ワークフローが中断されます。攪拌子吸着抽出(SBSE)は、より大きな相容積とより耐久性のある設計によりこれらの困難を克服するが、容易に自動化することはできず、攪拌子をサンプルに、およびサンプルから熱脱着チューブに手動で移動させる必要がある¹²。ハイスループットが重要な日常的な水質スクリーニングでは、この自動化の欠如が大きな障壁となっています。

私たちの方法の目標は、サンプルスループットと全体的な吸着抽出能力に関して、前述の方法を改善することです。そこで、SBSEの高い分析種容量と堅牢性をSPMEの相選択と自動化と組み合わせて、GSMとMIBの定量的でハイスループットな分析のために、大容量吸着抽出(HCSE)プローブを使用した技術を開発しました。いくつかの変更を加えることで、この技術は水サンプルと均質化された魚組織のサンプルの両方に適用できます。ここでは、プロトコルを完全かつ検証データで説明し、再現性、直線性、および高感度であることを示しています。ここでは水産養殖サンプルをデモンストレーション目的で使用しますが、このプロトコルは、水、土壌、さまざまな食品など、さまざまな種類のサンプルの臭気物質のモニタリングに適しています。完全自動化により、このプロトコルはサンプル数が多くなると予想される場合に特に有益です。

プロトコル

魚のサンプルは、すでに人間が食用として屠殺された動物から採取されました。したがって、倫理的なクリアランスは必要ありませんでした。

1. 校正および内部標準の準備

1. キャリブレーションスタンダードの調製
   1. 100 mLメスフラスコに10 μLのジオスミンと2-メチルイソボルネオール溶液(100 μg/mL)を加え、LC-MSグレードのメタノールで容量まで充填して、ストック溶液C1を調製します。得られた溶液には、各分析物が 10 μg/L (ppb) で含まれます。
   2. 表1に示す容量のC1ストック溶液を100 mLメスフラスコに添加し、脱イオン水で容量まで充填して、キャリブレーションスタンダードを調製します。
   3. 新しい校正用標準液は、非常に傷みやすいため、毎日新しい校正用標準液を作成してください。
      注:これらのストック溶液を毎日新鮮に調製することが重要です。
2. 内部標準試料作製
   1. 10 mg の 2-イソプロピル-3-メトキシピラジン(IPMP)(純度 >98%)を 10 mg の LC-MS グレードのメタノールで容量まで充填したメスフラスコに添加し、ストック溶液(I1)を調製し、10 mg/L ストックを調製します。
   2. 100 μLの溶液I1を100 mLメスフラスコにピペットで移し、脱イオン水で容量まで充填して溶液I2(10 μg/L)を得ます。すべてのサンプルバイアルに50 μLをスパイクして、最終濃度100 ng/Lにします。

2. 水質分析

1. サンプル調製
   1. 分析する水サンプルごとに20 mLバイアルを1本サンプルトレイに入れます。
   2. 校正済みのスケールを使用して重量を量り、20 mLクリンプトップサンプルバイアルごとに2.5 gのNaClを入れます。
      注意: 塩を追加すると、MIBとgeosminが水からヘッドスペースに転送されます。
   3. ピペットまたはボトルトップディスペンサーを使用して、各20 mLクリンプトップサンプルバイアルに5 mLのサンプル水を追加します。
   4. 内部標準液I2の50μLを各サンプル、キャリブレーション標準、およびブランクを含む任意のQA/QCサンプルにピペットで取り付けます。
   5. キャップをバイアルの上に置き、バイアル圧着工具で密封して、分析種の損失を最小限に抑えます。
   6. 一度に1〜2個のサンプルのみを処理し、完了したら各バイアルを迅速に密封して、揮発性分析物の分析物の損失を最小限に抑えます。
2. 分析物抽出(水)
   1. サンプルトレイをオートサンプラートレイホルダーに置きます。
   2. 装置メソッドを準備するには、装置プログラムを開き、 メソッドエディターをクリックします。
      1. メソッドエディターに次のパラメーターを入力して、新しいメソッドを作成します (他のパラメーターはデフォルト値のままにします)。
      2. 「プレサンプリング」では、 バイアル攪拌時間を 10 分に設定して、分析物が水からヘッドスペースまで分割できるようにします。
      3. 「サンプリング」では、 インキュベーション温度 を65°C、インキュベーション時間を30分、 攪拌機速度 を400rpmに設定します。
      4. 「wash HiSorb probe」 が有効になっていることを確認します。そうしないと、残留サンプルマトリックスがシステムを汚染する可能性があります。
      5. 「プローブ脱着」で、 脱着時間を 15分に、脱着温度 を270°Cに設定します。
      6. トラップ設定で、トラップ低温を25°Cに、「スプリットフロー」を8mL/minに設定します。
   3. GC-MSメソッドと併用してオートサンプラーメソッドを実行するには、各プログラムの Startボタンを押します 。

3. 魚のティッシュ分析

1. サンプル調製
   1. 分析する魚のサンプルごとに20 mLバイアルを1本サンプルトレイに入れます。
   2. 市販のフードプロセッサーを使用して魚の組織を均質化します。
   3. 目盛りを付けた目盛りを使用して、均質化された魚組織1.00gを各バイアルに秤量します。
   4. 5mLの飽和NaCl溶液を各バイアルにピペットで移します。
   5. 100 μLの内部標準液I2を各サンプル、キャリブレーションサンプル、および任意のQA/QCサンプルにピペットで注入します。
   6. バイアルの上にキャップを置き、バイアル圧着工具で密封します。
   7. 一度に1〜2個のサンプルのみを調製して、半揮発性および揮発性化合物の損失を減らします。
2. 分析物抽出(魚)
   1. サンプルトレイをオートサンプラートレイホルダーに置きます。
   2. 次のようにインストゥルメントメソッドを準備します(他のパラメータはデフォルト値のままにします)。
      注:サンプリング前のバイアルの攪拌時間とインキュベーション温度は、セクション2.2.2とは異なります。
      1. 「プレサンプリング」では、 バイアルの攪拌 時間を 20 分に設定します。
      2. 「サンプリング」では、 インキュベーション温度 を80°C、 インキュベーション時間を 30分、 攪拌機速度 を400rpmに設定します。
      3. 「wash HiSorb probe」が有効になっていることを確認してください。そうしないと、残留サンプルマトリックスがシステムを汚染する可能性があります。
      4. 「プローブ脱着」では、 脱着時間を 15分、 脱着温度 を270°Cに設定します。
      5. トラップ設定では、 トラップの低温 を25°Cに設定し、 スプリットフロー を8mL / minに設定します。
         注:ここでは、脂質が豊富な魚組織 に対する MIBとGSMの親和性が高いため、より長く、より高温の事前サンプリングステップが必要です。
   3. オートサンプラー法とGC-MS法を併用して、各プログラムの Start ボタンを押してください。

4. GC-MSによる分離・検出

1. 水組織法と魚組織法に同じ GC-MS パラメーターを使用します。
2. GCに5MS、30 m x 0.25 mm x 0.25 μmのカラムが取り付けられ、超高純度のヘリウムキャリアガスが供給されていることを確認してください。キャリア流量を2mL/minに設定します。
3. 次のようにGCオーブンプログラムを準備します:初期温度60°C、3分間保持、次に10°C/分から100°C、次に20°C/分から190°C、次に30°C/分から280°C、最終保持時間は2分です。合計実行時間は 16.5 分に設定されています。
4. GCとMSの間のトランスファーラインを280°Cに、イオン源とクワッドをそれぞれ250°Cと200°Cに設定します。
5. スキャンモードでのMS検出には、m/z 50-350のスキャン範囲を使用します。
6. 選択イオンモニタリング(SIM)操作では、MIBはm/z 95、107、IPMPはm/z 137、152、GSMはm/z 112、55のイオンをそれぞれ定量し、確認します。
   注:多くのクロマトグラフィーソフトウェアパッケージは自動ピーク選択を備えていますが、ピーク選択にエラーがないか手動で確認することを強くお勧めします。

結果

メソッドの最適化

キャリーオーバー評価、プローブ脱離時間の最適化、内部標準評価、プローブ位相評価、直線性と再現性の評価、分析法検出限界の計算など、分析法の最適化を確実にするためにさまざまな実験が行われてきました。

キャリーオーバー評価

プローブの脱着温度250°Cで実験を開始しました。 キャリブレーション標準液を調製しました( 表1を参照)。キャリーオーバーを評価するために、GSMおよびMIB標準を20 ng/Lで分析した後、カラムに何も注入せずにGC-MSパラメータを運転し(カラムブランク)、インジェクターから何も移さずにフォーカシングトラップを脱離(トラップブランク)、プローブを挿入せずにインジェクターを加熱(インジェクターブランク)、 事前のサンプリングなしでプローブを脱着させます(プローブブランク)。カラムブランク、トラップブランク、インジェクターブランクではキャリーオーバーが1%未満でしたが、プローブブランクでは、GSMとMIBでそれぞれ9.35%と3.77%のキャリーオーバーが見られました(表2)。したがって、使用した条件下では、PDMSプローブでGSMが大幅にキャリーオーバーしたと判断しました。

脱着時間の最適化

PDMSプローブのキャリーオーバーを特定したため、プローブの脱着温度を調整することでこの問題を解決しようとしました。プローブの脱着温度が高いほど、プローブからの分析種の脱着速度が増加し、15分間のプローブ脱着時間の終わりまでに脱着がより完全になることが予想されます。ただし、温度が高くなると、分析種の分解が促進され、感度に悪影響を与える可能性もあります。また、温度が高くなると吸着性材料が損傷する可能性があるため、280°Cを超える温度は避ける必要があります。GSMのキャリーオーバーは、250°Cのプローブ脱着温度で有意でしたが、代わりに270°Cを使用した場合、これは大幅に減少し、許容性の閾値である5%をはるかに下回りました(図1)。この改善は感度を損なうことなく達成され、初期分析で生成されたピーク面積は、プローブの脱着温度が低い場合よりも270°Cで小さくありませんでした(図1)。これは、分析種の分解の増加が無視できることを示しています。

内部標準の使用

化合物2-イソプロピル-3-メトキシピロジンは、GSMおよびMIB¹³の検出における内部標準物質として広く採用されています。GSM および MIB の計算された濃度を、内部標準補正の有無にかかわらず、既知のスパイク濃度と比較しました。内部標準試料の補正を行わない回収率は不良で、計算された濃度は既知のスパイク濃度の 60% でした(図 2)。対照的に、内部標準補正を適用した場合、回復率は100%程度と非常に良好でした。したがって、今後のすべての分析で内部標準補正を適用しました。

位相選択

SPME分析では、感度を向上させるためにカーボンワイドレンジ(CWR)および/またはジビニルベンゼン(DVB)をPDMSに添加することがよくありますが、これによりコストが増加します。PDMSのみのプローブと三相(DVB/CWR/PDMS)プローブの比較を試みましたが、これは、プローブの相量の増加がSPMEファイバーに対する感度を向上させる可能性が高いことを考慮してのことです。PDMSプローブと3相プローブのリカバリデータ(図3)は、2つのプローブタイプ間でほぼ同様のパフォーマンスを示しており、PDMSプローブのリカバリは100%にわずかに近づいています。したがって、わずかに優れた性能とコスト削減を考慮して、今後のすべての分析をPDMSプローブで実施しました。プローブはサンプルマトリックスとの直接接触 ではなく ヘッドスペースから分析物を収集するため、相材料へのGSM / MIB分割の動力学は、水サンプルと魚サンプルの間で異ならないことに注意する必要があります。

メソッドの検証

1 ng/L から 100 ng/L までの水中の 6 つの濃度の分析種を対象とした一連のキャリブレーションを分析しました(図 4)。優れた直線性が達成され、r² は GSM で 0.9999、MIB で 0.9999 でした。回帰の標準誤差は、GSMとMIBでそれぞれ0.43と0.37でした。これは、この分析法が評価範囲にわたる定量分析に適していることを示しています。GSM と MIB を含むラボ標準試料を 40 ng/L の水中で 8 回繰り返して再現性を測定しました。RSD値はGSMで6.3%、MIBで4.8%であり、結果の再現性が高いことが示されました。これらの反復は、異なる日に 3 つの別々のバッチで分析され、分析法の精度がさらに実証されました。したがって、GC-MS 分析を伴う HCSE は、定量的で信頼性の高い分析法です。

最小検出限界 (MDL)

MDLは、米国EPAプロトコル¹⁴ に従って、スパイク水(n = 10)またはスパイク魚のサンプル(n = 11)を使用して計算されました。水中のGSMおよびMIBの抽出および検出方法により、GSMで1.2 ng / L、MIBで1.1 ng / Lの検出限界が得られました。これらのMDLは、それぞれ約10および20 ng / Lのヒト臭気閾値をはるかに下回っていました。したがって、提案された方法は、これらの臭気分子が人間の感覚閾値に達する前に、これらの臭気分子の蓄積を自信を持って定量的に検出することができます。魚からのGSMとMIBの抽出と検出の検出限界は、GSMで18.1 ng / kg、MIBで13.6 ng / kgの限界を生み出しました。

養殖水試料の分析

7つの再循環養殖システムから採取した水サンプルを分析し、それぞれについて5回の複製(システム3)または3回の複製(他のすべてのシステム)を評価しました。分析した再循環養殖システムの1つを除くすべてのシステムには、MDLを超える濃度のジオスミンとMIBが含まれていました(図5)これは、水質に潜在的な問題があることを示しました。しかし、いずれの場合も、MIBはヒトの臭気閾値である20 ng/Lを大きく下回っていたのに対し、GSMの臭気閾値である10 ng/Lを超えたのは1つのシステムのみであった(システム1、GSM濃度= 12.69 ng/L)。システム3ではGSMとMIBを検出しましたが、MIBの濃度は計算されたMDLを下回っているため、濃度を確実に定量化することはできません。この分析法は、実際の水サンプルを使用しているにもかかわらず、すべてのシステムで優れた精度を示しており、各システムの反復サンプル間で計算された濃度の変動はほとんどありませんでした(図 5)。

魚組織の分析

脂質が豊富な魚組織は、この方法でGSMおよびMIBの抽出を妨げる強力なマトリックス効果を与えます。そのため、水抽出法に比べてインキュベーション温度が高く(80°C)、インキュベーション時間が長く(20分)と、抽出効率を上げるための微妙な変更が加えられています。魚の組織を以前に分析して、バックグラウンド濃度GSMおよびMIBを決定しました。次に、これらの同じサンプルに既知量のGSMとMIBをスパイクし、3回に分けて分析して、回収率と精度を決定しました(図6)。

図1:キャリーオーバーに対するプローブ脱離温度の影響 (A)GSMとMIBを20 ng/Lに含むラボ標準試料を、3つのプローブ脱離温度のうちの1つで3回に分けて分析し、平均ピーク面積を示しました。その後、各プローブを初期温度でさらに2回脱着させ、キャリーオーバーを評価し、(B)(GSM)および(C)(MIB)の結果を得ました。キャリーオーバーは、初期ピーク面積に対するピーク面積の割合で表されます。エラーバーは、3回の反復にわたる標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2: 内部標準の使用方法。 15 ng/L または 40 ng/L の分析標準試料について、PDMS プローブのみによる抽出による、 補正済みデータ 回収データと未補正データ回収データの比較。サンプル濃度は、IPMPを内部標準として使用して補正しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:分析物の回収。15 ng/L の GSM(左)と MIB(右)の分析標準試料の回収データ(PDMS のみプローブまたは三相プローブ(PDMS、DVB、CWR)による抽出)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:分析用検量線。 GSMの検量線の線形回帰(実線、r² of 0.9999;S = 0.37)およびMIB(破線、0.9999のr² ;S=0.37)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5: 水産養殖水のアプリケーション。 7つの養殖システムから採取した水サンプル中の(A)GSMおよび(B)MIBの濃度(各システムでn≥3)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6: 魚組織の適用。 GSM と MIB (F1 と F2) でスパイクした 2 つの魚のサンプルからの GSM と MIB の濃度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ソリューション名	ストックC1ボリューム追加	総ボリューム	結果として得られる濃度
ストックC1	10ul	100ミリリットル	10 UG / ミリリットル
カル1	10 UL	100ミリリットル	1 ng/L
カル2	20 UL	100ミリリットル	2ng/L
カル5	50 UL	100ミリリットル	5 ng/L
カル10	100 UL	100ミリリットル	10 ng/L
Cal 20	200 UL	100ミリリットル	20 ng/L
Cal 50	500 UL	100ミリリットル	50 ng/L
Cal 100	1000 UL	100ミリリットル	100 ng/L
Cal 200	2000年UL	100ミリリットル	200 ng/L

表1:校正標準。 Geosmin および 2-MIB 標準試料はすべて、メタノール中の CRM47525 Geosmin および 2-メチルイソボルネオール溶液(100 μg/mL)をメタノール溶液 C1(10 μg/mL)に希釈して調製しました。

解析	キャリーオーバー(%)
	GSMの	MIBの
GCラン	0.04	0.08
トラップ脱着	0.09	0
インレット脱着	0	0
プローブの再脱着	9.35	3.77

表2:プローブのキャリーオーバー評価。 GSM と MIB が 20 ng/L、内部標準物質 IPMP が 30 ng/L のラボ標準試料の抽出、脱着、GC-MS 分析後のキャリーオーバー。分析の説明は 2.2.1 に記載されています。

ディスカッション

GSMとMIBは、さまざまな水質モニタリング環境で発生する異臭化合物であり、検査能力に対する需要は高いです。さらに、GSMとMIBは、トレースレベルで人間に知覚されます。したがって、理想的な分析システムは、高感度と高スループットを組み合わせて、高品質のデータを大量に生成する必要があります。前のセクションでは、HCSEプローブによる抽出により、必要以上の感度が得られることを示しました。

HCSEプローブの堅牢な設計により、SPMEワークフローを中断する可能性のある問題である破損を防ぎます。分析法の最適化後、PおよびT分析法に共通する問題であるシステムのコンタミネーションやキャリーオーバーの問題は発生しませんでした。しかし、この分析法の高スループットへの最大の貢献は、間違いなく使用したオートサンプラープラットホームにありました。このシステムでは、分析は24時間続けられ、サンプルトレイにサンプルを供給するためだけに手動の介入が必要でした。これは、手動操作が必要なSBSEなどの他の大容量吸着抽出法とは対照的です。SPMEは通常、完全に自動化されていますが、スループットには限界があり、次のサンプルのインキュベーションは、通常、前のサンプルがGCカラムに注入された後にのみ開始できます。したがって、GCサイクルタイムが短いと仮定すると、次のサンプルが抽出を完了するまでGCはアイドル状態になる可能性があります。当社の方法では、複数のサンプルでプレサンプリングと抽出を同時に行うことができるため、GCのダウンタイムを最小限に抑えることができます。そのため、1システムあたり1時間あたり1.8個のサンプルを処理することができました。

GSMとMIBでそれぞれ1.2と1.1 ng/LのMDLを実証しており、これまでに必要な感度を上回っています。PおよびT、LLE、SBSE、およびSPMEなどの他の技術は、特定の状況下でより低いMDLに到達できるかもしれない^が11、これらの感度の向上は実用的な価値が限られており、上記で概説したHCSEプローブの利点を失うことを正当化するものではない。さらに、これらの技術の中には大量のサンプルを必要とするものもあり、それに伴い廃棄物の発生と輸送コストが増加します。LLEの場合、サンプル量は通常200〜500 mL 15,16,17の範囲ですが、SPME、SBSE、およびPおよびTの場合、一般的な値は10〜100 mL 18,19,20,21,22です。優れた再現性が観察され、RSD値はGSMで6.34%、MIBでは4.82%でした。これらの値は、他の方法¹¹で見出される値とほぼ類似しており、特に、公表されているSPME法^23,24のRSDを上回っている。繰り返しになりますが、私たちの低い RSD 値は、発表されている大多数の抽出技術よりも少ないわずか 5 mL のサンプル量で達成されました。したがって、HCSEプローブは、十分な感度と再現性を提供するとともに、すべての優れた代替品の最良の側面を1つのシンプルで完全に自動化された持続可能な方法に組み合わせた幅広い利点を提供できると確信しています。

ジオスミンと2-メチルイソボルネオールは親油性化合物であり、脂質が豊富な組織からこれらの化合物を抽出して分析しようとする科学者にとって課題となっています。そのため、より長く、より高温のプリサンプリング手順を使用して、サンプルマトリックスからヘッドスペースまでより多くの分析種を駆動するために、プリサンプリング条件を調整しました。これらの調整を行った結果、この分析法は魚類組織のGSMおよびMIBの分析に有効であると判断しました。脂質含有量が非常に高いサンプルの場合、使用するサンプルの質量を0.50gなどに減らす必要がある場合があることに注意する必要があります。これは、脂質が水の上に完全なシールを形成し、分析物がヘッドスペースに到達するのを防ぐためです。

この方法では、平衡原理を使用して、サンプルのヘッドスペースから分析対象物を抽出します。ここでは水産養殖の水と魚のサンプルを使用していますが、この方法は、20 mLのサンプリングバイアル内で均質化して収容できる任意の固体または液体マトリックスからの臭気物質抽出に適用できると考えています。アプリケーションの例としては、環境水や土壌のモニタリング、飲料水の試験、果物や野菜などの食品、または農場で育てられていない水生生物の試験などがあります。農業では、GSMとMIBは湿った土壌に多く見られ、そこで栽培される作物^に異臭を与える可能性があるため2、したがって、品質管理の一形態として臭気物質レベルを監視したり、悪臭の原因を診断したりするために、土壌と作物 の両方を検査することができます 。河川や湖沼などの多くの環境水域では、藻類の異常発生により季節的に臭気濃度が急上昇する²⁵が、この手法は、これらの急増の程度を監視するための高スループットで高感度な手段を提供する。この方法は、例えば、微生物²⁶ による臭気物質産生速度を測定したり、水中の臭気物質濃度と動物組織²⁷との間の関係を調べるための学術研究にも適している。他の研究グループは、アルコール飲料²⁸、羊肉²⁹、オリーブオイル³⁰、ヒト細胞培養培地³¹ 、ピスタチオ³²など、さまざまなサンプルタイプから抽出するためにHCSEプロセスを使用している。これらの研究は、他の分析種を標的としているか、ノンターゲットプロファイリング研究であるため、GSM および MIB の分析には最適化されていませんが、HCSE プローブ抽出用のさまざまなサンプルタイプの調製に関する一般的な洞察を提供するものとして、ここでは紹介します。

記載されている水法は、最小限の変更ですべての水または水性サンプルに適用できる可能性がありますが、他の固体または半固体サンプルに適用するには、サンプル調製(セクション3.1)および分析種の抽出(セクション3.2)にマトリックス固有の変更が必要になる場合があります。ここですべてのサンプリングシナリオを網羅することは不可能ですが、以下の点を考慮します。(1)固体サンプルは、代表性を確保し、分析物の排出に可能な限り最大の表面積を提供するために、格子、粉砕、またはブレンドによって微粉末に均質化する必要があります。(2)脂質含有量の低い固体サンプルは、水や塩の添加を必要としない場合があります-つまり、バイアルとキャップに1.00 gの重量を量るだけで十分です。これにより、サンプルマトリックスから添加された水への中間的な移動なしに、サンプルからヘッドスペースへの分析物のより直接的な移動が可能になります。しかし、これでは攪拌の効果は低下します。分析者は、実験を実行して、サンプルマトリックスに最適なサンプル調製技術を決定する必要があります。(3) 行列が異なれば、GSM と MIB の親和性も異なります。したがって、分析種の平衡をタイムリーに達成するには、異なるインキュベーション温度が必要になります。ただし、一部のマトリックスは熱によって化学的に変化し、高温での化学反応によって干渉が生じる場合があります。繰り返しになりますが、特定のサンプルタイプに最適なインキュベーション温度を決定するには、実験が必要です(注:水分含有量の高いサンプルは、沸騰水の蒸気圧によるバイアルの粉々を避けるために、90°C以上でインキュベートしないでください)。

私たちは、水や魚組織中のジオスミンと2-メチルイソボルネオールの検出法を開発しました。ラボ標準試験では、分析法が定量的で再現性が高いことが確認されていますが、実際のサンプル(再循環養殖システムからの水、そのようなシステムから得られる魚組織)への適用では、複雑で汚れたサンプルの状況でも性能が実証されています。私たちの方法は水産養殖のサンプルに適用されていますが、水や固体または半固体材料など、幅広いサンプルタイプのGSMおよびMIBモニタリングに適していることを示唆しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5-10uL ピペット	ニチペット エア	A21405581
1000uL ピペットチップ	VWR	76322-154
100-1000uL ピペット	エッペンドルフ	285612
100mL ガラスフラスコ	VWR	76008-704
10-100uL ピペット	チペット エア	A20814031
10-100uL ピペットチップ	メガ	24502-18
10xL ピペットチップ	VWR	76322-132
20mL ガラスビーカー	VWR	10754-698
2-イソプロピル-3-メトキシピラジン	TCI	I0577	内部標準
40 ml 琥珀色タイプ 1 (ホウケイ酸塩) ガラスバイアル	環境サンプリング会社	0040-0400-QC	水サンプリングバイアル
5mL ピペットチップ	VistaLabテクノロジー	4058-5102
天びん	VWR	VWR-124B2
Centri 360	Markes	U-CENTRI-1691	オートサンプラー
Chromeleon バージョン 7.3	Thermo Scientific		GC-MS ソフトウェア
フォーカシングトラップ	Markes	U-T12ME-2S
ガスクロマトグラフ、Trace 1310	Thermo Scientific	14800403
GC カラム	Thermo Scientific	26098-1420	TG-5MS
ゲオスミンおよび 2-メチルイソボルネオール溶液	SIGMA-ALDRICH または MilliporeSigma	CRM47525
ヘッドスペースバイアル、20 mL	Markes	C-VCC20
HiSorb ハンドル	Markes	C-HH-6
HiSorb インジェクターキャップ	Markes	C-HSPCCS
HiSorbインジェクターライナー	Markes	U-LINER-HISORB
HiSorb プローブ、PDMS、ショートバージョン	Markes	H1-XXABC
HiSorb バイアルキャップ	Markes	C-HSPCCS
ラボラトリーメタルスクープ
質量分析計、ISQ 7000	Thermo Scientific	ISQ7K-NOVPI
メタノール	VWR 化学薬品	BDH1135-4LP
メタノール、Optima LC-MS グレード	Fisher-scientific	A456-4
O リング サイズ 201	Markes	U-COV201	HiSorb インジェクター キャップおよび HiSorb ストレージ用
Ovation 自動ピペッター (100-5000uL)	VistaLab テクノロジー	213626
パープル ニトリル エクストラ パウダー フリー 試験用手袋	Kimtech	50602-54
塩化ナトリウム (塩)	VWR薬品	BDH9286-2.5K
スイッチングアダプター(自動ピペッター)	CUI INC	SMI10-5
アル圧着ツール	Markes	U-HSVCR
バイアルデキャ	ッパーMarkes	U-HSVDC
計量ボート	Grainger	8AG69