方法論記事

高塩食条件下での塩分感受性ラットにおける腸内微生物細胞外小胞の分離と鑑別特性評価

DOI：

10.3791/68279

⸱

2025年6月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Pathology Department, Suining Central Hospital, 3School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy, Affiliated Sport Hospital of CDSU, 5Department of Neck, Shoulder, Waist, and Leg Pain, Sichuan Province Orthopedic Hospital, 6Neijiang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、密度勾配遠心分離を使用してHSDを給餌した塩分感受性ラットからの腸内微生物EVの分離について説明しています。EVは、ナノ粒子追跡、TEM、LPS/BCA アッセイ、および 16S rRNA シーケンシングによって特徴付けられ、サイズ、形態、組成、および微生物叢の起源を解析しました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

塩分摂取量が多いことは高血圧の主要な危険因子であり、その根本的なメカニズムは、腸内細菌叢によって分泌される細胞外小胞(EV)と密接に関連している可能性があります。腸内細菌叢によって産生されるこれらのEVは、高塩分食(HSD)によって引き起こされる高血圧の発症に重要な役割を果たす可能性のあるさまざまな生理活性成分を運んでいます。このメカニズムを調査するために、HSDを与えられた塩分感受性ラットの腸内細菌叢からEVを分離するための密度勾配遠心分離に基づく効率的な抽出方法を開発しました。粒度解析、透過型電子顕微鏡(TEM)、リポ多糖(LPS)の検出により、腸内細菌叢EVの勾配分布を特定し、精密な抽出を実現しました。さらに、16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いて、正常群とHSD群との間のEVの起源と組成の違いを解析し、高塩分摂取が腸内細菌叢EVの遺伝的特性に与える影響を明らかにしました。この研究は、塩分誘発性高血圧症の根底にある腸内細菌叢のメカニズムに関する貴重なツールと科学的洞察を提供し、関連疾患の予防と治療に新たな視点を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腸内細菌叢は、腸内細菌叢または腸内微生物叢とも呼ばれ、生物学的消化管に位置する数万の微生物の複合体であり、人間の健康の維持に重要な役割を果たしています1。近年、さらなる研究により、腸内細菌叢が細胞外小胞(EV)2を生成できることがわかっています。EVは、細胞から放出される小さな小胞であり、タンパク質、核酸、脂質など、細胞内のさまざまな分子を運ぶ3,4。それらは、他の微生物5、腸上皮細胞、さらには離れた組織や臓器6と相互作用することができ、したがって人体7,8の健康に影響を与えることができる。これらの腸内細菌叢によって生成されるEVと食事との間には密接な関係があります9。

腸内細菌叢によって産生されるEVは、高塩分食(HSD)が体の健康に影響を与える重要な薬剤である可能性があります。HSDは、腸内細菌叢10のバランスを直接乱し、有益な細菌(乳酸菌など)11の数を大幅に減少させるだけでなく、有害な細菌(バクテロイデス菌など)の増殖を促進します12.この不均衡は、腸のバリア機能を低下させ、腸の炎症のリスクを高めます。さらに、HSDは、複数の生理学的機能を持つ短鎖脂肪酸14,15の産生を減少させるなど、腸内細菌叢の代謝活動13を変化させることにより、腸内の酸塩基バランスおよび栄養素吸収にもさらに影響を与える。

これらの変化は、腸の健康に影響を与えるだけでなく、EVの生産と放出を間接的に制御し、EVの組成と機能を変化させる可能性があります。高塩分環境は、EVの放出と輸送を含む腸細胞の正常な生理機能に影響を及ぼし、それによって細胞間情報伝達と免疫調節におけるEVの役割を妨害する可能性があります。同時に、腸の炎症は、特殊な機能を持つさまざまなEV16を促進し、腸臓器軸などを通じて全身に広がる可能性があり17,18、これは高血圧19,20、心血管疾患21および脳血管疾患22,23、肥満24,25、糖尿病26の発生と発症と密接に関連していますおよびその他の慢性疾患。

したがって、この研究の全体的な目標は、HSDを与えられた塩分感受性ラットの腸内細菌叢からEVを抽出する効率的で信頼性の高い方法を開発し、それらの物理的特性、組成、および機能を体系的に研究することでした。高塩分食後の血圧の有意な上昇の特性から、塩分感受性ラットを選抜し、効率的な抽出法を構築することにより、HSDが腸内細菌叢EVに及ぼす影響を明らかにしました。この方法は、密度勾配遠心分離に基づいており、粒子サイズ検出、LPS/BCA測定、透過型電子顕微鏡、プロテオミクス分析などのさまざまな動的同定技術を組み合わせていました。このプロトコルは、HSDが腸内細菌叢EVに及ぼす影響と、心血管疾患におけるそのメカニズムを明らかにすることを目的としています。このアプローチは、その高い効率性、再現性、および幅広い適用性により、塩分誘発性高血圧における腸内細菌叢EVのメカニズムを探求するための重要なツールを提供するだけでなく、EVに基づく疾患介入戦略を開発するための理論的基礎を築きます。この研究を通じて、高血圧などの心血管疾患の予防と治療のための新しい道を切り開くことを望んでいます27,28。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この動物実験研究は、関連する倫理ガイドラインと国際基準に準拠しています。動物を用いた研究は、成都中医薬大学(機関:成都中医薬大学、プロトコル番号:2018-21)の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました。

1.動物の準備と食事療法

  1. 体重180〜200gの体重180〜200gの6週齢の雄のダール塩分感受性ラットを、湿度50%±10%で飼育することにより順応させます。12時間/ 12時間のライトサイクル;特定の病原体を含まない条件下で、20.0 ± 2.0°Cで1週間。
  2. その後、ラットを2つのグループ(n = 6)に均等に分けます。各グループに6週間続く異なる食事を提供します:0.5%の塩化ナトリウムを含む通常の塩食(NSD)と、公開された研究で一般的に使用されている8%の塩化ナトリウムを含むHSD29,30,31。マウスは、研究全体を通じて食物と水に無制限にアクセスできました。

2. 血圧のモニタリング

注:血圧測定の非侵襲的方法としてテールカフプレチスモグラフィーが使用され、尾血量から血圧を測定するときに体積圧記録(VPR)が使用されました。

  1. ラットをおがくずを入れた小さなケージに個別に置き、約37°Cで10分間加熱し、動物の侵入用に調整可能な鼻とドアを備えたカスタムのげっ歯類の拘束具に入れます。ラットを腹臥位の温熱パッドに置き、体温を37°Cに保ちます。
  2. VPRセンサーをテールの下部に接続し、BP10を安定させるために少なくとも28回の適応サイクルを設定します。
    1. テールルートのインフレータブルカフを充填し、プレチスモグラフィックセンサー(または光電センサー)を下に置きます。収縮期血圧(通常は200 mmHg)以上までゆっくりと膨らませてから、ゆっくりと離します。この装置は、脈波の消失(収縮期血圧)と回復(拡張期血圧)の圧力値を自動的に検出します。3〜5回連続して測定し、平均値を取ります。
  3. すべてのラットを拘束手順に対応するように訓練し、概日変動の影響を最小限に抑えるために午前9時頃に静かな実験室でこの研究を実施します。
  4. 生贄の前に、収縮期血圧(SBP)と拡張期血圧(DBP)を隔日で測定してください。SBPおよびDBPから平均動脈圧(MAP)を推定する
    MAP = (SBP + 2 DBP)/3

3. EVの抽出

  1. サンプルコレクション
    1. 滅菌綿棒を75%アルコールに浸し、それを使用してラットの肛門を刺激します。この刺激は、腸の蠕動運動を促進し、肛門括約筋を弛緩させることで排便を促進することを目的としていました。糞便が排出された後、滅菌鉗子を使用して適切なサイズの滅菌容器に集め、すぐに-80°Cで保存してください。
  2. サンプル調製
    1. スプーンを使用して、5 gの糞便を事前に秤量した50 mL遠心チューブに移します。予熱した37°CエンドトキシンフリーPBS(最大サンプル濃度10%)を50 mLチューブに加え、30分間回転させます。高速遠心分離機を4°Cに冷却します。
    2. サンプルを対称的に置いた後、8,000 x g で15分間遠心分離し、遠心分離機が平衡化します。遠心分離後、上清を吸引し、新しい滅菌遠心チューブに移します。
    3. 再度、8,000 x g で15分間遠心分離します。上清を吸引し、さらなる分析に使用します。
  3. 粗抽出物の調製
    1. 滅菌済みの0.22μmフィルターユニットを使用してください。フィルターユニットを氷の上に置き、真空ポンプをしっかりと保持します。得られた上清をフィルターの上部に移します。真空ポンプをオンにして、ろ過されたサンプルを収集します。
    2. 濾液を遠心フィルター(10 kDa、15 mL)に移し、4 °C、3,000 x g で30分間遠心分離し、サンプルを少なくとも1400 μLに濃縮します。
    3. 濃縮サンプルを採取し、必要に応じて、予冷したエンドトキシンフリーPBSを使用して1400μLに希釈します。希釈後すぐにサンプルを氷上に保管してください。
      注:粗抽出物はすぐに使用することも、-80°Cで数か月間保存することもできます。
  4. EVの分離
    1. グラジエントバッファAとグラジエントバッファBを以下のように準備します。化合物が完全に溶解するまでに数時間かかるため、1日前にバッファーを準備してください。調製したバッファーは、4°Cで6ヶ月間保存できます。
      1. グラジエントバッファーAの調製:マグネティックミキサー攪拌により、0.25 Mスクロース、6 mM EDTA、および60 mM Trisを800 mLのエンドトキシンフリー水に溶解し、塩酸を使用してpHを7.4に調整します。エンドトキシンフリーの水で1Lに希釈します。0.22 μmのボトルトップフィルターを使用してバッファーをろ過します。
      2. グラジエントバッファーBの調製:マグネティックミキサーで攪拌しながら、0.25 Mスクロース、1 mM EDTA、および10 mM Trisを800 mLのエンドトキシンフリー水に溶解し、pHを7.4に調整して塩酸で溶解します。エンドトキシンフリーの水で1Lに希釈します。0.22 μmボトルトップフィルターを使用してバッファーをろ過します。
    2. 1容量のグラジエントバッファーAと5容量の密度グラジエント培地(培地は60%イオジキサノール溶液)を混合して、作業溶液を調製します。
    3. イオジキサノール溶液(10%、20%、40%)の調製:10%イオジキサノール溶液を調製するには、1単位の作業溶液と4単位の緩衝液Bを混合します。20%ヨージキサノール溶液の場合、2ユニットの作業溶液と3ユニットのバッファーBを混合します。40%ヨージキサノール溶液の場合、4ユニットの作業溶液と1ユニットのバッファーBを混合します。
      注:各実験には新しい作業溶液を調製する必要があり、実験誤差を考慮してさらに10%の溶液を調製できます。
    4. ステップ 3.3.3 で調製した溶液を 7 mL の密度勾配培地と混合して、50% ヨージキサノール溶液を調製します。
    5. 密度勾配を調製するには、トリパンブルー溶液を40%溶液と10%(wt/vol)イオジキサノール溶液に加えて、異なる層間に明確な輪郭を提供します。
    6. 8 mLの50%ヨージキサノール溶液を薄肉ポリプロピレン遠心チューブの底に移します。チューブを70°に傾け、8 mLの40%ヨージキサノール溶液を液面に移します。8 mLの20%ヨージキサノール溶液、次に7 mLの10%ヨージキサノール溶液、最後に2 mLのエンドトキシンフリーPBSを加えます。
      注:密度勾配の準備には練習が必要です。密度勾配の品質は、実験結果に大きな影響を与えます。添加プロセスの異なるステップ間でチューブを直立させないでください、密度勾配の品質に悪影響を与えるためです。
    7. 事前に遠心分離機を予冷し、準備した密度勾配を超遠心分離機に入れます。開始する入力パラメータ、パラメータ値:100,000 x g、20時間、10°C。
    8. 手動グラジエント密度分離では、合計 34 mL の液体を含むシステム表面の中心から 2 mL の溶液をゆっくりと引き出します。各 2mL はグラジエントであるため、密度グラジエント溶液は 17 のグラジエントに分割されます。
    9. ピペットを使用して密度画分を滅菌サンプルチューブに移し、すぐに氷の上に置きます。clamp 遠心分離管を親指と人差し指の間に挟み、直立したままであることを確認します。
  5. EVの回復
    1. 限外ろ過チップ上のダブルカップリング超音波発振システムを介して負圧振動を適用する全自動EV抽出システムを使用して、ナノポアを介してサンプル中の核酸とタンパク質不純物を除去し、EVを遮断し、EVの濃縮と精製につながります。
      1. ステップ3.4.7でろ液を取り出し、限外ろ過チップに加えます。
      2. 装置の指示に従って装置を操作し、ろ過された濾液、すなわちエキソソーム濃縮溶液を回収します。主なプロセスを 図 1 に示します。

4. EVの識別

  1. 粒子サイズと濃度の検出
    1. 抵抗性パルスセンシング(RPS)ベースのナノクーロメータカウンターを使用して、サイズ分布とゼータ電位を評価します。この実験では、測定範囲が60〜200 nmのナノポアチップを選択します。さらに、ナノライブラリカウンターを使用して、EVの粒子サイズ分布とゼータ電位を評価します。
      1. 適量のEV溶液を(1/10、1/100、1/1000、1/10000)に希釈します。
      2. 試験のために、さまざまな希釈度のEV溶液を装置上に置いた。
      3. より安定性の高い希釈倍数を選択し、再度テストして、より正確なデータを取得しました。
  2. LPSおよびBCAアッセイ
    1. BCAアッセイ:RIPAバッファーを使用してEVを溶解し、タンパク質を分離します。BCAタンパク質濃度測定キットを使用して、EVのタンパク質含有量を測定します。
    2. LPSアッセイ:エンドトキシン検出キットを使用して、サンプル、エンドトキシン検出器、およびキットの手順に従って発色性を追加します。545 nmでの吸光度を測定し、標準曲線に従って外部小胞のLPS発現を計算します。
  3. TEM評価:ネガティブ染色およびTEM分析では、連続炭素膜でコーティングされた発光性銅グリルにサンプルを適用し、0.75%ギ酸ウラニルで染色します。クライオEMの場合は、EVを親水性の表面を持つ300メッシュのEMカーボングリッドに吸収し、液体窒素で凍結します。Cryo-TEMを使用してグリッドを観察および分析し、22,000倍率32で画像を記録します。
  4. タンパク質の特性評価:RIPAバッファーを使用してEVを溶解し、タンパク質を分離します。BCAタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を測定し、SDS-PAGEにより各サンプルから等量のタンパク質を分離し、電気泳動後にCoomassie青色色素溶液で染色してタンパク質プロファイルを可視化する33,34。
  5. Sシーケンシングと解析:糞便DNA抽出キットを使用して、糞便サンプルからゲノムDNAを抽出します。DNAの完全性と濃度をアガロースゲル電気泳動と分光光度計で評価します。16S rRNA遺伝子のV3 - V4領域をユニバーサルプライマーで増幅し、PCR産物を精製し、定量し、Illuminaプラットフォーム上でシーケンシングします。QIIME2パイプライン35を使用してデータ分析を実行する。
    1. DADA2を使用してアンプリコン配列バリアント(ASV)を分類し、VSEARCHアルゴリズムを使用してSilvaデータベースと照合します。α-Diversity分析を使用して、主にShannon指数やChao1指数などの指標を使用して、サンプル内の種の豊富さと多様性を評価します。β-ダイバーシティ解析は、サンプル間の微生物群集組成を比較し、通常は主座標解析(PCoA)によって視覚化されます。線形判別分析効果サイズ (LEfSe) やボルケーノプロット解析などの差分解析手法を使用して、条件が大きく異なる微生物分類群やグループ間で微生物分類群を特定します。

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結果

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EVの濃度は、異なる分画で測定しました(図2A)。実験結果は、EVの濃度が一連の密度勾配溶液で典型的な正規分布パターンを示すことを示しました(図2B)。具体的には、第9分数では、EVの濃度が最高点(3.85×109)に達しており、EVの主分布分が936である可能性が示唆されている。

タンパク質含有量の測定には、BCAキットを使用して、さまざまな画分中のタンパク質含有量を評価しました(図2C)。この方法では、フラクション9のタンパク質含有量は0.417μg/μLであり、EVの分布をさらに示しています。LPSはグラム陰性菌37,38のユニークな成分であるため、エンドトキシン検出キットもLPSの発現を決定するために使用され(<...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、HSDを投与した塩分感受性ラットの腸内細菌叢EVに焦点を当て、一連の重要な成果を達成しました。まず、HSD上の塩分感受性ラット腸内細菌叢からEVを分離するために、密度勾配遠心分離に基づく効率的な抽出方法の構築に成功し、ほとんどの非EV成分は、細心の注意を払って標準化された動物実験操作およびサンプル処理プロセスを通じて分離されました。密度勾配遠心分離のEV抽出法は、従来の超遠心分離法よりも高効率で再現性が高く、EVの完全性と機能性をより保持できるため、サンプルの品質と研究の実現可能性を確保できます。

第二に、EVはさまざまな動的技術を通じて包括的に識別されました:粒子サイズと濃度の検出は、EVが特定のサイズ分布を持っていることを示しています。LPSおよびBCA測定は、EVのタンパク質含有量とLPS発現を定量化します。TEMは、EVの形態学的構造を明確に示しています。そして、タンパク質の特性がタンパク質のスペクトルを定義します。これらの同定結果は、EVの物理的および生化学的特性を包括的に明らかにし、その後...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある既知の競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国国家自然科学基金会(82205240)、四川省自然科学基金会(2025ZNSFSC1836)、および四川省整形外科病院の臨床基礎プロジェクト(PY202414)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Essential Supplies
心フィルター(10nkDa 2 mL)MilliporeUFC903096
心分離機チュード(50 mL)BKMAN20220404
心分離機チュードBECKMAN COULTERZ30815SCA
真空ろ過システムBiosharp24902581
試薬
色LALエンドトキシンアッセイキットBeyotime022124240705
Coomassie Blue Fast Staining Solution、BeyotimeZ972241010
EDTADamas-betaP3117308
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeA006241112
エタノーKESH
HCl
OptiPrep (60% wt/vol、ヨウジキサノール)血清00124
PBSLabshark130114005
リンホタングステン酸RUIXIN
スクロースダマス ベータP1917057
トリス (VWR)ダマス ベータP3061764
トリパンブルー染色液(0.4%)BeyotimeBD07242904
Equipment
Absorbance Microplate ReaderSpectraMaxABP01690
BiomicroscopeMoticBA210
デジタルデスク遠心分離機CenceCHT210R
デスクトップ高速マイクロ遠心分離機DLABD3024
固定角度アルミニウムローター + 500 mL 遠心カップCence
高精度電子天びんSKRBN-200
層流キャビネット南通湖南科学機器有限公司SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti スイングバケットターン+ SW 32.1 Ti ローターバケットベックマンコールター
透過型電子顕微鏡JEOLJE-1400FLASH
チューブローテーター
超遠心分離機ベックマンコールターオプティマ XE-100
超純水システムULPHWUPR-II-15TNZ
Water-Cieculation 多機能真空ポンプQiang QiangSHZ-D(III)
遠遠遠発、、、ル、

参考文献

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