Pressure Application Measurementを用いたマウスの膝痛覚過敏の評価

サマリー

このプロトコルでは、マウスの膝の痛覚過敏を測定する方法が説明されています。急性膝痛のマウスモデルと変形性関節症(OA)のモデルで例を示しています。

要約

膝の痛覚過敏の評価は、膝の末梢感作を測定するための堅牢なアッセイを提供し、関節炎のげっ歯類モデルで使用できる臨床的に関連する痛み依存性行動を表しています。げっ歯類の膝圧迫に対する反応の閾値を決定するために、いくつかの方法が報告されています。ここでは、既存の方法を適応させて、圧力適用測定(PAM)デバイスを使用して、成体マウスの膝痛覚過敏を評価するための標準化された方法を開発することを目指しました。このプロトコルには、詳細な手順、新しい実験者向けのトレーニングの推奨事項、一貫した結果を達成するためのヒントが含まれています。新しい実験者の最適なトレーニングのための提案を提供します。最後に、一過性痛覚過敏の急性モデルと、慢性疼痛を特徴とする実験的変形性関節症 (OA) モデルの両方について、代表的な結果が提供されます。この分析法は薬理学的介入に対して非常に感度が高いため、サイトカインなどのメディエーターの効果の評価や、ミディアムスループットの薬物スクリーニングアッセイに適しています。要約すると、記載されているアプローチは、膝の痛覚過敏を定量化するための堅牢で臨床的に関連性のある方法を提供します。

概要

変形性関節症(OA)は、関節炎の最も一般的な形態であり、進行性の軟骨分解、滑膜炎、骨リモデリング、骨棘増殖¹を特徴とし、臨床的には痛みや関節機能の喪失として現れます。変形性関節症は、世界の慢性疼痛の主要な原因の1つであり、運動能力の低下や不安やうつ病などの関連する健康問題により、患者の生活に大きな影響を与えています^2,3。変形性疼痛に対して一般的に処方される薬には、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、粘性補充、コルチコステロイド、オピオイドなどがありますが、その有効性は限られており、長期使用は深刻な副作用や依存症のリスクと関連しています^1,4。

近年、大規模なコホート研究が、進行性^OA5中に経験した痛みを注意深く記述しようと試みています。この取り組みの一環として、いくつかの研究がOAの被験者で定量的官能検査(QST)を実施しており、全体的な目標として、感作性を特定し、QST測定値とOAの症状や重症度、および治療への反応との関連を決定することを目標としている(⁷⁾の文献でレビュー)。International Association for the Study of Painは、感作を、侵害受容ニューロンの正常な入力に対する応答性の増加、および/または正常に閾値以下の入力に対する応答の動員と定義しています⁷。感作がOAの慢性疼痛の根底にある重要なプロセスであることがますます明らかになっています。症候性 OA の被験者と対照群を強く区別する QST の所見の 1 つは、疼痛圧閾値 (PPT) の低下です。膝 OA の有無にかかわらず 1,003 人の参加者の PPT 値 (膝と膝から離れた部位の両方) のメタアナリシスでは、OA 患者と対照群との間の PPT の有意な標準平均差 (SMD、平均差を標準偏差で割った値) が報告されました⁸.

OA患者が機械的刺激に対して感作を示すという観察結果は、関節に力が加えられたときに痛みの圧力の閾値が低下することとして現れ、痛みの経路6の変化に起因する末梢および中枢の感作の根本的なメカニズムを示唆^{しています。}これらの変化の分子的および細胞的基盤は、OAのげっ歯類モデルで研究することができます。近年、膝OAのゆっくりと進行する性質をモデル化するために洗練されたマウスモデルが開発されており、このアプローチは、異なる痛みのメカニズムが時間依存的に動作することを明らかにしました。例えば、外科的に誘発された実験的膝関節変形性関節症の過程で、マウスは手術後肢に機械的な異痛症を発症するが、体重負荷の欠損は後期の疾患でのみ明らかになる⁹。

変形性関節症の患者と同様に、実験的変形性関節症のマウスは、実験的膝^OA10の早い段階で膝に加えられる痛みに対する痛みの閾値が低下します。これは、膝神経支配侵害受容器の感作を示しており、これは実際に腰椎後根神経節のin vivoカルシウムイメージングによって視覚化および定量化できます¹¹。膝の痛覚過敏の評価は、末梢感作を測定するための堅牢で比較的簡単なアッセイを提供し、したがって、関節炎のげっ歯類モデルで使用できる臨床的に関連する痛み依存性行動を表しています。げっ歯類の膝圧迫に対する反応の閾値を決定するために、いくつかの方法が報告されています。古い研究では、親指と人差し指の間で膝を圧迫し、動物の主観的な離脱反応または発声反応を記録することが報告されています12,13,14 2007年に、Bartonらは、炎症性関節炎のラットの膝の機械的過敏を記録するための新しい行動技術として圧力適用測定(PAM)を報告しました¹⁵.その後、この方法は、抗原誘発性膝関節炎のマウスで検証されました¹⁶。PAMは、力変換器を使用して、視覚的なフィードバックを提供しながら影響を受けた膝に増加する力を加える技術であり、したがって、再現可能な方法で膝の圧迫を可能にし、その感度と再現性を向上させます。これら以前に発表された2つの研究は、膝の腫れが目立つ炎症性関節炎のモデルに焦点を当てています。したがって、これらの方法^15,16を適応させて、マウスの膝痛覚過敏を評価するための標準化された方法を開発することを目指しました。これは、ここで説明するように、OAのモデルに容易に適用でき、薬理学的介入に非常に敏感です。

プロトコル

すべての実験プロトコルは、ラッシュ大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。説明されているプロトコルは、いずれかの性別の成体 C57BL/6 マウス (10 週間から 2 歳) の機械的刺激に反応して、右膝の膝の痛覚過敏を評価することです。左膝の膝痛覚過敏を測定するには、手を切り替えます。

1. 圧力印加測定(PAM)装置のセットアップ

1. PAMデバイスからコンピューターに1本のケーブルを接続し、PAMデバイスから力変換器に2本目のケーブルを接続します。
2. コンピュータの電源を入れ、PAMソフトウェアを起動します。最大圧力を450gに設定します。
   注:ソフトウェアと小型トランスデューサーは最大500gを測定できます。したがって、実験者は450 gから500 gの間のプラトーを選択できますが、最大カットオフは実験内で変更しないでください。
3. マウスが順応して落ち着くまで、マウスを試験室に15〜30分間放置します。試験室がマウスが収容されている場所とは別の部屋であり、部屋が静かであることを確認してください。研究全体を通して同じテストルームを使用してください。
4. 研究が開始される前にマウスを落ち着かせるために、必要に応じて事前順応を行います - この場合、マウスを左手で保持し、背中を拘束し、4^番目 と5^番目の 指で尾をしっかりと押さえて動物を拘束します。最初の試験日の2日前に、マウスをアッセイに順応させます。与えられた実験内で、すべてのマウスを同じように順応させます。
5. 順応後、マウスが落ち着いていて、拘束したときにしわくちゃにならないことを確認してください。マウスが落ち着いていない場合は、ケージに戻し、テストを数日間延期します。

2. 膝痛覚過敏の測定トレーニング

1. 素朴な動物から始めて、動物が落ち着いているときの反応を認識する方法を学びます。これにより、実験者はそのアッセイの正常な反応が何であるかを認識することができます。
2. 経験豊富なテスターによって膝の痛覚過敏が特徴付けられた実験モデルを使用して、何を期待するかを理解してください。実験的OAでは、反応が急性モデルや炎症モデルよりも明白でない可能性があることを認識してください。
3. 痛みの行動を逆転させるためには、リドカインやオピオイドを使用してください - これは、ストレス反応と実際の痛みに関連する反応の違いをどのように見分けるかを評価するのに役立ちます。
4. すべてのテストは、グループの割り当てを知らされない方法で実行します。車両制御実験で既知の鎮痛薬を使用してOAモデル実験を実行します。テスターがこれらのグループを区別し、再現性のある測定値を取得できることを確認します。
5. トレーニングの完了には数週間かかる場合があります。

3. PAMを用いた膝関節痛覚過敏のベースライン測定

注:炎症性関節炎または変形性関節症の多くの実験モデルは片側性です(たとえば、外科的に誘発された膝OA)。これらのモデルで膝の痛覚過敏を評価するために、テストするすべてのマウスの反対側の膝で膝の離脱閾値を最初に測定します。その後、同側の膝をテストします。一例として、このプロトコルは、DMMによって誘発された実験的OAにおける膝の痛覚過敏の測定に適用できます。このモデルでは、関節の損傷は膝の痛覚過敏を伴い、手術後 2 週目までに発症し、16 週目¹⁷ まで維持されます。

1. 左手でマウスを抱きしめ、背中を拘束し、4^本目 と5^本目の 指で尻尾をしっかりと押さえます。
2. もう一方の手(右手)の人差し指をトランスデューサーのタイに通します(図1A)。次に、トランスデューサー付きの人差し指を透明なビニール袋(サンドイッチバッグなど)に入れます。これにより、マウスの尿などによってトランスデューサーが汚れるのを防ぐことができます。
   注意: トランスデューサーは壊れやすく、液体から保護されていない場合、または高すぎる力が加えられると簡単に壊れます。
3. 右手の親指と中指を使って右足をつかみ、中指で前足を左手の母指球にそっと固定します(図1B)。テスト開始時の膝の正しい位置は、約90°の屈曲です。
4. 膝を90°屈曲させた状態で、右手の親指が膝の外側に触れます。人差し指をトランスデューサーの内側に触れた状態で、ゆっくりと膝に圧力をかけます。コンピューターソフトウェアの指示に従って(グラフの青い線)、一定の速度(30 g / s)、最大450 g、またはマウスが発声、筋肉のけいれん、体のうごめき、ひげの動きなどの痛みに関連する行動を示すまで、力を増加させます。
5. マウスが痛みに関連する動作を示したら、トランスデューサーで指を膝から引っ込め、画面に表示された圧力を記録します(図1C)。450 gに達したときにマウスが痛みに関連する動作を示さない場合でも、トランスデューサーを放し、そのテストの離脱しきい値として450gの値を割り当てます。
   注:個々のマウスは、独自の方法で痛みの反応を表現します。したがって、テスターは、個々のマウスがどの痛みに関連する行動を発現するかを決定する必要があります。しかし、一部のマウスは痛みに関連する行動をまったく示さず、この場合、テスターは、数日後にそのマウスの個々の痛みの反応を決定するために反対側の膝を再テストするか、または同側を測定し続けて行動パターンを決定することができます。後者のオプションは何時間もの経験を必要とするため、初心者には最初のオプションをお勧めします。
6. マウスをケージに戻し、次のマウスのテストに進みます。すべてのマウスで片方の膝をテストしたら、最初のマウスに戻ってテストを繰り返します。各膝を2回テストし、2つのテスト結果の平均を最終結果として取ります。この数値は引き出ししきい値と呼ばれます。
   1. 1^回目 と2^回目の 測定で≥60gの差がある場合は、3^回目の 測定を行い、3回の測定の平均を最終結果とします。マウスにストレスを与えないようにし、同じマウスで複数回連続して測定しないようにしてください。これが、各連続測定の間にある程度の時間が必要である理由です。
7. バイアスを避けるために、ブラインド条件下で膝の痛覚過敏をテストします。個々のイヤータグを使用して、目が見えにくくなります。マウスの行動が痛みを示しているかどうかを判断するには、テスト担当者がマウスの判断を使用する必要があるため、練習、経験、および自信が必要です。これが、実験グループを盲検化することが重要である理由です。

4. 急性膝痛モデルにおける膝痛覚過敏の測定

1. 膝痛覚過敏のベースライン測定後、膝の周りの毛皮を剃ります。
2. イソフルランで動物に麻酔をかけ、つま先のピンチ反射を使用して適切な麻酔を確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。5 μL の Pam3CSK4 (滅菌水に溶解した 1 μg または 3 μg) またはビヒクル制御 (5 μL) を膝蓋腱を介して、30G 針付きのハミルトン注射器を使用して、右膝または左膝の関節内腔に注入します。
3. 盲検条件下で、注射の 1 時間後、2 時間後、4 時間後、6 時間後、および 24 時間後に膝の痛覚過敏を評価します。
4. リドカインの効果を評価するには、リドカイン(生理食塩水で20 mg / kg)または生理食塩水をPam3CSK4の注射の4時間後に関節内に注射します。.次に、0.5 時間後、2 時間後、および 20 時間後に膝の痛覚過敏を評価します。

5. OAの長期モデルにおける膝の痛覚過敏の縦断的評価

1. 12週齢の雄C57BL/6マウスのベースラインの膝痛覚過敏を評価します。
2. ¹⁸で説明されているように、内側半月板(DMM)の不安定化または片方の膝の偽手術を行います。
3. 手術後2週間、4週間、8週間、12週間、16週間で膝の痛覚過敏を評価します。
4. 関節内リドカインの効果を評価するには、DMM の 4 週間後に膝の痛覚過敏を評価し、ステップ 4 で説明したように、リドカイン (5 μL で 20 mg/kg) または生理食塩水をイソフルラン麻酔下で注射します。
5. リドカイン注射の20分後、120分後、および240分後に膝の痛覚過敏を評価します。

結果

急性膝痛のモデルにおける膝痛覚過敏の経時変化
示されているすべての結果は、私たちのグループによって以前に報告されたものであり、詳細な説明については¹⁰を参照してください。最初の例は、急性の一過性膝痛覚過敏を誘発するモデルを示しています。この実験では、合成Toll様受容体2(TLR2)リガンド(1 μgまたは3 μg、滅菌水に溶解)であるPam3CSK4を5 μLで、10週齢のナイーブオスC57BL/6マウスの膝腔に、イソフルラン麻酔下で30G針付きハミルトンシリンジを使用して注入しました。これにより、用量依存的に膝の痛覚過敏が引き起こされ(図2A)、注射の4時間後にピークに達し、24時間でベースラインに戻りました。この行動が関節内侵害受容器によって媒介されることを示すために、Pam3CSK4誘発性膝痛覚過敏のピーク時にリドカイン(200mg/mLの5μL)を関節内に注射する実験を行った。これにより、膝の痛覚過敏が逆転しました...

ディスカッション

マウスにおける膝の痛覚過敏の測定は、実験的関節炎に関連する膝の痛覚過敏を評価するための比較的迅速で簡単な手段を提供します。示されている代表的な結果から観察できるように、このアッセイは急性発症および一過性の痛覚過敏を検出することができます(図2A)。この挙動は、アグリカン断片¹⁰、ニューロトロフィン、神経成長因子(NGF)¹⁹、TLR4リガンドであるリポ多糖(LPS)²⁰など、膝関節に注入されたいくつかのメディエーターに応答して報告されています。重要なことに、図3Aに示すように、このアッセイは、実験的OAのモデルにおける膝の痛覚過敏の縦断的モニタリングに使用できます。これは、半月板部分切除術モデル^21,22<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C-Cケモカイン2受容体アンタゴニスト(CCR2RA)	トクリス	RS 504393
コンピュータ(あらゆるタイプ)			Windows 7の最低限の対応
リドカイン	シグマ	L5647
圧力適用測定(P.A.M)	ウーゴ・バジレ	38500	トランスデューサー、コンピューター、ケーブルが付属しています
サンドイッチバッグ	ホールフードマーケット	6-1/2 x 5-7/8	トランスデューサーを覆う
トール様受容体2リガンド Pam3CSK4	インビトロジェン	TLRL-PMS