蛍光顕微鏡を用いた脂質二重層中の単一タンパク質の追跡

Summary

本記事では、固体支持脂質二重層における単一タンパク質追跡用のサンプル作成方法を詳しく説明します。また、単一分子感度と高速フレームレートを持つシンプルな蛍光顕微鏡の説明もします。最後に、単一タンパク質の軌跡抽出手順を概説します。

Abstract

直接観察は科学的発見と理解の基本的な方法です。タイムラプス単一分子蛍光イメージングは、個々のタンパク質が動き、周囲と相互作用する様子を観察し、通常はアンサンブル測定では隠れている状態を可視化します。単一タンパク質トラッキングは特に膜タンパク質の研究に適しており、その二次元特性により単一蛍光素感度を持つ高速かつ広視野のイメージングが可能です。膜貫通や末梢膜タンパク質(例えば細胞膜や様々な細胞型の細胞内小器官の膜など)が見られる膜を模倣した人工脂質二重層を使用することで、近天然環境における特定の相互作用を測定することが可能になります。また、蛍光やラマン散乱による背景干渉を抑制しつつ、一度に一つの成分ずつ複雑さを段階的に加えることも可能にします。温度制御を加えることで、単一粒子相互作用の熱力学的性質も決定することが可能になります。本研究では、Aquaporin-4を用いたサンプル準備、データ収集、単一分子蛍光追跡、脂質二重層における膜タンパク質軌跡解析のプロトコルを記述します。この研究は基礎的な例であり、異なるタンパク質や二重層組成に適応可能です。

Introduction

自然な生物学的条件下では、膜タンパク質は広範な相互作用ネットワークに囲まれており、これには他の膜タンパク質、細胞内外液体中のタンパク質、さまざまな種類の脂質やコレステロール、基質や配位子、溶液相互作用、細胞外および細胞内マトリックスの相互作用が含まれます。特定の相互作用や集合的な相互作用をよりよく理解するための古典的な生物物理学的アプローチは、まず単一の要素から始まり、徐々に一つずつ追加の要素を加え、複雑さが自然環境を反映するまで進めていく――いわゆる「分断・征服」アプローチです。これらの相互作用を研究する現代の分子スケールの方法は、タイムラプス単一分子蛍光イメージングを用いて直接観察し、個々のタンパク質が移動し環境と相互作用する様子を追跡することです。本論文では、このアプローチの基本的なステップ、すなわち石英カバースリップ上での脂質二重層の形成と、これらのあらかじめ作成された二重層に大型膜タンパク質を単一タンパク質イメージングに適した方法で挿入することについて説明します。その後、支持された二重層の単一タンパク質を追跡するための「作業用」プロトコルが導入されます。

本記事では、親水性の石英カバースリップ上で破裂する小さなユニラメラー小胞(SUV)を用いて固体支持脂質二重層の作製方法を説明しています。石英の表面は酸洗浄または紫外線(UV)オゾン浄化で処理されます。SUVを作るために用いられる脂質は、可能な限り対象の生体膜の主要な化学組成と一致すべきです(例:アストロサイトの細胞膜にアクアポリン4(AQP4)が存在し、主要成分はPOPC(46.4%)、POPE(8.5%)、PS(5.6%)、コレステロール(30%)、PI(2.5%)、SM(5.6^%)です1,2)。固体基質との相互作用を防ぐために、ポリエチレングリコール(PEG)などの添加剤を脂質に接ぎ木することで二層^{が表面から}持ち上げられます^3,4。各添加剤の量は、タンパク質の拡散が妨げられないように慎重に調整しつつ、膜を基質表面から持ち上げるのに十分な支持も提供する必要があります。PEG化脂質のような添加物は通常、「ブラシ期」と「キノコ期」の2つの相を示します。ブラシ相はPEGが高濃度にあるときに起こり、立体障害を減らすためにポリマーが直立します。キノコ相は低濃度で発生し、ポリマーが十分に分離されてランダムなコイルとして存在します。一般的に、ブラシフェーズは拡散を妨げますが、キノコフェーズはほとんどサポートしません。ブラシとキノコ相の集中は最適であり、拡散への影響を最小限に抑えつつサポート^{を提供します。}

一部の膜タンパク質は、P450sやシトクロムP450還元酵素5のように固体支持された脂質膜に自然挿入^{されますが、}他のタンパク質は洗剤を用いて挿入する繊細なプロセスです。これらの洗剤や、単一タンパク質追跡を妨げる可能性のある未取り込みタンパク質を取り除くためには慎重な洗浄が必要です。このプロセスについては詳細に説明します。本記事の主な焦点は、タイムラプス蛍光イメージングを用いた単一分子追跡(SMT)用サンプルの準備です。これには高倍率かつ数値開口(NA)を持つ対物レンズが必要で、通常は100倍および1.45ナマの油浸^{け物レンズ6,7}。また、高速で高感度のカメラ(EMCCD、CMOS、またはICCDカメラ)とレーザー励起も必要です。レーザー励起は、長いタンパク質軌道を測定できる十分な視野角をカバーする必要があり、これはしばしば全内反射を利用して約50μm×100μmのエバネッセントフィールドを作るか、ビームシェイピングオプティクス(ガウスからトップハットまで約80μm×80μm)を用いたエピ照明^、またはTIRFに似た磁場を持つ高傾角・積層光学シート(HILO)を用いて実現されます。全反射蛍光(TIRF)顕微鏡は、背景信号を低減するという利点があります。以下に、シンプルで比較的安価なTIRF顕微鏡の設計を示します。温度制御を加えることで、エンタルピー、エントロピー、ギブス自由^{エネルギー9}などの熱力学的性質を測定することが可能です。この技術はまた、ほとんどの膜タンパク質に蛍光タグを付与する程度の蛍光標識も必要とします。

本記事で注目する膜貫通タンパク質はAQP4です。AQP4は、アストロサイトや中枢神経系の血管系の他の領域の末端足で分極した水路^です。1秒間に最大30億の水分子を運搬し、水の恒常性、細胞移動、脳の浮腫、学習、シナプス可塑性を通じた記憶形成に関与しています¹¹。AQP4機能の調節障害は、脳浮腫、視神経脊髄炎、てんかんなど、さまざまな神経疾患と関連しています(12,13,14,15)。AQP4はアイソフォームによりますが32〜37 kDのタンパク質で、四量体構造を持ち、8つの疎水性膜ドメインが結合ループでつながっています。細胞内N末端ドメイン、そして大きな細胞内C末端ドメイン¹⁶が連結されています。AQP4には主に2つのアイソフォーム、M1とM23があります。この違いは、メチオニン1残基またはメチオニン23残基での開始に起因します。研究によれば、M1アイソフォームはパルミトイル^{化状態に応じて}二対または三位一体を形成できることが示されています。M23アイソフォームは、直交粒子アレイ(OAPs)と呼ばれる大きなタンパク質集合体に組み立てられます。共発現すると、M1アイソフォームは外側の17,18,19周りに末梢タンパク質コーティングを形成し、OAPの成長を抑制します。OAPの凝集の動態は、脳内の水の透過性と恒常性の調節において重要な要因である可能性があります。本記事では、膜内の個々のAQP4を追跡し、単一タンパク質間相互作用を観察するための必要な手順を説明します。

Protocol

1. 小さな一層状小胞の調製

1. 冷凍庫から脂質ストック溶液を取り出し、室温にします。
2. オーブンから10mLのきれいなフラスコを取り出し、室温まで冷ます。
3. 冷却した丸底フラスコに分光グレードのクロロホルム900 μLと分光グレードのメタノール100 μLを加え、ブレンド中の各脂質を適切な量に加えます。フラスコをくるくると回して脂質がよく混ざっているか確認します。
   注:他の著者はクロロホルムとメタノールの比率を異なるものにしていますが、均一な脂質ケーキ形成に最適な比率は9:1であることがわかっています。
   補 足ファイル1には、脂質の正確な量を計算するためのスプレッドシートが提供されています。基質表面での脂質二重層形成を確認するために脂質を準備する場合は、蛍光標識された脂質を使用します。
4. 図1に示すように、丸底フラスコの上に真空蒸留コネクタを置き、窒素ライン(乾燥装置)に接続します。
   注意:精製されたN₂(g)を使用し、乾燥装置に接続する前に0.22μmのフィルターに通してください。
5. N₂(g)をオンにして圧力を調整し、手の甲でほとんど感じない程度に流れを調整します。
   注意:手の甲を濡らすことで蒸発を感じやすくなります。
6. N₂(g)の流量で2.5〜3時間乾燥させ、窒素の流れが続くか定期的に確認します。サンプルは最初の30分以内に乾燥したように見えるでしょう。ただし、残った溶媒を除去するためにさらに2〜2.5時間窒素を流し続けてください。
   注:サンプルは一晩乾燥させることも可能です。
7. 丸底フラスコに脂質総5.0μmolごとに1mLのバッファーを加えます。
   注:本研究で使用されたバッファーは100 mM HEPES、5 mM CaCl₂、140 mM NaClで構成されていました。これは試料の準備全体で使われるバッファーと同じものです。
8. フラスコにガラス栓を当て、パラフィンフィルムで包みます。
9. フラスコをリングスタンドのクランプに入れ、60°Cに設定したソニケーターの浴槽にフラスコの底を浸します。 フラスコを1時間培養し、15分ごとに優しく渦巻きさせて多層リポソームを作り、脂質が付着していない不透明な溶液のようになります。
10. 1時間のインキュベーション後、ソニケーター(~35kHz)を起動し、振幅を最高設定に設定します。次に、フラスコを浴槽内で動かして、溶液がフラスコ内で衝突し噴き出すように最も激しい攪拌が起こる位置を見つけます。ソニック酸を30分間使って、不透明から透明でややオパール色に変化を求めています。
11. フラスコから脂質溶液を取り出し、マイクロ遠心分離機のチューブに入れ、その後100,000 × g で4°Cで1時間遠心分離します。 マイクロ遠心分離機チューブから上清液を取り出します。
    注意:チューブの底に小さなペレットが形成されることがあります。ペレットが大きい場合は捨てて同じことを繰り返します。
12. 遠心分離後にSUVを使い、4°Cで1週間保存するか、トレハロースと共に-80°Cで保管してください。
    注意:トレハロースの推奨量は脂質溶液1mLあたり1mgです。最適な結果を得るために、新しいSUVは毎週製造し、冷蔵庫で保管することができます。
    注意:これはSUVの準備方法の一つに過ぎません。SUV以外にも、押出成形または巨大ユニラメラーリポソームを電鋳によって製造できる小、中、大のユニラメラー小胞(20,21,22,23)。

2. タンパク質標識

注:NHSエステルやマレイミドなど様々な共役物質を用いた蛍光プローブによるタンパク質標識は、よく知られている。しかし、標識度(DOL)は単一タンパク質トラッキングにおいて特に重要です。本研究では、各AQP4テトラマーにおける膜貫通タンパク質の標識率と蛍光色体の分布を明らかにすることが不可欠でした。

1. 0.22μmフィルターを通したpH8.3の0.1Mリン酸バッファーを入れたビーカーに透析管を入れます。その後、バッファー内で逆さまの状態で一晩置き、膜が調整されるのを待ちます。
2. 翌日、透析管内のバッファーをタンパク質溶液に置き換えます。
   注意:タンパク質溶液の体積は20〜250μL以内に収めるべきです。溶液中に溶けたタンパク質は約1〜5mg含むべきです。
3. タンパク質を透析チューブに入れたら、0.1 Mリン酸バッファーで逆さまに一晩置きます。
4. 透析後、タンパク質をマイクロ遠心分離機チューブに移します。
5. 新しい透析チューブを準備するには、ステップ2.1を繰り返します。
6. NHS染料を製製するには、少量の粒(3〜4粒)を小さな計量紙に置き、1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移し、100 μLのDSMOに溶かします。続いてDMSOで10倍の10倍希釈を2回行い、最終希釈でUV-vis分光法で各サンプルの濃度を決定します。平均DOLを2〜3にするには、活性色素を3モル過剰にタンパク質溶液に加え、優しく振ってください。
   注意:標準的なUV-vis分光計で十分ですが、サンプルサイズのため小体積分光器が有利です。
7. 反応性染料をタンパク質を等量のマイクロ遠心分離チューブに加えます。活性染料とタンパク質が加わったら、最低8時間はナテージしてください。
8. ナテーションの後、標識付きタンパク質をステップ2.5で準備した透析管に移し、新鮮なリン酸塩緩衝液を入れたビーカーに入れます。バッファーにスターターバーを入れて6時間ほど優しく回し、その後バッファーを入れ替えてさらに6時間透析を行います。
9. バッファーを2回交換した後、標識されたタンパク質を含む透析チューブを、最終的な動作バッファーを入れた清潔なビーカーに入れます。
   注:本研究で使用された最終作業バッファーは、pH7.4の100 mM HEPES、5 mM CaCl₂、140 mM NaClで構成されていました。
10. 透析後、UV-vis分光器でDOLを測定します。
    注意:DOLの測定には標準的な方法に従うことが重要です。以下は計算のための方程式です。
    (1)
    ここで、染料のピークで測定される吸収度は 、280 nmのタンパク質ピークは です。タンパク質の消光係数は (タンパク質の分子量から計算)で、染料メーカーが提供するもの と です。

3. 直径25mmの石英カバースリップの準備

注:以下に2つの異なる方法を示します:

1. 酸洗い
   注:ピラニアやベースエッチを含むいくつかの公開された酸洗い手順があります。以下の手法はエッチングなしで非常にクリーンで親水性の高い表面を提供し、蛍光イメージングを用いた単一分子研究に適していることがわかりました。
   1. 酸洗浄法は、溶液を加熱しながら排気フードとPPE(ゴーグル、白衣、手袋)が必要です。こぼれた場合に備えて、ボンネット内に炭酸水素ナトリウムのスカートボトルを用意しておくべきです。
   2. カバースリップをビーカーに入れ、ナノピュアウォーター、過酸化水素30%、濃硝酸を等量(1:1:1)で満たします。
   3. この溶液でカバースリップを30分間加熱し、溶液が泡立ち始めるまで加熱します。
   4. 溶液を確認し、カバースリップがくっつかないように10分ごとに優しく回して混ぜます。溶液を回す際には、スリップが離れてから分離する様子を観察してください。分離したら徐々に速度を落とし、泡立つ溶液がスリップを包み込むようにして距離を保ちます。
      注意:溶液はあまり強く加熱しないでください。反応によって熱が生じます。ホットプレートを穏やかに泡立つように調整し、通常は最低設定にします。この設定では溶液は~70°Cのままです。 新鮮な過酸化水素も推奨されます。
   5. 30分経過するか、溶液の泡立ちが止まったら、1:1:1の溶液を室温まで冷まし、その後、精製水で優しくかき混ぜてカバースリップをしっかりすすいでください。
2. UVオゾン
   1. 水晶のカバースリップは N-ヘキサン、次にメタノールで、レンズティッシュを使って洗浄してください。
   2. カバースリップをUVオゾンクリーナーに入れ、処理対象の表面をランプの方を向けるようにします。
   3. 酸素を5psiでチャンバーに5分間流します。それから酸素の流れを止めます。
   4. 次に、UVライトを15分間点灯し、カバースリップを最低10分間置いてオゾンを逃がします。
   5. どちらの掃除方法を使ったら、すぐに掃除済みのカバースリップを使いましょう。以前に清掃したスリップを使用する場合は、この工程を繰り返して表面を再生します。
      注意:紫外線オゾン化は、空気中のオゾンを除去するために一定の循環が必要です。システムはエアハンドリングスノーケル下かフュームフード内に設置されるべきです。

4. 二重層形成とAQP4の二重層膜への組み込み

注:本研究で使用されたバッファーは、pH7.4の100 mM HEPES、5 mM CaCl₂、140 mM NaClで構成されていました。

1. 新しく洗浄したカバースリップを1/4インチのSM1レンズチューブを使って25mmのサンプルホルダーに入れます。次に、直径8mmの二層パラフィルムガスケットを切断し、サンプルホルダーの中央に位置させます( 図3参照)。
2. 8mmガスケットの中心に50μLのSUV液滴を塗布し、密封し、37°Cで1時間培養します。
   注:これによりリポソームは親水性の石英表面と融合し破裂し、連続した二重層を形成します。
   ガスケット面積に加えられるリポソームの量はさまざまであり、ガスケットが大きいほど連続した二重層を形成するためにより多くのリポソームが必要になることがあります。しかし、ステップ4.2で指定された量はほぼ常に連続二重層の形成を促進します。
3. 培養後、ピペットで溶液を洗い流します。次に、2層に50μLの新鮮バッファーを加えます。そして、このプロセスを合計10回繰り返します。
   注意:ピペットの先端が脂質二重層に触れないこと、そして二重層を水分補給するために何らかの溶液が残っていることが重要です。先端を滴の上部に当てると、接触するのが見えます。液滴表面との接触を最小限に保つことで、二層を傷つけずに溶液を除去できます。最終的に、その滴は反転し、ガスケットに向かって吸い上げます。このタイミングで溶液の除去をやめるのが最適です。この時点で反射光が変化し、停止の合図として機能します。もし溶液を過剰に除去しすぎるのが心配なら、洗浄時にピペットの設定を下げて脂質二重層の上に適度なバッファーを残してください。
   これらの条件下での脂質二重層形成の完全性は、光漂白後の蛍光回復法(FRAP)を用いて事前に評価できます。これには脂質混合物中に蛍光標識が6,7,24,25と表示される成分が必要です。
4. 最終洗浄が終わった後、再びバッファーを取り出し、臨界ミセラー濃度以下の目的タンパク質を50μLのアリコートを洗剤に加えます。37°Cで少なくとも1時間はタンパク質を取り込みます。
   注意:洗剤は二層を優しく柔らかくし、タンパク質が膜に取り込まれるのを助けます。このプロトコルで使用された洗剤は50μM n-ドデシル-ベータ-D-チオマルトシド(DOTM)で、非イオン性洗剤で、タンパク質濃度は2 nMでした。
5. 1時間後、バッファーでサンプルをすすいで未混入のタンパク質や洗剤を取り除きます。
6. サンプルにコンディショナルポリスチレンビーズ(バイオビーズ)を5mg加え、最低1時間放置してから取り出します。その後、サンプルは画像診断の準備が整います(下記参照)。

5. アンチフェード加成剤

1. Trolox 5mgとD-グルコース80mgを10 mLのバッファーに溶かします(上記参照)。固形物が残らないまで振って渦巻きます。暗闇の中で一晩ナテートし、その後0.22μmフィルターで溶液をろ過します。毎週新鮮な準備をしてください。
2. グルコースオキシダーゼ6.5mg(1650 U)とカタラーゼ8 μL(バッファー中29,200 U/mL)を92 μLバッファーに溶かします。溶液を渦巻かずに優しく混ぜ、遠心分離機で上清液を新しいチューブに移します。4°Cで保存し、光から守ってください。
   注意:この溶液は冷蔵庫で数ヶ月保存可能です。しかし、もやができたら捨てて新しい溶液を用意してください。
3. 5.1の溶液99μLとステップ5.2の1μLを新しいチューブに混ぜます。サンプルの最終洗浄後、サンプルの上にアンチフェード溶液(イメージングソリューションと呼ばれる)を加えます。
   注:アンチフェード溶液は膜貫通タンパク質の機能を変化させることがあります。システムとの互換性を確認することが重要です。

6. 顕微鏡のセットアップと設定

注:この単一分子研究にはカスタムのTIRF顕微鏡が使用されました。このセクションでは、信頼性の高い機器である高速タイムラプスイメージングに適した基本的な蛍光顕微鏡(図4)の主な構成要素と主要なアライメント技術について説明します。

1. 633nmのHe:Neレーザーを使って試料を励起します。レーザーはバンドパスフィルターと1/4波長板を通過し、レーザー線を精細化し、励起を線偏光から円偏光に変換します。
   注:円偏波はプローブの向きの影響を軽減します。
2. ビームは300mmレンズと633nmレーザーラインフィルターを通過し、633nmの長パス二色鏡で反射し、100倍1.45N/Aの油用顕微鏡の背面にピントを合わせます。ビームを合わせて、対物レンズの中心を滑らかに通過し、対物レンズを出るときにまっすぐ保つようにしてください。
   注:この時点で顕微鏡はエピ蛍光(epi)用に設定されています。底が透明なキュベットに少量の粉ミルクを加えることができます。その後、キュベットを顕微鏡対物鏡の上に置き、その間に浸漬油を一滴置きます。これにより、ビームが対物レンズをまっすぐ通過していることを観察できます。
3. 蛍光標識されたタンパク質からの放射は対物鏡、二色性ミラー、ロングパスフィルター、300mmレンズを通過し、EMCCDカメラに映像化されます。より長い焦点距離のチューブレンズを使用してカメラの画像を拡大し、超局在精度を高めることで、遅い膜貫通タンパク質や凝集体に有益です。カメラのピクセルはナノメートル単位でキャリブレーションすることを忘れないでください。
   注意:ただし、対物レンズメーカーが指定したチューブレンズでは1倍倍の倍率が得られ、蛍光をより少ないピクセルに集めることで信号対雑音比が向上します。一般的な焦点距離には200mm、180mm、165mm、164.5mmのレンズがあります。1951年製のアメリカ空軍の拡大ターゲットの使用をおすすめします。このセットアップで300mmレンズを用いると、合計倍率170倍で74 nmのピクセルキャリブレーションが測定されました。
4. 対物レンズカラーとペルティエヒーター/チ^ラー26を備えたサンプルホルダーを使って試料の温度を制御します。
   注:顕微鏡の熱的安定性を確保し、温度依存の正確な測定や機器の焦点合わせを可能にするために、安定した温度を維持することが重要です。
5. 圧電アクチュエータは試料をXYZ方向に動かします。試料がピントが合ったら、最終旋回ミラーに取り付けたステージを使って、ビームを顕微鏡対物レンズの端( 図4参照)に調整し、臨界角に達するまで調整します。これによりエバネッセント励起場が生成されます。顕微鏡は現在TIRFにセットされています。
   注意:レーザーからの逆反射が点ではなく線であり、試料の背景が強度が減少し伸びる場合、顕微鏡がTIRFに属していることを判明できます。

7. データ収集

注意:カメラは迅速なデータ収集のためにセットアップされている必要があります。

1. 垂直ピクセルシフト速度を約600 nsに設定し、垂直クロック電圧(通常+4)をオーバークロックします。次に、水平ピクセル読み取りを最大設定(この例では16ビットで30 MHz)に設定します。プリアンプのゲインを2に調整し、アンプ出力を電子増幅用に設定します。最後に、電子増幅器利得を最高レベルに設定します。
2. 露光を25msに設定してください。25 ms露出時は、フレームレートをやや長くしてください(ここで使ったカメラでは25.802 ms)。
3. レーザー出力を調整して、信号が背景より明確に上がるようにしてください。
   注意:レーザー出力の調整は難しい場合があります。高すぎるとプローブが急速に漂白してしまう。低すぎると信号対雑音比の高さでトラッキングが難しくなります。信号が最も弱い粒子に対しては、信号が背景の3〜5倍を超えるように出力を設定することをおすすめします。第2節では、分子の明るさが分布を示す理由を説明します。
4. サンプルごとに少なくとも1,000トラックを提供するのに十分なデータを収集してください。

8. 追跡分析

注:当研究室では、単一粒子追跡解析は通常、CrockerとGrierの研究を基にしたMATLABのカスタムスクリプトを用いて行われ、著者^3,26,27によって修正されています。以下は、研究コミュニティ向けに無料で提供されているソフトウェアImageJの使用例です。どちらの方法も同じ結果をもたらします。

9. データ処理

注:ここでは代表的なデータの処理方法とステップサイズ分布の計算方法、平均拡散定数の取得方法について説明しています。

1. 画像スタックをFIJIにドラッグ&ドロップします。次にキャリブレーション(74 nm/ピクセル)を適用します。
2. 背景を5ピクセル幅のローリングボール減算法で差し引いてください。フィールドを4つの11μm×11μmの区画にトリミングし、別々に分析します。
   注:これは膜タンパク質を追跡する際の励起場による閾値分散を最小限に抑えるためです。
3. TrackMateプラグインを起動してください。キャリブレーションがピクセルに適用されているか(補足ファイル3参照)、時間が望ましい範囲を満たしているかを確認してください。
   1. TrackMateでは、粒子検出方法としてガウスラプラシアン(LoG)を選択し、前処理中央値フィルターを用いて直径350nmと推定します。検出された粒子が合理的かどうかを確認するために プレビュー ボタンをクリックしてください。
      注意:一部の粒子は背景に明確に存在することがあります;これらは心配しないでください。次の段階で排除されます。
   2. カウント設定に満足したら、残りのスタックを処理し、その後閾値化を行います。自動閾値設定を使うか、選択ボックスをドラッグして閾値を調整してください。
   3. 検出された粒子の可視化方法を選択した後、このデータセットに対してトラッキング方法「Advanced Kalman Tracker」を選択し、以下の設定で探索半径は350 nm、最大フレームギャップは2フレームです。
      注意:ペナルティ、線路分割、線路合流の追加も可能です。このデータセットでは追跡のみが行われました。
   4. トラックをどのようにフィルタリングし、視覚化するかを決めましょう。
      注:このデータセットでは検出された斑点のみが表示されます(補 足ファイル4参照)。
   5. 個々のトラックを処理した後、追跡データをXMLファイルとしてエクスポートし、スプレッドシート編集ソフトで使用します(補 足ファイル5参照)。

Results

プロトコル第2節で説明されているように、リジンは蛍光染料分子(NHS-dye)に結合したNHSエステルを用いて標識されました。タンパク質に結合した後、UV-Vis分光計でDOLを測定します。この実験では、AQP4テトラマーのDOLは4.12でした。次に、以下のポアソン分布を用いて、各AQP4テトラマーが少なくとも1つの染料分子を持つ確率を算出します。

(2)

ここでPは各AQP4が標識される確率であり、式 2を用いると、各AQP4テトラマーに蛍光標識が付いている確率は98%となります。四面体ごとのラベル分布は 図2 に示されており、試料で観察された明るさ分布を反映しています。

この例のデータで達成された信号対雑音比は、単一の蛍光色素で背景より8〜9倍、最も明るい粒子では15〜20倍以上でした。この分散は励起ビーム内の位置とプロトコルステップ2で記述されたDOLによるものです。

生成されたXMLファイル内で、関心のある列はJ、K、L、Mで、それぞれパーティクル番号ID、粒子が検出されたフレーム、粒子のX位置、Y位置に対応します(補 足ファイル6参照)。ファイルの2枚目のシートでは、ステップサイズ分布と平均拡散係数が計算されており、ステップサイズは粒子がフレーム間で移動する距離を表し、平均拡散は式 3で与えられます。

(3)

ここで D_ave は平均拡散係数、Δt はフレームレートです。この式はブラウン運動を仮定しており、これは一般的に小さな変位に対して有効であり、個々のトラック^3、30、31のサンプルから平均二乗変位と時間タグを解析することで確認できます。

ステップサイズのヒストグラムは拡散する粒子の分布を示しており、これは異なるサイズのOAPに起因します(図5)。

図1:脂質乾燥装置。 装置は真空蒸留コネクタを備えた10 mLの丸底フラスコで構成されています。窒素は低圧で0.2μmのシリンジフィルターを通過し、黄色い合成キャップに針が取り付けられ、真空蒸留コネクタに接続されています。圧力は、切断された針付きの注射器に取り付けられたタイゴンチューブを通じて解放されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:各AQP4ユニットにおける蛍光ラベルの期待分布を式2を用いて示す。 最も可能性の高い蛍光分子の数は4つであり、AQP4の98%が蛍光ラベルを持っています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:サンプルホルダーアセンブリ。 アセンブリは1インチのSM1レンズチューブで作られており、オスのねじ山を取り外して斜めに加工して、顕微鏡対物レンズへの干渉を防いでいます。クォーツのカバースリップとパラフィルムガスケットが含まれています。アセンブリ全体はSM1保持リングで固定されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:顕微鏡。 右側には顕微鏡の簡略図が示されています。緑の線はレーザーからの励起光を示しています。右側からレーザー光は1/4波長板を通過し、300mmレンズで集束されます。光はロングパスの二色性ミラーによって対物レンズに反射され、背面の絞りに焦点が当てられます。並進鏡を使って励起ビームをシフトさせることで、ビームは対物レンズの開口部の端に位置し、試料内にエバネッセント場を作り出します。ピント合いで発せられた光は対物鏡で集められ、赤い線で表されます。放出された光は二色性フィルターを通過し、ロングパスフィルターを経て300mmレンズでカメラに集光され、光学倍率1.7倍(対物レンズとチューブレンズ合わせて合計170倍)を提供します。左側には顕微鏡の画像があります。レーザーの正確な位置を合わせるために追加の旋回ミラーも使用されていることに注意してください。同時に、検出アームは蛍光標識膜貫通タンパク質からの光子の収集を最大化するように配置されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:ステップサイズのヒストグラム。 青い線に赤い円はすべてのステップサイズのヒストグラムです。黒線は複数の拡散係数に適合します。ステップサイズ確率分布は次のように与えられます: ここで_fi は各拡散粒子の分数集団であり、それぞれがブラウン運動を受けると仮定します。ヒストグラムとフィットは、複数のOAPサイズの分布に起因する、遅い粒子と速い粒子の不均一な分布を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足ファイル1:分子濃度、総脂質量、SUV準備用の蛍光/FRAP成分を決定するためのスプレッドシート計算機。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル2:軌跡追跡に使用される単分子蛍光顕微鏡タイムラプス画像スタック(TrackMateチュートリアルのソースファイル)。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル3:処理前の強度と背景を示す生の単一分子蛍光データのアニメーションプレビュー。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル4:フィルタリングされた粒子経路(閾値後)のアニメーションで、時間経過による代表的なAQP4軌道を示します。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル5:TrackMate出力を用いたAQP4分子の全フィールド粒子追跡を示すアニメーションオーバーレイ。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル6:拡散解析に用いられた抽出された軌道座標と計算されたステップサイズ分布を示すスプレッドシート。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

Discussion

本稿では、固体支持された脂質二層膜を通過し相互作用する個々の膜タンパク質を直接観察するための単一粒子追跡法を提案します。AQP4は、異なるアイソフォーム32,33,34によって調節される動的な自己組織化を形成する能力から代表例として選ばれました。上記では、信頼性の高いサンプル調製方法と、ミリ秒単位で単膜タンパク質を追跡するための主要パラメータを概説します。手順は以下の通りです:(1) SUVの準備、(2) 適切な蛍光標識レベルの決定、(3) 固体支持体の準備、(4) 固体支持脂質二重層内で膜貫通タンパク質サンプルの作成、(5) アンチフェード剤の準備、(6) 単純な単一分子顕微鏡の構築、(7) 単一分子追跡データの収集、(8) ImageJを用いた追跡データの解析。

説明されたステップバイステップの方法は概念的には単純です。しかし、それぞれの重要なステップには独自の落とし穴や限界があります。その中でも、試料の準備が最も難しい(ステップ1〜5)。したがって、いくつかの細かい点を念頭に置く必要があります。まず、固体支持脂質二重層の作り方です。主な方法は3つあります:(1)ラングミュア・ブロジェット(LB)、(2)SUVの融合および破裂、(3)スピンコーティング^{35、36、37、38、39}。それぞれの方法には利点と欠点があります。例えば、ラングミュア・ブロジェット法は二層の性質や化学組成をより細かく制御し、二つのリーフレット間の非対称組成も含め、制御された方法で多層の形成を可能にします。しかし、LBトラフの使用は技術的に要求が高く、時間もかかり、³⁵個の取得にはコストもかかります。スピンコーティングは脂質二重層を作る比較的単純な技術です。しかし、多層を生み出しやすく、しばしば非現実的なほど大量の材料が必要^{となります。}小胞融合と破裂は、少量の材料で済む単純なプロセスです。しかし、親水性表面の形成は重要であり、脂質組成によっては小胞融合によって二重層を形成しやすいものもあります(例:私たちの研究室では、純に負の電荷を持つ小胞は、二価陽イオンの付加と長い培養時間を加えただけで二重層を形成することがわかりました)⁴⁰。親水性表面の確立(ステップ3)に加え、小胞融合によって固体支持二重層を形成する際の重要な考慮点として、膜タンパク質を取り込む前後に新たに形成された二重層を洗浄することです。挿入前の洗浄は余分なSUVおよび大きな多層状小胞(MLV)を除去し、膜挿入後の最終洗浄は未取り込みタンパク質を除去します。洗浄が不十分だと、追跡研究中にバックグラウンド信号が入ることがあります。

C12E9、Tween-20、TritonX-100など、多数の洗剤をスクリーニングし、固体支持脂質二重層への膜貫通タンパク質挿入に適しているかを判断しました。私たちの好む洗剤はDOTMで、取り外しが簡単で膜に最も優しく(膜の強度を損なう可能性が低い)、タンパク質の量は非常に重要です。多すぎると単線の観測は不可能になります。この手法を他の膜貫通タンパク質に適応させる際には、試行錯誤を通じて量を調整しなければなりません。しかし、この手順で示される量は優れた出発点となります。洗剤の量は臨界ミセラー濃度以下に保たなければなりません。そうでなければ、二層は溶解して石英基質から除去されます。

支持する脂質二重層への膜タンパク質の挿入は、各実験条件に応じて最適化される必要があります。しかし、これを達成するための一般的な方法としては、プロテオリポソームの使用や、膜タンパク質をあらかじめ形成された二重層⁴¹に直接取り込む方法などがあります。プロテオリポソームとは、SUVのようなリポソームにタンパク質が埋め込まれたものを指します。これらのプロテオリポソームは、あらかじめ形成された固体支持脂質二重層と融合するか、二重層形成⁴²の際にSUVと同時に組み込まれることもあります。融合によって破裂が生じ、タンパク質が膜に放出されます。実装は簡単ですが、膜タンパク質の配向がランダムになります。これにより固体支持体との強い相互作用が生じ、タンパク質の配向によって異なる拡散特性が生じることがあります^。このプロトコルは、直接組み込みを利用し、タンパク質2,5,43,44の片側に大きな親水性ドメインを持つAQP4および他の膜タンパク質に対する配向的好転を示しています。

直接観察は科学的発見において用いられる強力なツールです。動的単一分子イメージングは、個々のタンパク質の運動や相互作用を観察することで、タンパク質の挙動をより正確に記述する仮説を検証したり、新たな仮説を生み出したりする膜タンパク質生物物理学において特に重要です。ここで説明するプロトコルと方法は、二次元の固体支持脂質二重層に理想的ですが、複数成分を持つより複雑な環境(^2、生細胞34,45,46,47、3次元⁴⁸)にも拡張可能です。単一分子トラッキングは、二色単一分子トラッキング⁴⁹、単一分子FRET^50,51、確率光学再構築顕微鏡(STORM)や点蓄積イメージングナノスケールトポグラフィー(PAINT)などの動的超分解能イメージングなど、多くの実験への扉を開きます。温度制御を含む装置を拡張することで、膜タンパク質の熱力学的性質も探求^{できます。}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4波面板	ソーラブ	WPQ05M-633	レーザーの色を合わせてください
100Xオイル・オブジェクティブ	オリンポス	12-563-659	1.45 N/A アポクロマティック
16:0-18:1 PC	アヴァンティ極性脂質	850457	POPC リン脂質
18:0 PEG2000体育	アヴァンティ極性脂質	880210	アンモニウムソルト
300mmレンズ	ソーラブ	AC254-300-A-ML
633 nm He:Neレーザー	メレス・グリオ	05-LHP-927	他の光源や波長に変更することも可能です
633nmバンドパスフィルター	クロマテック	633/10X	使用されているレーザーとのマッチング
655nmロングパスフィルター	クロマテック	ET655LP	染料やレーザーの波長に合わせて変更してください
アンドール・ソリス1世	アンドール	アンドール・ソリス1世	画像キャプチャ用のソフトウェア
ATTO 655	ATTO-TEC	西暦655年	NHS-エステル修飾法は、単一分子の加工に適した修飾された染料なら何でも使用できます。ATTOが推奨されますが、Cy5/7も使用可能です
バイオビーズ SM-2 レジン	バイオラッド	1523922
塩化カルシウム	ミリポール・シグマ	C4901
カタラーゼ	シグマ・オルドリッチ	C3155-50MG	牛肝臓、水溶液、およびGeから;30000単位/mg
クロロホルム	フィッシャー・サイエンティフィック	C547-1	HPLCまたは分光グレード
コレステロール	シグマ・オルドリッチ	C8667-500MG
カバースリップ	ESCO オプティクス	R525000	25mmクォーツ
二色性ビームスプリッター	セムロック	FF545/650-Di01-25x36	染料やレーザーの波長に合わせて変更してください
EMCCDカメラ	アンドール	iXon Ultra 888
ファルコンチューブ 15mL	グライナー・バイオワン	188261	Cellestar細胞培養チューブ
グルコース酸化酵素	シグマ・オルドリッチ	G2133-50KU	アスペルギルス・ニジェール、タイプVIIおよび100000単位/g固体(酸素添加なし)
ヒートガン	ハーバー・フレイト	56434	パラフィルムの加熱に使用され、一般的にどんなヒートガンでも使用可能でした
ヘペス	フィッシャー・バイオリエージェント	BP310-500
低自己蛍光浸漬油	ソーラブ	MOIL-30
メトナール	フィッシャー・サイエンティフィック	A452-1	HPLCまたは分光グレード
マイクロ遠心分離管	VMR	525-1126	1.5 mL
マイクロピペッター	エペンドルフ		さまざまです;1000 & micro;L、100 & micro;Lおよび10およびマイクロ;Lは推奨されています
Ø1.5インチレンズチューブ	ソーラブ	SM1.5L10	外ネジ山はサンプル準備のために削り取られます
光学表	ニューポート	RPRリライアンス	tabelの大きさは利用可能なスペースに依存します
光学組織	ソーラブ	MC-50E	各種部品の清掃
パラフィルム	ミリポール・シグマ	P7669	プロセス中にガスの蛍光が出ていないか確認してください
圧電アクチュエータ	ニューポート	PZA12
空気圧振動アイソレータ	ニューポート	I-2000シリーズ	光学テーブルの不均一さを安定化するために使用され、nbsp;
冷蔵浴	フィッシャー・サイエンティフィック	アイソテンプ3016
シャッターコントローラー	ソーラブ	SC10	イメージングソフトウェアへのリンク
塩化ナトリウム	ミリポール・シグマ	S988
ステリトップフィルター	ミリポール・シグマ	S2GPT05RE
スイッチボックスドライバーとコントローラー	ニューポート	PZC200	ステージコントローラー
シリンジフィルター	J.T.ベイカー	SF01-98	PES 25mm 0.2 & micro;M
TEC要素	ソーラブ	TEC3-2.5	ペルティラーヒートポンプをサンプルホルダーおよび対物レンズカラーに接続するために使用されます
温度制御器	ミアステッター・エンジニアリング	TEC-1091
温度検出器	ソーラブ	TH100PT
サーミスタ	ソーラブ	TH10K
チューブ・O・ダイアリーザー	Gバイオサイエンス	786-611	4K MWCO
UVオゾンクリーナー	ノヴァスカン	PSDP_UV	プロシリーズ - デジタル
ズーム光学	ソーラブ	SM1NR1