反復漂白は、コア施設の染色自動化を使用して多様性を拡張します

サマリー

ここでは、市販の自動組織染色装置を利用した反復漂白拡張多重度(IBEX)法の適用と、チラミドシグナル増幅ベースの試薬の使用に関する最適化の考慮事項について説明します。

要約

IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplicity)は、高感度のチラミドシグナル増幅(TSA)ベースの多ラウンド蛍光イメージング技術であり、漂白、再染色、画像の共同登録を繰り返すことで、単一の組織サンプル中の多数のタンパク質生体分子を詳細に検査できます。高度に多重化された免疫染色を生成するための採用が拡大しているにもかかわらず、コア施設への展開を通じて自動化された方法で IBEX を実装すると、スループット、再現性、検査スタッフの全体的な効率の向上など、多くの利点が得られます。ここでは、広く利用されている2つのオートステイナープラットフォームでのIBEXの適用の成功を実証し、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織サンプルのTSAベースの反応を使用したパネル設計の重要な最適化考慮事項について説明します。これには、抗体開発の順序を決定する際のIBEXパネル設計の重要な考慮事項である抗体抗原検索感度をテストする方法論が含まれます。さらに、市販のホールスライドスキャナーを利用した下流のイメージングアプローチを紹介し、市販の細胞表現型検査ソフトウェアを使用した品質のアライメントと分析を示します。これらの方法論の詳細な説明と付属のビデオを通じて、IBEX の多用途性と容易さを強調し、中核となる病理学施設が IBEX を既存の自動染色プラットフォームに統合するための実践的なガイダンスを提供することを目指しています。

概要

IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplicity)は、高感度のTSAベースの多ラウンド蛍光免疫組織化学における大きな進歩であり、単一の組織サンプル内の多数の生体分子の詳細な視覚化と定量化を可能にします。IBEX は、漂白と再染色のサイクルを繰り返すことで、比類のない深さと透明度で複雑な細胞環境の検査を可能にし、免疫染色および多重イメージングの分野における強力なツールとなります ^1,2。

多くの学術、政府、産業団体は、定性的および定量的な形態分子データセットの生成を目的とした多様な組織ベースの研究方法論をサポートすることに特化した中核病理学施設をホストしています。これらのコアは重要なリソースであり、研究室が複雑で労働集約的な分子病理学プロセスをアウトソーシングし、研究デザイン、アッセイ開発、データ解釈において病理学者と直接相談できるようにする、専門的な組織ベースのサービスを提供します。一貫性を確保し、実験間のばらつきを減らすために、これらのコア施設は、高い再現^{性と効率で}標準化された染色プロトコルを実行するように設計された市販のオート染色装置(自動装置)に日常的に依存しています3。

自動染色機は中核施設における免疫染色のバックボーンとなり、ハイスループットで一貫した結果を可能にしていますが、IBEX のような最近の進歩に対応するためにはまだ適応されていません。さらに、特にチラミドシグナル増幅(TSA)ベースの試薬を使用する場合、パネル設計における専門知識の必要性4^{は、さらなる}複雑さを増し、日常的な研究ワークフローにおけるIBEXの広範な採用を制限します。その結果、IBEXの高解像度の多重イメージング機能を活用したい研究者は、コア施設の既存の機器によって制限されることがよくあります。革新的なイメージング技術と中核施設運営の実際の現実との間のこのギャップは、学術研究における IBEX の広範な採用に対する障壁を浮き彫りにしています。この研究は、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織を使用した TSA ベースの試薬の使用に焦点を当て、一般的な自動染色プラットフォームでの IBEX の適用の成功を実証することにより、この障壁に対処することを目的としています。まず、TSAベースの染料を使用してIBEXパネルを構築するために必要な手順と、これらのパネルを2つの異なる市販のオート染色剤にカバーして適用する方法について説明します。これは、抗体抗原回収感度試験に関する実践的なガイダンスを提供し、パネル設計を最適化するための重要な考慮事項について議論し、利用可能な商用ソフトウェアや中核病理学研究所を通じてパネルアライメントの代替方法を提供します。

プロトコル

1. TSA系染料によるIBEXパネルの構築

注:常に抗体と色素の新鮮な調製物を使用し、使用しないときは4°Cで保管してください。

1. 抗原検索感度試験
   1. スライドの準備
      1. ミクロトームを使用して、各抗体の3つの連続切片を収集し、同じFFPE包埋組織から3つの別々の正電荷を帯びたスライドでテストします。
      2. 試験する抗体と、試験する抗原回収サイクル数(1サイクル、3サイクル、6サイクル)をラベル付けします。
      3. スライドを室温で一晩乾燥させます。表面マーカーのみを使用する場合は、スライドを60 ^°Cで少なくとも20分間焼いてワックスを柔らかくします。核マーカーを使用する場合は、スライドを60 ^°Cで一晩焼きます。
   2. オート染色機でプログラムをさまざまなサイクル数に準備し、各ステップの間に 3 つの洗浄ステップがあることを確認します。1、3、および6サイクルテストのプロトコルの例については、 表1 を参照してください。
      注:個々の抗体ごとに、抗体ステップとTSA色素塗布の時間を一定にしてください。
      TSAベースの色素アプリケーションの場合、色素を室温で3〜10分間放置する代わりに、色素を37°Cで20分間インキュベートさせることです。
   3. サンプルをオートステイナーにロードし、関連するサイクル数のプロトコルを実行します。
   4. 検証およびテストする個々の抗体について、ステップ1.1.1から1.1.3までこのプロセスを繰り返します。
   5. オート染色機からスライドを取り出し、PBSに入れます。
   6. 最適なイメージングのために、水性封入材(IBEXラウンドと同じ)と#1.5カバーガラスでスライドを取り付けます。
   7. 落射蛍光顕微鏡を使用して、TSA色素とDAPIの1サイクルスライドを画像化し、信号を視覚化するのに必要な露光時間をメモします。
   8. これを3サイクルおよび6サイクルのスライドで繰り返し、TSA色素を視覚化するのに必要な露光時間に注意します。
   9. さまざまなサイクル番号の露光時間を比較します。例については、 図 1 を参照してください。すべてのステップの間に3回の洗浄サイクルを確保してください。
      1. サイクルの増加に伴って曝露時間が短縮される場合は、この抗体と染色を後のステップで配置します。
      2. サイクルの増加に伴って曝露時間が長くなる場合は、この抗体を早い段階に配置します。
      3. 曝露時間に大きな変化がない場合は、この抗体を任意のステップに配置します。
      4. IBEXパネルでの初期パスのサイクル要件に基づいて抗体をグループ化します。
         注:最良の結果を得るには、特定のIBEXパネルに必要なすべてのマーカーでこの検証を実行します。このバリデーションは、組織タイプが変更されるたびに、または固有のロット番号を持つポリクローナル一次抗体を扱うときに実行します。
2. 信号強度の評価により、スペクトル的近傍色素からの信号のブリードスルーに対処します。
   1. 抗体を、上記から決定された最適な検索サイクル数に基づいて、1、3、または6サイクルグループにグループ化する潜在的なIBEXパネルにグループ化します。
   2. スライドの準備
      1. ミクロトームを使用して、FFPEサンプルから連続切片を作成し、抗体ごとに1つずつ作成し、単一のIBEXパネルで使用します。
      2. 各スライドに、IBEXパネルで使用する抗体の1つをラベル付けします。
      3. スライドを室温で一晩乾燥させます。表面マーカーのみを使用する場合は、スライドを60 ^°Cで少なくとも20分間焼いてワックスを柔らかくします。核マーカーを使用する場合は、スライドを60 ^°Cで一晩焼きます。
   3. 1、3、および 6 サイクル グループの場合は、表 1 の 1 サイクル設定を使用します。すべてのステップの間に3回の洗浄を確実にしてください
      1. 最適な染色時間で使用する各抗体のプロトコルを変更します。
      2. すべての抗体に同じTSA時間を使用します。
   4. オート染色剤でサンプルを染色します。
   5. サンプルを取り出し、スライドをPBSに入れます。
   6. 最適なイメージングのために、水性封入材(IBEXラウンドと同じ)と#1.5カバーガラスでスライドを取り付けます。
   7. 各画像に最適な露光時間を使用して、落射蛍光顕微鏡でスライドを画像化します。
   8. 信号強度を決定します。露光時間が短いスライドは信号強度が非常に高く、露光時間が長いスライドは信号強度が低くなります。
   9. 信号強度とサイクル番号を使用して、IBEXパネルを開発します。
      1. サイクル番号に基づいて抗体をグループ化します。
      2. 特定のサイクル番号を持つ特定の抗体グループについて、シグナルのスピルオーバーを最小限に抑えるために、強いシグナルが光学的に弱いシグナルに近づかないようにします。
3. 個々の IBEX パネルを検証して、各パネルが望ましい結果を生成できることを確認します。
   1. スライドを準備します。
      1. ミクロトームを使用して、マルチプレックスIBEXパネルごとに1つずつシリアルセクションを作成し、使用するIBEXパネルの順序でラベルを付けます。
      2. スライドを室温で一晩乾燥させます。表面マーカーのみを使用する場合は、スライドを60 ^°Cで少なくとも20分間焼いてワックスを柔らかくします。核マーカーを使用する場合は、スライドを60 ^°Cで一晩焼きます。
   2. オート染色剤をセットアップします。
      1. 最初のパネルでは、追加の抗原回収ステップなしでオート染色プログラムをセットアップします。
      2. 2番目のパネルでは、最初の抗体の前に、最初のパネルの変性ステップの数に等しい追加の変性ステップを導入します。5つの抗体を有するパネル1の例については 表2 を、4つの抗体を有するパネル2の例については 表3 を参照のこと。すべてのステップの間に3つの洗浄ステップを確保してください。
      3. 必要に応じて、追加のIBEXパネルについて繰り返し、変性ステップを追加します。
   3. 自動染色装置からスライドを取り外し、取り付けの準備が整うまでPBSに入れます。
   4. 最適なイメージングのために、水性封入材(IBEXラウンドと同じ)と#1.5カバーガラスでスライドを取り付けます。
   5. 各画像と各TSA色素の最適な露光時間を使用して、落射蛍光顕微鏡でスライドを画像化します。
   6. すべてのパネルが正しく表示されているかどうかを評価します。もしそうなら、IBEXイメージングに移ります。そうでない場合は、信号のバランシングと検索のサイクルを再アドレス指定します。
      注意: 信号を最適化し、「傘効果」を防ぐために、単一のパネル内でいくつかの調整を行うことができます。一部の非常に豊富なシグナルは、下流シグナルの染色をブロックできます。特定のパネル内を調べて、よりまばらに存在する染色剤を最初に使用します( 図2を参照)。

2. TSA試薬とホールスライドイメージングプラットフォームを使用したオート染色剤によるIBEX適応(図3)

注:このプロトコルで使用および議論された2つの検証済みの自動染色剤の比較については、表4を参照してください。

1. IBEX実行用にすべてのスライドを準備します。
   1. ミクロトームを使用して、正に帯電したスライド上にFFPE切片を作成します。実験サンプルごとに1枚のスライド、画像化する抗原を含むことが知られている組織切片のポジティブコントロールスライド、およびすべての一次抗体の代わりにPBSが使用されるネガティブコントロールスライドを必ず含めてください。
      注:バッチで作業する場合は、バッチコントロールサンプルを含めてください。バッチコントロールサンプルは、染色サンプルのバッチ間の正規化と実験変動の制御に使用するために、切断されて実験サンプルの各バッチに含まれる単一のFFPE組織ブロックです。これは、すべてのサンプルが一緒に処理されない場合にのみ必要です。
   2. スライドを室温で一晩乾燥させます。表面マーカーのみを使用する場合は、スライドを60 ^°Cで少なくとも20分間焼いてワックスを柔らかくします。核マーカーを使用する場合は、スライドを60 ^°Cで一晩焼きます。
2. 画像化する最初のIBEXパネル用の抗体と色素を調製します。
3. 自動染色プログラムをセットアップします。5マーカーパネルの例については、 表2 を参照してください。各ステップの間に必ず 3 回洗浄してください。
4. サンプルと抗体をオート染色装置にロードし、プログラムを実行してサンプルを染色します。
5. オート染色機からスライドを取り出し、マルチスペクトルイメージングに適した水性封入剤と#1.5カバーガラスを使用してカバーガラスを塗布します。
6. 染色後2日以内にスライドを画像化
7. 落射蛍光または蛍光スライドスキャナーでの蛍光イメージング
   1. 十分に制御されたポジティブコントロールサンプルから始めて、ポジティブコントロールサンプルを顕微鏡にロードします。
      1. イメージングするさまざまな抗原のそれぞれについて、サンプル中の陽性シグナルを見つけます。
      2. 露光時間を設定すると、低露光から始めて、信号が現れるまで露光時間を徐々に増やすことで、背景を最小限に抑えながら、汚れのダイナミックレンジを確実に捉えます。これは、染料ごとに個別に行います。
         注:マーカーの高発現と低発現の両方の存在をテストして、フルダイナミックレンジのキャプチャを確実にします。
   2. ポジティブコントロールサンプルに使用した設定を保存し、それ以降のすべてのイメージングステップに使用します。
   3. ポジティブコントロールサンプルによって決定された設定を使用して、ネガティブコントロールサンプルとすべての実験サンプルをロードしてイメージングします。
   4. 後続の手順に進む前に、画像が最適な品質であることを確認してください。
8. カバースリップの取り外し
   1. スライドを DI 水を入れた Coplin ジャーに浸します。カバーガラスの自然な除去を容易にするために、コプリンジャーを65°Cに設定した水浴に15〜20分間入れます。あるいは、水性ベースの封入剤を使用する場合、または封入剤が完全に硬化している場合は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはDI水に一晩浸してカバーガラスを除去し、カバーガラスが自然に剥がれるようにします。
9. LiBH₄による漂白
   1. ヒュームフードで、DI水中で濃度1mg / mLのLiBH₄ の新鮮な溶液を調製します。各サンプルを3回覆うのに十分な量を作ります。
      注:LiBH₄ と水が反応するため、一度に10 mLを超えて調製しないでください。最適な漂白活性を得るには、ミリポア/ナノ純水ではなく純水を使用してください。
   2. 溶液を20分間休ませます。泡が形成されます。
   3. ヒュームフード内の染色チャンバー内の各スライドに1 mLのLiBH₄ 溶液をピペットでかけます。溶液をスライドの上に10〜15分間置きます。
   4. スライドからピペッティングしてLiBH₄ を取り出し、新しい1 mLのLiBH 4と交換します_。 溶液を10〜15分間休ませます。
   5. スライドからピペッティングしてLiBH₄ を取り出し、新しい1 mLのLiBH 4と交換します_。 溶液を10〜15分間休ませます。
   6. ピペッティングによってスライドからLiBH₄ を取り出し、スライドをDI水またはPBSに沈めて短期保存(1日以内)します。
   7. 1日以内に、次のIBEX染色ラウンドに進みます。
   8. オプション:ウェットマウントスライドと落射蛍光スコープで迅速な視覚化を実行し、漂白の成功を確認します。
10. オートステイナーへのスライドの湿式マウントと2回目のIBEX染色ラン
    1. オート染色剤用のすべての抗体とTSA色素溶液を調製します。
    2. Ventanaオート染色剤の場合:
       1. 自動染色を開始する準備ができたら、ウェットマウントからの乾燥を防ぐために、約1 mLの自動染色洗浄バッファーをスライドにピペットで移します。
       2. 湿式取り付けスライドをオートステイナーにロードします。
    3. ボンドRxの場合:
       1. スライドにカバータイルを置きます。
       2. カバータイルの上部で、300 μLの洗浄バッファーをピペットでピペットで入れ、溶液がサンプルとカバータイルの間の空間に流れ込むようにします。
       3. サンプルをオート染色機にロードします。
    4. 表2の例に従って、Nをパネル内の抗体数に設定して、オート染色プログラムをセットアップします。
    5. オート染色機からスライドを取り出し、マルチスペクトルイメージングに適した水性封入剤と#1.5カバーガラスを使用してカバーガラスを塗布します。
    6. イメージングセッションを設定し、画像を収集するためのステップ2.7で説明されているサンプル手順に従って、染色後2日以内にスライドを画像化します。
    7. イメージング後、手順2.8〜2.9で説明したようにサンプルを漂白します。
11. 必要なすべての IBEX パネルに対して繰り返します。

3. 市販のソフトウェアによるサンプルの分析

1. 染色されたスライドのスライド全体のスキャンを完了してから、アライメントに進みます。
2. ソフトウェアで許可されている場合は、自家蛍光スペクトルの除去など、スキャン機能に組み込まれた自動アンミキシング機能を使用してスペクトルアンミキシングを実行します。これが使用しているソフトウェアの機能である場合は、アンミキシングオプションを選択し、標準設定と事前に設定された染料を使用して実行します
   注:カスタムアンミキシングは、アンミキシングを可能にするほとんどのソフトウェアで生成できます。ライブラリを作成するには、単一の蛍光色素で染色された個々の組織切片がソフトウェアの測定値に追加されます。また、自家蛍光スペクトルを特徴付けるために、未染色または自家蛍光組織の領域をスキャンし、これを自家蛍光ツールで選択します。これらのスペクトルは、プログラム内で「画像の準備」を押すことでコンパイルされ、プロジェクト固有のアンミキシングライブラリにエクスポートされます。このライブラリは、アンミキシングオプションでアンミキシングライブラリとして選択されます。
3. スキャンしたスライドを市販の画像解析ソフトウェアにインポートしてアライメントします。
4. 複数のIBEXラウンドのスライド登録
   1. 登録するIBEXラウンドの2つの反復を選択します。
   2. 2つを右クリックし、[ 登録] オプションを選択します。
   3. 最初の登録を試みるには、 高解像度登録によるデフォルト登録 を選択します。
   4. または、オプションから [Single Channel Registration ] を選択し、すべての IBEX 実行で一線性のある 1 つのチャネルを選択します。
      注:このオプションは、漂白に耐性のある染料に役立ちます(染料が漂白しない材料を参照)。
5. 画像の配置
   1. 登録した画像の1つを開きます。
   2. [ ツール] タブの [画像登録] で、[ 登録ツール] を選択して、登録されているすべての画像を開きます。
   3. [ 登録ツール ] タブで、 ランドマーク機能を選択します。
   4. ランドマーク機能を使用して、スライド全体の配置を微調整します。
      1. 1 つのスライド画像にランドマークを手動でマークします。
      2. 他のIBEX画像で、同じランドマークをマークします。プログラムは、識別されたランドマークを使用して線形を調整します。アライメントの微調整を繰り返します。
   5. 位置合わせに満足したら、 ヒューズ |シリアル染色機能。
   6. すべての画像の最終的な合成が完了するまで、追加の IBEX イメージング ラウンドでこのプロセスを繰り返します。
6. 画像解析
   1. 細胞のセグメンテーション
      1. [ 分析 ]タブで、 HighPlexモジュールを選択して開き、細胞同定用の 表現型モジュール を選択します。
         1. すべてのマーカーをロードし、Highplexモジュールの[核検出]タブを使用してすべての核を見つけることから始めます。[染料選択]タブでマーカーをロードします。DAPI染色を使用して細胞を識別します。
         2. [ 解析] タブで、次の主要なパラメーターを使用して [リアルタイム調整] ツール をオンにします。バックグラウンド信号を除外するように設定された最小核強度。信号全体の可視性を制御するために設定された最大画像輝度。検出された原子核の境界を微細化するための核セグメンテーションの攻撃性設定
         3. 正確なセグメンテーションを確保するために、各パラメータを慎重に調整してください。
   2. 細胞質と膜マーカーを検出します。
      1. [ 膜および細胞質の検出 ]タブに移動します。
      2. 最小 細胞質半径 を、予想される細胞サイズのサンプルに適した値に設定します。
      3. [ メンブレン色素 ]オプションで、どのチャネルがメンブレンマーカーであるかを指定します。
         注:これにより、さらなる分析のために個々の細胞をより適切にセグメント化できるはずです。
   3. マーカーしきい値と表現型の割り当て
      1. マーカーごとに、正の信号と負の信号のしきい値を設定します。これは、各マーカーに対して生成されたタブで行います。
      2. 各マーカーの手動しきい値設定を実行して、母集団を識別します。
      3. あるいは、閾値処理にバイオインフォマティクスベースの自動アプローチを使用します。 詳細 |[オブジェクト (セル) データを保存] で、オプションを True に切り替えます。エクスポート中 |オブジェクトデータでデータセットをエクスポートして、識別された各セルのマーカー式情報を取得します。
      4. これらのデータを追加のソフトウェアにインポートして、さらにカスタマイズされた分析を行います。さらなる分析のためのソフトウェアのオプションを 表5に示します。

結果

Autostainer 2でTSAベースの試薬を使用したIBEXパネルの例を示します(図4)。各マーカーは明確に描写でき、マーカー間のにじみは最小限に抑えられます。画像は、2ラウンドの染色で収集されました。サンプルは 結核菌感染後の肺組織です。2つのIBEX染色パネルは、市販のソフトウェアの例を使用して位置合わせされました。最適化されたTSA試薬(ここで説明されているように)を備えたIBEXアプローチを使用すると、免疫細胞、炎症マーカー、および特殊な肺細胞の空間構成を確認し、評価することができます。適切に最適化することで、最小限の背景でマーカーを簡単に表示できます。

図1:2つの異なる抗原を520 nm発光する蛍光色素を用いた抗原検索試験。 RAGEとCD3eは、保存された曝露時間を利用して画像化されました。このRAGE抗体のエピトープは感度が高く、反復的な抗原検索の影響を受けやすく、その後の抗原検索でアッセイ感度が急速に低下します。逆に、CD3e アッセイの感度は、複数回の抗原回収で改善されます。スケールバー = 50 μm。略語:RAGE =終末糖化産物の受容体。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:アンブレラ効果に関する配列開発の重要性の例。 RAGEはAT1細胞で高度に発現するマーカーであり、CD31と組み合わせることで、SARS-CoV-2の免疫反応性を効果的にブロックします。ただし、SARS-CoV-2 IHC を最初に実行すると、すべてのシグナルを視覚化できます。スケールバー = 25 μm。略語:RAGE =終末糖化産物の受容体。AT1 = 肺胞タイプ 1;SARS-CoV-2 = 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;IHC = 免疫組織化学。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:IBEXプロトコルの自動染色装置を使用したプロセスの概要。 組織の乾燥を防ぐための染色プロセスのラウンド2以上の湿式マウント。略語: IBEX = 反復漂白は多重度を拡張します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4: 結核菌に感染した肺上のオート染色剤2のTSAベースの色素を使用したIBEXの例。 パネル1にはすべての染料が含まれ、パネル2には漂白可能な染料が含まれています。肺画像の完全なIBEXにわたるすべてのチャネルのマージ画像が表示されます。スケールバー = 200 μm。略語:IBEX =反復漂白は多重度を拡張します。TSA = チラミド信号増幅。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:1、3、および6サイクルテストの抗体に対するサイクル数の影響を検証するためのプロトコルの例。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:パネル検証用のIBEXオート染色剤用の5つの抗体を含むパネル1の例。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:パネルバリデーション用のIBEXオート染色剤用の4つの抗体を含むパネル2の例。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:2つのオート染色剤の比較。 Ventana Autostainer と Bond Rx の長所と短所をまとめた表。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表5:画像解析のソフトウェア概要。 セグメンテーション後の画像の分析に利用できる分析アプローチとソフトウェアツールの一部をまとめた表。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、自動染色装置の適用とIBEXプロトコルにおけるTSAベースの試薬の最適化により、IBEXプロトコルをコア病理学施設に適応させるための考慮事項を提供します。抗原回収の繰り返しラウンドと、自動装置へのラウンド 2 以上の適切なローディングに最適な方法を示します。さらに、コア施設で利用できる可能性のあるHaloソフトウェアを使用してアライメントを実行する追加の方法を示します。これらのアプローチは、SARS-CoV-2感染後の非ヒト霊長類組織における肺環境の違いを決定するのに役立つことが実証されています⁵。

この研究の重要な要素は、実験組織の染色前に IBEX パネル設計を広範囲に最適化する必要性を強調することです。特に、TSAベースの試薬を使用する場合、基本的なIBEXメソッドには見られないいくつかの考慮事項を考慮する必要があります。1つ目は、抗体感受性に対する複数回の抗原検索の影響です。TSAベースの試薬では、新しい抗体開発の前に抗体の変性が続きます。一部の抗体/抗原ペアは、抗原回収の追加ラウンドの影響を受けやすく、アッセイ感度を低下させますが、一部の抗体/抗原ペアは、反復変性/抗原回収によって感度が向上します。パネルを設計する前に、標的組織内の各抗体を注意深くテストすることは、最良の染色方法を確保し、抗体と蛍光色素の両方の配列順序を通知するために重要です。クエン酸ベース(pH 6.0)とTris-EDTAベース(pH 9.0)の両方を含むバッファーは、最適な抗原検索条件を決定するために、すべての抗体についてテストされます。これには、各バッファーを体系的に評価して、特定の抗体の抗原曝露を最大化するバッファーを特定することが含まれます。さらに、温度(例:20-37°C)、インキュベーション時間(通常30-60分)、およびブロッキング条件が最適化され、非特異的なバックグラウンド染色が減少し、必要に応じて一次抗体と二次抗体の特異的結合が確実になります。一次抗体および二次抗体の前のブロッキングには、組織特異的自家蛍光または非特異的相互作用を説明するために市販のブロッキング試薬の使用が含まれる場合があります。IBEXパネルを完成させる前に最適化しなければならない他の重要な考慮事項には、順序^{が尋ねられている}特定の研究課題に対応していない場合にエピトープのシールドが発生する可能性があるアンブレラ効果が含まれます6。蛍光ブリードスルーを回避するために、高発現抗原標的を、ブリードスルーが最も少なく、マーカーが弱い480〜520 nmの範囲の遠赤色チャネルに入れるのが一般的^です。ただし、この範囲で最も明るい可能性のある高度に自己蛍光する組織サンプルには注意が必要です。この問題に対処するには、色素を使用せずに組織をイメージングし、潜在的なレベルの自己発光に対処することをお勧めします。これらの最適化ステップは、通常IBEXで行われるすべての通常の最適化と制御とともに実行され、TSA試薬を使用したIBEXの適切なパネル設計に情報を提供できます。

この方法では、2つの一般的なオート染色剤の使用を実証しました。ただし、これらのアプローチは、他の自動染色方法にも適用できます。ここで重要なのは、カバーガラスの最適な除去と、追加の染色ラウンドのための湿潤負荷です。また、特定の顕微鏡のセットアップは指定していません。キットでは、最適なスライドスキャンのために特定のイメージングシステムでの使用が推奨されている場合がありますが、どの顕微鏡セットアップ、特に互換性のあるフィルターキューブと広域スペクトルのLED光源を備えた落射蛍光顕微鏡でも機能するはずです。一部の色素にはマルチスペクトル検出器または特殊なフィルター キューブが必要ですが、これはすべての研究室で利用できるわけではなく、スペクトルが重複するため、標準フィルター キューブと併用すると課題が生じる可能性があります。これらの色素は、マルチスペクトルイメージングシステムまたは高度に特異的なフィルターを使用してより適切に分離されます。一部の蛍光色素は、従来の遠赤色フィルター(通常~700 nm)の範囲外であり、近赤外信号を捕捉できる特殊なフィルターキューブまたは検出器が必要です。特殊な顕微鏡はこれらのフィルターで構築されていますが、代替品も利用できます。これらには、特定の顕微鏡構成で色素がどのように機能するかを決定するために、追加の最適化が必要です。

マルチスペクトルアンミキシングは、真のシグナルをバックグラウンドノイズから効果的に分離するため、マルチプレックス蛍光IHCに強く推奨されます。自家蛍光は、一般的に使用される蛍光色素の発光スペクトル (特に高エネルギー波長チャネル) と重複することが多いため、特定の信号が不明瞭になったり干渉したりして、精度が低下する可能性があります。スペクトルのアンミキシングは、重複する発光スペクトルを数学的に解きほぐし、不要な自家蛍光を「クリーンアップ」しながら実際の蛍光シグナルを分離します。スペクトルのアンミキシングは、染色およびイメージングプロセスの反復的な性質により、可能な限りクリーンなシグナルを達成することが重要な IBEX ワークフローで特に価値があります。IBEXでは、複数回の染色からのシグナルをイメージングし、漂白し、重ねて合成画像を作成します。1ラウンドで未解決のままの自家蛍光またはブリードスルーは、スタックされた画像を介して伝播する可能性があり、下流の分析が複雑になり、マーカーの局在化の信頼性が低下します。スペクトルアンミキシングは、バックグラウンドの自家蛍光から真の蛍光シグナルを効果的に分離し、個々のラウンドでよりクリーンで正確なシグナル検出を保証します。この信号の明瞭さは、複数のマーカーがラウンドにわたって一緒に分析され、信頼性の高い表現型解析と空間分析を可能にする信頼性の高い合成画像を生成するために不可欠です。このプロトコルに使用されるイメージングプラットフォームにはオンボードのアンミキシング機能がありますが、他の蛍光ホールスライドイメージングプラットフォームとの互換性のためには、より多くのアンミキシングオプションが必要です。

さらに、この作業の限界は、関連する試薬と洗浄バッファーがこれらのシステム用に最適化されているため、オート染色剤の独自の性質ですが、具体的な配合は未公開のままです。さらに、私たちは、スライド全体の画像解析用の市販の画像解析ソフトウェア 1 つのみに焦点を当てており、ソフトウェア ライセンスのコストが一部のラボにとって経済的障壁となる可能性があることを認識しています。追加の分析ソフトウェア^8,9とRのオプションは有望に思われます。特に、IMCDataAnalysis¹¹は、Rでの多重化された画像下流解析の再現性のあるワークフローを対象としているという点で、コアにとって最適と思われるパッケージセットを作成したBodenmiller Group¹⁰です。ただし、リソースが限られた設定でより広く採用できるように、スライド全体の IBEX 分析のアクセス可能で費用対効果の高い代替手段を開発し、特徴付けるための将来の取り組みが必要です。さらに、IBEX用のオート染色剤を使用したこのアプローチは、蛍光結合一次抗体、または組織が良好なシグナルを可能にするのに十分な品質と最適な固定時間である場合、TSAベースの色素を使用せずに標準的な二次抗体を使用するなど、IBEXでのより伝統的な染色に適応できます。

全体として、この研究が、日常的に利用されている病理学コア施設機器を使用して TSA ベースの多重蛍光 IHC を適用し、IBEX をこれらの環境により広く適応させるのに役立つことを願っています。このタイプのアプリケーションは、IBEX プロトコルの多用途性を真に強調し、困難な組織サンプルや大規模なバッチ アプローチでもその有用性を実証します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
染色試薬 Alexa TSAキット	サーモフィッシャー		オパール顕微鏡フィルターがない場合は代替のTSA染料も検討してください。これにはAlexa Fluor 488(青緑チャンネル)、Alexa Fluor 555または568(赤色チャンネル)、Alexa Fluor 647(遠赤チャンネル)、Alexa Fluor 750(適切なフィルターを装備した場合の近赤外線)が含まれます。
抗体 Arg1	細胞シグナル伝達	93668	図4の1:100で使用されている
マテリアル ブレード	ライカ・バイオシステムズ		または似たようなこと。高プロファイルか低プロファイルかは組織の種類によって異なります
抗体 CD11b	アブカム	ab133357	図4の1:2000で使用されている
抗体 CD163	アブカム	ab182422	図4の1:500で使用されている
抗体 CD31	細胞シグナル伝達	77699S	図2の1:100で使用されている
抗体 CD3e	ダコ	A045201-2	図1の1:100で使用されている
ツール コプリンジャー	フィッシャー・サイエンティフィック	01-816-21	または類似のもの
素材 カバースリップ	VWR	V48393-026	または類似のもの
抗体 CX3CR1	アブカム	AB308613	図4の1:450で使用されている
ステイン DAPI	アコヤ	FP1490
ソフトウェア FIJI			信号強度の測定に使用
スライド フィッシャースーパーフロントスライド	フィッシャー・サイエンティフィック	22-037-246	あるいはそれに似たようなもの
ソフトウェア HALO	インディカ・ラボ		市販の画像解析ソフトウェアの例。画像のアラインメントや分析に使われました。
抗体 Iba1	細胞シグナル伝達	17191	図4の1:800で使用されている
Software inForm	アコヤ		信号強度の測定に使用
抗体 iNOS	アブカム	AB283655	図4の1:400で使用されている
計器 ライカボンド処方薬(またはRXm)	ライカ・バイオシステムズ	21.2201	本文では「オートステイナー1」と呼ばれています。染色ボックスやバルク溶液を含む関連する試薬もすべて用意されていることを確認してください。
試薬 LiBH4	シグマ・オルドリッチ	62460-5G-F	無水環境で飼い続けます
インストゥルメンツ マントラスナップ	アコヤ		染料を分解するためには多分光蛍光顕微鏡が必要です。オパール染料を検出できる顕微鏡の例。
ツール ミクトーム	ライカ・バイオシステムズ		またはブラシなどの好むアクセサリーで似たようなものを使った
染色剤 Opal IHC 480キット	アコヤ	FP1500001KT	図4での使用
染色試薬 Opal IHC 6-plex Plexキット	アコヤ	NEL821001KT	図1、2、4で使われている520号と620号は漂白剤を使いません
染色試薬 Opal IHC 780キット	アコヤ	FP1501001KT	図4での使用
ツール オーブン	ミリポール・シグマ	Z683329	または類似の方法も、オートステイナーで行うことができます
抗体 パンサイトケラチン	アブカム	AB9377	図4の1:50で使用されている
試薬 PBS(任意)	フィッシャー・サイエンティフィック	AAJ61196AP
Instrument フェノイメージャー	アコヤ		ソフトウェアに内蔵されたマルチスペクトル全スライドイメージング(オンボードスペクトルアンミキシング)
試薬 ProLong ゴールドアンチフェード	フィッシャー・サイエンティフィック	P36961	または類似の水付き固定媒体
抗体 ProSP-C n末端(ProSPC)	セブンヒルズ・バイオリエージェント	WRAB-9337	図4の1:250で使用されている
抗体 RAGE	R&D	MAB1179	図1および図2の1:50で使用されている
試薬 反応バッファー	ロシュ	NC1895692	ベンタナオートステイナーでの使用用
抗体 SARS-CoV-2-N	細胞シグナル伝達	68344	図2の1:1000で使用されている
スライド TOMO 接着 CC 顕微鏡スライド-WH	アヴァンティック	SKUSL6519-1	組織の付着が気になる場合
インストゥルメンツ ベンタナ・ディスカバリー・ウルトラ	ロシュ		本文では「オートステイナー2」と呼ばれています。染色ボックスやバルク溶液を含む関連する試薬もすべて用意されていることを確認してください。
試薬 ウォッシュバッファー	ライカ・バイオシステムズ	AR9590	ライカボンドオートステイナーでの使用用
試薬 水	フィッシャー・サイエンティフィック	15-230-147	DIが最適で、ミリポアではありません
ツール 水浴	ライカ・バイオシステムズ	140607020C1	または類似のもの