無傷の膵臓を持つマウス血管系を介した灌流によるグルコース刺激インスリン分泌

サマリー

ここでは、交絡因子の可能性を減らしながら内分泌膵臓機能を評価するための追加技術として、無傷の膵臓を持つマウス血管系を通る灌流を介してグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を実行する方法の詳細を提供します。

要約

げっ歯類におけるグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) の現在の方法には、膵島と膵臓スライスの ex vivo 周辺融合または静的インキュベーションが含まれます。 ex vivo 灌流と静的インキュベーションにより、複数のサンプルを迅速かつ効率的に採取することができます。しかし、これらの処置は膵島に外傷、断続的な低酸素症、パラクリンインスリンシグナル伝達の低下にさらされ、これらすべてが GSIS に影響を与える可能性があります。これらの悪影響は、膵臓が無傷のマウス血管系を通る灌流によって最小限に抑えることができ、これは異なるGSISモデルの別の比較方法を提供します。この灌流手順のバックボーンには、i) 膵臓を分離するための血管結紮と ii) 膵臓血管系のカニューレ挿入が含まれていました。このモデルには、7 つの結紮ポイントと 2 つのカニューレ挿入が含まれていました。結果として得られた灌流血管系には、下腹部大動脈、腹腔動脈および上腸間膜動脈、分岐支流、および門脈が含まれていました。

灌流液は、下腹部大動脈をカニューレ挿入するPE-50チューブへの蠕動ポンプを介して~2 mL /分で血管系に導入されました。灌流液は単離された血管系を通過し、PE-30チューブによるカニューレ挿入を介して門脈から収集されました。2.6 mMグルコース、16.8 mMグルコース、および2.6 mMグルコースの各灌流液溶液について、30分間隔で30分間隔で30分間隔で30分間隔で回収され、クレブスリンゲル重炭酸緩衝液(KRB、16 mM HEPESおよび0.1%BSA、pH 7.4)で3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)が含まれる。IBMX 溶液の前に、洗浄サイクルとして通常の 2.6 mM グルコース溶液が投与されました。合計時間は、外科的処置で~1時間、灌流液の収集で2時間でした。インスリン分泌を測定するためにELISAが実施されるまで、灌流液を凍結した。

この方法リストは、血管系を通る膵臓灌流によるインスリン分泌測定の詳細な手順的基礎を提供し、研究者が研究室で無傷の膵臓灌流を正常に実行できるようにしたいと考えています。

概要

ベータ細胞機能の定量化と理解は、主にex vivo周辺融合、静的インキュベーション、そして最近では膵臓スライスを介して達成されてきました。これらの手順により、孤立した膵島の評価が可能になりますが、前者の 2 つは、膵島の機能に影響を与えるストレス要因を小島に課す可能性があります。Rosenbergらによる研究では、標準的な方法を使用して単離された犬の膵島は、ベータ細胞のアポトーシスの増加を示し、これは基底膜の喪失、ピクノティック核の出現、およびアポトーシス小体によって証明^{されました1。}この研究は、膵島の単離直後にアポトーシスを示す形態学的変化が実証されたヒト膵島の単離に関する別の報告と一致しています^2,3。ベータ細胞のアポトーシスの増加は、これらの膵島からのインスリン放出の減少につながり、膵島の分離が膵島を損傷や機能障害の素因にするという概念を裏付けています。

アポトーシスに加えて、膵島の分離により血管系が失われ、栄養素、代謝産物、およびホルモンの輸送障害につながります^4,5。この制限により、ある種の血管系と神経支配を維持するために膵島細胞を眼に移植するなどの代替手段が生まれました⁶。膵島単離中の血管系構造の変化は、生体内で予想されるものとは異なる、よりコンパクトな膵島も作成します ^7,8。

解剖学的違いに加えて、静的にインキュベートされた膵島の挙動は、単離された灌流膵臓とは異なります。低グルコースで静的にインキュベートされた膵島の場合、放出された総インスリンの77%(合計4.34ngのうち3.31ng)は、最初の30分以内に存在し、その後の期間にはほとんど存在しないように見えました。これは、低グルコース濃度で単離された灌流膵臓とはまったく対照的で、すべての時点でインスリン放出が事実上ゼロでした(合計<1.8 ^ng)9。低グルコース濃度でのこの違いを完全に解明するにはさらなる研究を行う必要がありますが、このデータの違いは、膵島細胞の単層の静的インキュベーションを介してさらに調べられた低酸素死細胞からの漏出を表している可能性があります。それにもかかわらず、現在の方法と in vivo 環境との間のこれらの非類似性は、外部妥当性の損ないを引き起こす可能性があります (表 1)。

低酸素症を引き起こすことに加えて、ex vivo ペリフュージョンと静的インキュベーションの両方に、膵島を培養して膵臓から組織培養皿に分離し、懸濁状態に保つことが含まれます。このプロセス中に、コラゲナーゼは通常、膵管を通して灌流され、膵臓組織の解離を可能にします。コラゲナーゼはコラーゲン原線維に結合し、中性プロテアーゼ、ゼラチナーゼ、および内因性膵臓プロテアーゼの助けを借りてコラーゲン原線維を解きます。一緒に、これらのプロテアーゼは、膵島が細胞外マトリックスと腺房細胞付着から放出されるまで消化を続けます。このプロテアーゼの混合物のバランスをとると、単離された膵島¹⁰の純度と機能性の両方においてさまざまな結果が得られます。コラゲナーゼの有効性は、株、年齢、体重、糖尿病の状態などの動物の特徴にも依存します。これらのプロテアーゼを動物固有の形質と組み合わせて使用すると、分離プロセス中に膵島に害を及ぼす可能性があります。コラゲナーゼを投与すると、これらのプロテアーゼは、基底膜の消化を助ける内因性膵臓タンパク質分解酵素も活性化します。ただし、内因性膵臓酵素の活性化を制御することはまだ不可能です。したがって、これは培養プロセス中の膵島の損傷に役割を果たす可能性があります11,12,13。エドモントンからのある報告では、単離に十分な酵素活性レベルに達すると、膵島の単離収量に影響を与える内因性プロテアーゼ活性が示されました^14,15。

コラゲナーゼ (管内) の現在の注入技術は、膵島内部にも浸透し、膵島の断片化の可能性につながることが示されており、したがって、膵島の収量が低くなります¹⁶。Balamuruganらによる研究では、コラゲナーゼは注入されたマウス膵臓内の膵島および腺房組織に局在し、激しい炎症とアポトーシス経路の活性化につながることが確認されました¹⁷。分離期を生き延びた膵島は、インスリンを放出する能力も低下しました。

さらに、膵島調製中の機械的ストレスや培養中の低酸素誘発壊死などの他の要因はすべて、膵島の機能に役割を果たします¹⁸。これらの形質は、膵臓を単離する際の膵島の生存率に影響を与え、その結果として生じる機能に影響を与える可能性があります。

ex vivo ペリフュージョンおよび静的インキュベーションによる膵島の単離および評価とは別に、生きた膵臓スライス内の膵島は、内分泌細胞応答を測定するために使用される別の ex vivo 方法です¹⁹。このシステムでは、膵島分離手順による化学的ストレスが回避されます。さらに、膵島微小環境は無傷のままであり、その in vivo 状態に近い膵島生理学の研究を可能にする²⁰。ex vivo ペリフュージョンや静的インキュベーションと同様に、これは膵臓の知識を習得する上で重要な役割を果たし続ける方法です。ただし、いくつかの制限には、スライス生成中の機械的ストレスや、病理学および生理学のための無傷の膵臓の全体的な全体像の欠如が含まれます。スライスは膵臓内の特定の領域を表しており、サンプルサイズの縮小と視野の制限により、その一般化可能性が低下します²¹。

この膵島の分離およびその他の方法には、膵島に課せられる可能性のあるさまざまなストレッサーポイントが伴います。機械的ストレス、低酸素症、プロテアーゼの過剰活動、および限られた視野はすべて、結果として生じる膵島収量と全体的な外部妥当性に役割を果たします。これらの要因は、マウスの血管系を介した膵臓の灌流によって減少することができ、上記のストレッサーのすべてを最小限に抑えると同時に、細胞の完全性を維持するために体内に存在する他の分泌促進剤および薬理学的薬剤の影響を調べることも可能にします²²。以前の研究では、膵島血流が血漿インスリンレベルに及ぼす影響が示されています²³;次に、膵島の血流を変化させるアンジオテンシンペプチドや交感神経アゴニストなどの血管作動性分子は、膵島の機能とインスリン放出を変化させます^24,25。膵臓灌流により、これらおよび他の異なる分子が内分泌細胞反応にどのように影響するかをさらに評価できます。このシステムは、無傷の血管系と神経支配を伴う自然微小環境におけるクロストークの存在下で、内分泌膵臓生物学の理解をさらに概念的に前進させることを望んでいます。さらに、このプロトコルでは無傷の膵臓を灌流することで臓器を分離することができ、マウス全体の灌流と比較して、循環からインスリンを除去する肝臓などの他の臓器からの潜在的な交絡因子を減らします。マウス全体の灌流により、手術技術の低下が可能になります。ただし、膵臓の後、肝臓(おそらく門脈)に到達する前に、血管を通して灌流液を収集する必要があります。門脈の採取には引き続きカニューレ挿入が必要になります。マウス全体の灌流は手術手順を減らすという利点をもたらしますが、アンジオテンシンペプチドを産生する腎臓や肺などの臓器によって生成される交絡因子による制限があります。しかし、これは、他の臓器から産生される血管作動性分子が最優先事項である膵島に及ぼす影響を調べる際に有用であることが証明される可能性のある新しいアプローチです。

膵臓全体の灌流は、過去に他の人によって成功裏に行われています ^7,22,26。この更新されたプロトコルでは、マウスの使用は、ラットに比べて解剖学的構造が小さいため、技術的課題が増大します。しかしながら、この手順は、3匹の独立したマウスの無傷の膵臓からの十分に特徴付けられたインスリン分泌プロファイルを実証することにより、このプロトコルの実現可能性を首尾よく実証する。

プロトコル

げっ歯類に対して実施されるすべての研究は、ジョスリン糖尿病研究センターのガイドライン (承認番号 22-01) に準拠しています。

1. 始まり

1. 麻酔を施します。
   1. 絶食中の正常血糖マウス(実験で使用されたFlox / Cre 53-74週齢M / F)に、ケタミン/キシラジン混合物(~75 mg / kgのケタミンHCl混合物)を注射し、安楽死のために28 G針を介して後ろの太ももの1つから筋肉内投与します。
      注:ケタミンの影響を軽減するには、正常血糖の絶食マウスの使用が重要です。ただし、麻酔薬で代用することはできます。
   2. 鉗子で後足をつまんで反射をチェックし、マウスが適切に麻酔されていることを確認します。
      注:反射の欠如は、つままれた脚の動きの欠如によって示されます。
   3. 麻酔下での乾燥を防ぎ、角膜潰瘍を防ぐために、滅菌眼科用軟膏を目に投与します。
2. 被写体を確保します。
   1. マウスが固定され、手順中に所定の位置に留まることを確認し、この実験では、磁石を磁気ボードに取り付けて手足に接続する輪ゴムに取り付けられた磁石を介して完了します。
3. 切開部位を清掃します。
   1. マウスの毛からの汚染を防ぐために、マウスに70%のエタノールをスプレーしてください。
      注:マウスを剃ると、毛皮による汚染の可能性が低くなります。
4. 切開を行います。
   1. 鉗子/ピンセットを使用して、肛門から2〜3cmつまみ、湾曲したハサミで腹膜を突き刺しながら上向きに切ります。
   2. マウスの正中線から肋骨と外側部分まで斜めに切開します。
   3. 反対側に同じ切開を作成します。
      注: 目標は、直腸近くから横隔膜まで腹腔を適切に視界できるようにすることです

2.結紮

1. 胃動脈を結紮します。
   1. 鈍い鉗子/指で腸を動物の右側に移動します。胃を持ち上げて胃動脈と静脈を見つけます。
      注: 下部食道から上胃まで走る血管の視覚化によって特定された胃動脈および静脈。
   2. 7-0 縫合糸 (針なし) を取り、結紮の準備として鈍い鉗子を使用して胃動脈の下に配置します。
   3. 外科医の結び目を作成し、しっかりとした結び目を介して適切な結紮を確保します。
      注:結び目の種類は重要ではありません。血流の防止は、結紮された臓器の色を淡い外観に変化させるか、臓器を除去し、結紮点からの血液排出を監視することによって決定できます。胃動脈の結紮により、胃内容物の影響がなくなります。これにより、胃血管への漏出も減少し、灌流液を腹腔動脈に導きます。
2. 左腎血管を結紮します。
   1. 左腎血管について手順2.1.1〜2.1.3を繰り返します。
      1. 左腎臓に接続されている明るい赤と濃い紫色の血管を視覚化することにより、左腎血管を特定します。このステップにより、腎血管への漏出が防止され、灌流液が腹腔動脈にリダイレクトされます。
3. 上腹部大動脈を結紮します。
   1. 手順 2.1.1 から 2.1.3 を繰り返します。
      1. 腹腔動脈、上腸間膜動脈、および左腎血管の分岐血管を備えた正中線の真っ赤な血管を視覚化することにより、上腹部大動脈を特定します。腹腔動脈よりも上側で結紮を行い、上腹部大動脈からの漏出を減らし、腹腔動脈、そして最終的には膵臓への流れを確保します。
4. 右腎血管を結紮します。
   1. 腸を動物の左側に移動します。右腎臓の周囲の組織/脂肪をつまんで、右腎臓を識別するためのてことして。
   2. 手順 2.1.1 から 2.1.3 を繰り返します。
      1. 下大静脈と腹部大動脈の両方に接続された右腎に接続されている紫/暗赤色の血管(下に見えない動脈がある両方の右腎静脈)を視覚化することにより、右腎血管を特定します。このステップは、ステップ 2.2 と左腎血管と並行しており、膵臓をさらに分離することができます。ただし、この血管が下大静脈に近づいていることに注意してください。
5. 下大静脈の腹部を結紮します。
   1. 右腎静脈に分岐した接続を持つ大きな紫色の血管を視覚化することにより、下大静脈の腹部部分を特定します。
   2. 手順 2.1.1 から 2.1.3 を繰り返します。
      注:このステップは、灌流液が収集される門脈を通過する血液から潜在的な交絡因子を減らします。
6. 分岐前に下腹部大動脈を結紮します(図1)
   1. 手順 2.1.1 から 2.1.3 を繰り返します。
   2. 分岐の直前に結紮した後、最初の結び目から0.5cmほど上の大動脈の下に縫合糸を置きます。この縫合糸を使用して、カニューレを所定の位置に結び付けます。
   3. 縫合糸と結紮縫合糸の間のスペースを使用して、カニューレ挿入用のチューブを挿入します。この結紮により、灌流液が下腹部大動脈を通って腹腔動脈に向かって確実に流れます。
7. 門脈を結紮する(図2)
   1. 門脈を適切に視覚化できるように、腸を動物の左側に移動します。
   2. 横隔膜と肋骨に切開を開けて、必要に応じて門脈を観察し、結紮とカニューレ挿入のための適切な牽引力を確保するためのスペースを増やします。
   3. 血管をできるだけ上(肝臓に近い)に結紮して、後でカニューレ挿入のためのスペースを確保します。
   4. 2番目の縫合糸を最初の縫合糸よりも下に、膵臓の上に配置します。ステップ2.7.2は、被験者を亡くします。さらに、このステップは、灌流液を採取し、カニューレ挿入点よりも優れた潜在的な逆流を防ぐために重要です。

3. カニューレ挿入

1. 下腹部大動脈にカニューレを挿入します。
   1. 下部の結び目と上縫合糸の間の下腹部大動脈にはさみで0.5〜1.5 mmの切開を行います。
   2. 最も低い結び目をてこのものとして使用し、より優れた縫合糸に到達するまで、チューブをニックを介して大動脈に挿入します。破れないように注意してください。
   3. より優れた縫合糸を結び目に結び、チューブを所定の位置にロックします。
      注:このステップにより、灌流液が密閉されたシステムに入ることができます。結紮を行った状態で、灌流液は下腹部大動脈の入り口から腹腔動脈、次に膵臓血管に移動し、灌流液を収集できる肝門脈で終わる必要があります。
2. 門脈をカニューレ挿入します。
   1. 門脈が膵臓を離れる直後に門脈に0.5〜1 mmの切開を作成します。
   2. 片手に鈍い鉗子でてこの上の結び目を持ち、鉗子を使用してチューブを門脈に挿入し、もう一方の手でチューブをつかみます。
   3. 可能であれば、2 番目の縫合糸を使用してチューブを所定の位置に結び付けます。
      注:このステップは、存在する液体に対する膵臓の衝撃で灌流液が出る密閉システムの終点です。

4. コレクション

1. 灌流を行います。
   1. 下腹部大動脈チューブを配置する前に、灌流システムが開始され、灌流液が希望の速度(~2 mL / min)で流れていることを確認してください。
      注:灌流液は、門脈カニューレ挿入から収集チューブに排出する必要があります。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブを使用すると、保管を容易にすることができます。ここで使用する灌流液は、クレブスリンゲル重炭酸緩衝液(KRB、16 mM HEPESおよび0.1%BSA、pH 7.4)中の1.2 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を含む2.6 mMグルコース、および16.8 mMグルコース、および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を含む2.6 mMグルコースです。灌流液溶液は、低グルコース溶液から高グルコース溶液に戻り、コントロール用のIBX溶液で終わりました。
2. 灌流液を集めます。
   1. 灌流液を30分間隔でPCRチューブに回収します(3分ごとにチューブを交換します)。
   2. 30分間隔ごとに、ソリューションを切り替えます。
   3. サンプルに対して酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を実行します。これは、適切に保管されていれば、後で行うことができます。

結果

ELISA後の結果は、灌流液グルコースレベルに依存する程度で、マウス膵臓からのインスリン分泌を示すはずです。マウスにおけるこの手順は新規であるため、結果とその成功の分析は、灌流マウス膵臓の他の複数の試験との比較に依存します。高グルコース濃度に対する二相性インスリン反応は、ヒト被験者および膵島周辺融合法で評価されるように、生理学的であると考えられています。提示された結果は、ラットにおける以前の膵臓灌流と同様です²²。3つの独立した実験からの平均インスリンレベルは、高グルコース(16.8 mM)によって誘発される特徴的な第1段階のインスリン分泌を示し、その後、グルコース濃度が低下すると分泌が抑制され、低グルコースレベル(2.6 mM)の存在下でも分泌促進剤(IBMX)に応答して分泌が増加します。使用したマウスは、オスとメスの両方で、1歳以上でした(図3)。他の特徴を持つマウスの灌流膵臓を調べるさらなる研究を行う必要があります。

ディスカッション

上記のプロトコルは、無傷の膵臓、2 つの入口 (腹腔および上腸間膜動脈)、および 1 つの出口 (肝門脈) で構成される密閉システムを作成することを目的としています。他のすべての血管は、灌流液が通過する際の漏れを防ぎ、膵臓自体とその微小環境を確実に隔離するために結紮されています。このプロトコルの結紮ステップは、アンジオテンシンペプチドを分泌したり、循環からインスリンを急速に除去したりする可能性のある腎臓、肝臓、肺など、結果を混乱させる可能性のある他の臓器に移動することなく、膵臓を通る灌流液の流れも可能にします。このプロトコル内では、下腹部大動脈と門脈のカニューレ挿入という 2 つの重要なステップが結果を取得する能力に影響を与えます。下腹部大動脈の場合、マウス血管系を通る灌流液の適切な流れを確保するために、漏れを最小限に抑えて侵入を確保する必要があります。漏出は、カニューレ挿入口を通る可能性のある最も抵抗の少ない経路をたどるため、血管系を通る灌流液の流れを損なう可能性があります。これは、きつすぎてチューブが抜けないようにしながら、チューブを所定の位置に保持する結び目を作成...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ファイバー膜式人工肺	ハーバード大学装置	73-3757	酸素を灌流液に浸透させます
加熱パッド	ブレインツリー・サイエンティフィック	39OM
ケタミン/キシラジン	パターソン獣医	78908598
磁気ボード	ブレインツリー・サイエンティフィック	39OM
輪ゴム付き磁石	ブレインツリー・サイエンティフィック	39OM
顕微鏡	該当なし	該当なし	特定の会社はありません
酸素タンク	該当なし	該当なし	特定の会社はありません
PCRチューブ	サーモフィッシャー/Invitrogen	AM12225	灌流液の採取に使用
PE-30チューブ	ブレインツリー・サイエンティフィック	PE30
PE-50チューブ	ブレインツリー・サイエンティフィック	PE50
蠕動ポンプ	該当なし	該当なし	特定の会社はありません
手術器具	該当なし	該当なし	特定の会社はありません
縫合	該当なし	該当なし	特定の会社はありません