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方法論記事

脳オルガノイドを用いたミトコンドリア疾患のモデル化:ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソードに焦点を当てる

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DOI:

10.3791/69303

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2025年10月10日

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1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

この記事について

サマリー

脳オルガノイドは、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様エピソード (MELAS) 研究の貴重なモデルとして機能し、その根底にある病態生理学についての洞察を提供し、薬物スクリーニングのプラットフォームを提供します。疾患原因遺伝子のヘテロプラスミーのレベルが異なる細胞株に由来するオルガノイドは、有意な表現型の違いを示します。

要約

ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード (MELAS) は、ミトコンドリア tRNALeu の m.3243A>G 変異体によって最も一般的に引き起こされるミトコンドリア障害です。MELASの病態生理学を調べるために、m.3243A>G変異体を保有するMELAS患者に由来する複数の人工多能性幹細胞(iPSC)株から脳オルガノイドを作製しました。これらの系統は同一の核遺伝的背景を共有していますが、m.3243A>G変異体が関与するヘテロプラスミーレベルが異なります。オルガノイドのサイズ、形態、神経誘導効率に有意差が観察され、ヘテロプラスミーの程度と相関しています。オルガノイドから解離したニューロンは、ハイスループットの薬物スクリーニングに便利で適した2D培養システムに移されました。オルガノイドはまた、ヘテロプラズミーレベルに応じて、ニューラルネットワークの形成に有意差を示しました。私たちの結果は、患者由来のiPS細胞ベースのオルガノイドモデルが、MELASメカニズムの研究と薬物スクリーニングのための有用なプラットフォームであることを示唆しています。このビデオでは、オルガノイドの生成や表現型の評価のためのプロトコルなど、包括的でユーザーフレンドリーな方法を紹介します。

概要

ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス、脳卒中様エピソード(MELAS)は、神経機能障害、脳卒中様エピソード、およびさまざまな全身症状を特徴とするミトコンドリア疾患です。最も一般的な原因は、ミトコンドリアロイシンtRNA遺伝子MT-TL1のm.3243A>G変異体です。この変異体は、アンチコドンでのタウリン修飾を損ない、それによってロイシンの翻訳効率を低下させ、MELASのミトコンドリア機能不全に寄与すると考えられています2,3,4。特に、高用量のタウリン投与後に症状の改善が報告されています 5,6。しかし、非応答者の存在は、まだ特定されていない追加の病態生理学的メカニズムが、m.3243A>G 変異体を保有する個人の疾患に寄与している可能性があることを示唆しています。

遺伝的変異によって引き起こされる疾患メカニズムを解明するには、原因となる変異を除いてすべての変数が同一であり、正確な表現型比較を可能にする実験モデルを使用することが理想的です。ゲノム編集された細胞株や修正された変異体を持つ動物モデルは、核遺伝子障害のコントロールとしてよく使用されます。しかし、mtDNA変異体の修復は、高度なゲノム編集技術を使用しても、技術的に依然として困難です7。したがって、同一の核背景を持つ実験モデルの確立は依然として困難です。この問題に対処するために、ヘテロプラスミーレベル( つまり、MT-TL1 m.3243A>Gバリアント8を保有するミトコンドリアDNAの割合)のみが異なる同じMELAS患者に由来する2つの人工多能性幹細胞(iPSC)系統を利用し、疾患モデルとして脳オルガノイドを生成しました。ヘテロプラスミーレベルは細胞継代または分化中に変動し、表現型に影響を与え、実験結果にバッチ間のばらつきを引き起こす可能性がありますが、ミトコンドリア遺伝子変異体を保有する患者由来の細胞は、疾患の病因を調査するのに依然として価値があります。

本研究では、MELAS患者由来のiPS細胞から脳オルガノイドを作製し、その病態生理を調べて疾患メカニズムの理解を深めました。ヘテロプラスミーレベルが高いと低い2つのiPS細胞系を使用して、ヘテロプラスミーの程度と相関する神経誘導効率に有意差が観察されました。私たちの知見は、患者由来のiPS細胞ベースの脳オルガノイドが、MELASの根底にあるメカニズムを解明し、薬物スクリーニングを促進するための貴重なプラットフォームを提供することを示唆しています。

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プロトコル

2つのiPS細胞系(2-6および2-8)は、確立された方法を使用して同じMELAS患者の線維芽細胞に由来しました8。それらはヘテロプラスミーレベルでのみ異なります。健康な個体から確立された414C2 iPS細胞系を対照として使用しました。この研究で使用されたプロトコルは、北里大学医学部倫理委員会のガイドラインに従っていました (#G22-02)。

1. 細胞培養

  1. 凍結細胞ストックの解凍
    1. 製造元の指示に従ってラミニンでコーティングして6ウェルプレートを準備します。
    2. 10 μM ROCK阻害剤を含むフィーダーフリーiPS細胞の培地を37°Cに温めます。
    3. 凍結したiPS細胞バイアルを液体窒素(LqN2)タンクから取り出し、37°Cのウォーターバスで急速に解凍します。
    4. 解凍した懸濁液を10 mLの予熱培地に移します。室温(22°C)で120× g で5分間遠心分離します。
    5. 上清を慎重に取り除き、チューブを軽くたたいてペレットをそっと再懸濁します。新鮮な培地とシード細胞を、ラミニンでプレコートされた6ウェルプレートに加えます。5%CO2を含む加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
  2. 中程度の変化
    1. 培地(ROCK阻害剤なし)を1〜2日ごとに交換してください。

2. 脳オルガノイドの生成

  1. 分化の開始(0日目)
    1. iPSC(~70-80%コンフルエント)培養プレートから培地を除去します。PBSで細胞を洗浄します。
    2. 酵素溶液を加え、37°Cで5分間インキュベートします。
    3. 培地を加えて反応を止めます。細胞を15mLチューブに移します。室温(22°C)で190× g で5分間遠心分離します。
    4. ペレットを30 μM ROCK阻害剤、5 μM SB431542、および2.5 μM IWP-2を含む1 mLの分化培地に再懸濁します。
      注:基本的な媒体は、手順1.1.2で使用したものと同じです。
    5. 細胞を数えます。U字型の96ウェル低付着プレートで1ウェルあたり100 μLで3細胞×103細胞を播種します。37°C、5%CO2で6日間インキュベートします。
  2. 中程度の変化(6日目)
    1. オルガノイド(ステップ2.1.5から)を、ワイドボアピペットを使用して96ウェルプレートから10 cmの皿に移します。50 μLの培地(DMEM/F12、1%N2、1%グルタミン置換、1%NEAA、2.5μM IWP-2、5 μg/mLヘパラン硫酸、および1%PS)を新しい96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
      注:オルガノイドを移送するときは、実験全体を通してワイドボアピペットを使用して、オルガノイドの3D構造を破壊しないようにしてください。さらに、8 チャンネル ピペットは、実験を迅速かつ正確に行うのに役立ちます。
    2. オルガノイドを2mLチューブに集めます。オルガノイドを吸引しないように培地を慎重に取り除き、1.5 mLのDMEM / F12を加えます。3回繰り返してオルガノイドを洗浄します。
    3. 培地を取り出し、オルガノイドを含むチューブに500 μLの新鮮な培地を加えます。すべてのオルガノイドを10 cmの皿に移し、5 mLの培地を加えて、各オルガノイドを拾いやすくします。
    4. 50 μLに調整されたマイクロピペットを使用して単一のオルガノイドをピックアップし、96ウェルプレートの1つのウェルに移します。すべてのオルガノイドが96ウェルプレート(最終容量100 μL)に移されるまで繰り返します。37°C、5%CO2で3日間インキュベートします。
  3. 中程度の変化(9日目)
    1. (オプション)8チャンネルピペットを使用する場合は、オルガノイドを10 cmの皿に移します。シングルチャンネルマイクロピペットを使用する場合は、ステップ2.3.1をスキップし、ステップ2.3.2に進みます。
    2. オルガノイドを2mLチューブに集めます。ステップ2.2.2のようにDMEM/F12で3回洗浄します。
    3. 1%N2、ビタミンAを含まない2%B27、100μMの2-メルカプトエタノール(ME)、2.5μg/mLのインスリン、1%グルタミン代替物、0.5%NEAA、および1%基底膜抽出物を含む分化培地(1:1 DMEM / F12および神経基底)に再懸濁します。
      注:1回使用のために基底膜抽出物の小さなアリコートを調製し、必要になるまで-20°Cで保存します。抽出物を8°Cを超えないように4°Cで解凍し、次に低温培地に混合し、培地を室温で約30分間温めます。
    4. ウェルあたり~10個のオルガノイドを6ウェルプレートに移します。1ウェルの培地の最終容量を2 mLに調整します。37°C、5%CO2で6日間静的に培養します。
  4. 中程度の変化(15日目)
    1. オルガノイドを15mLチューブに集めます。すべてのオルガノイドが落ち着くまで、チューブを邪魔せずに放置します。上清を取り除き、新鮮な分化培地を加えます(ステップ2.3.3と同じですが、B27 +ビタミンAを使用)。
      注:通常、オルガノイドは遠心分離せずにチューブの底に沈殿します。ただし、患者のiPS細胞に由来する小さなオルガノイドは効率的に沈下しない可能性があります。その場合は、チューブを室温で120 × g で3分間遠心分離してオルガノイドを回収します。
    2. ウェルあたり~10個のオルガノイドを6ウェルプレートに移します。37°C、5%CO2で15日間静的に培養します。
    3. 30日目まで5〜7日ごとに培地を交換します。

3. 2D培養のための脳オルガノイドの解離(30日目)

  1. ポリ-L-オルニチン(PO)によるコーティングプレート
    1. 10 mgのPOを66.7 mLのH2Oに溶解してPOストック溶液を調製し、1回使用用の小さなアリコートを作成します。使用するまで-20°Cで保管してください。
    2. PO原液をH2Oで1:5に希釈し、希釈した溶液で培養プレートをコーティングします。37°Cで一晩インキュベートします。
  2. ラミニンコーティング
    1. POを取り出し、PBSでウェルを3 x 5分洗浄します。
    2. ラミニン(PBS中で1:1,000)を加え、37°Cで3時間または一晩インキュベートします。
      注:ラミニンのストック溶液は1 mg / mLです。小さなアリコートを準備し、必要になるまで-80°Cで保存します。
  3. 単一ニューロンへの解離
    1. 使用前に解離液を4°Cで1時間解凍します。
    2. オルガノイドを15 mLチューブに移し、すべてのオルガノイドが沈降するまでチューブを乱さないままにしておきます。上清を除去し、5mLのPBSを加えてオルガノイドをすすぎます。
    3. PBSを除去した後、1 mLの酵素溶液を加え、1〜2回静かにピペットで移動します。37°Cで5分間インキュベートします。数回ピペット。必要に応じて、さらに2〜3分間インキュベートします。解離を完了するために再度ピペットを踏みます。
    4. 200 × g で 5 分間遠心分離します。上清を取り除き、分散液1mLを加え、ピペットで移動します。
    5. その下に層状の分離液を層状にし、200 × g で 5 分間遠心分離します。
    6. 1 mLのニューロン培地(1%B27、0.25%グルタミン置換物、1%PSを含む神経基底)を加えて混合します。懸濁液を70 μmのストレーナーに通して50 mLチューブに入れます。
    7. 細胞を数えます。PO /ラミニンコーティングプレート上に1×105 細胞/cm2 で細胞を播種します。60日目まで4〜7日ごとに培地を交換します。

4. 細胞および分子分析のための細胞およびオルガノイドの採取

  1. 免疫蛍光のためのオルガノイド固定(30日目)
    1. オルガノイド(ステップ2.4.3)をマイクロチューブに採取します。
    2. オルガノイドを吸引しないように培地を慎重に除去し、1 mLのPBSを加えてオルガノイドをすすぎます。
    3. オルガノイドを吸引しないようにPBSを慎重に除去し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加えて室温で30分間固定します。
    4. PBSで3回洗浄します。
    5. 使用するまで4°Cで保管してください。
  2. RT-qPCRのためのオルガノイド収集(30日目)
    1. オルガノイド(ステップ2.4.3)をマイクロチューブに移します。手順4.1.2で説明されているようにPBSで洗浄します。
    2. 溶解バッファーを加え、液体窒素(LqN2)中でスナップフリーズします。使用するまで-80°Cで保管してください。
  3. 免疫蛍光のための細胞固定(60日目)
    1. 培地を取り除き、PBSを加えて細胞を洗浄します。
    2. 室温で4%PFAで15分間固定します。
    3. PFAを除去し、PBSを加えて細胞を洗浄します。この手順を 3 回繰り返します。
    4. 使用するまで4°Cで保管してください。

5. RT-qPCR

  1. キットメーカーの指示に従ってオルガノイドからトータルRNAを抽出します。
  2. キットメーカーの指示に従って、ステップ5.1で調製したトータルRNA1 μgから、総反応量20 μLでcDNAを合成します。
  3. 次のプライマーを使用して定量的PCRを実行します。FOXG1_forward:CGCCAGATTTCCATGTGTGC;FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA;ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC;ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT。各反応の最終濃度を次のように設定します:1x蛍光マスターミックス、0.25 μMフォワードプライマー、0.25 μMリバースプライマー。ステップ5.2のcDNA0.2 μLを含む総反応量は15 μLです。次のPCR条件を使用します:95°Cで1分間の初期変性。95°Cで15秒間、60°Cで30秒間40サイクル。
  4. FOXG1発現を内部コントロールとしてACTBに正規化します。

6.免疫蛍光染色

  1. オルガノイド(30日目)を10%スクロースで4°Cで1時間インキュベートし、次に30%スクロースを4°Cで≥3時間インキュベートします。
  2. 包埋培地にオルガノイドをマウントし、クライオスタットを使用して凍結切片(10μm)を調製します。使用するまで、スライドグラスにセクションを-20°Cで保存してください。
  3. PBS洗浄(2 x 5分)で包埋培地を除去します。
  4. 0.3%PBSTで10分間透過処理します。PBSで洗浄します。
  5. 10%正常ヤギ血清を0.1%PBSTで1時間ブロックします。一次抗体(抗FOXG1(1:200)、抗TUBB3(1:500-1:1,000)とともに4°Cで一晩インキュベートします。PBSで3回洗浄します。
  6. 二次抗体(1:500)+ Hoechst 33258(1:500)と1時間インキュベートします。PBSで3回洗浄します。
  7. 共焦点顕微鏡でマウントして観察します。

7. ヘテロプラスミー解析

  1. 細胞スクレーパーを使用してiPS細胞を採取し、マイクロチューブに移します。0.5 mLのPBSを加え、100 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、ステップ7.2に進みます。
  2. キットメーカーの指示に従って全DNAを抽出します。
  3. 各PCR反応の最終濃度を設定します:1x蛍光マスターミックス、0.25 μMフォワードプライマー、0.25 μMリバースプライマー。総反応量は15 μLで、ステップ7.2の総DNA50 ngを含む。次のPCR条件を使用します:95°Cで1分間の初期変性。95°Cで15秒間、60°Cで30秒間40サイクル。プライマー配列は次のとおりです。MELASwt_foward:gtttgttaagatggcagagc;MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt;MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg;MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt;FBXO15_転送:GCCAGgaggtctTCGCTGTA;FBXO15_ 逆:aatgcacggctagggtcaaa。
  4. しきい値サイクル値を使用して、ミトコンドリアDNAコピー数(変異型と野生型)を計算します。
  5. FBXO15核遺伝子コピー数に正規化する。

8. オルガノイドのサイズと形状の評価

  1. TIFFフォーマットの顕微鏡を使用してオルガノイドの画像をキャプチャします。
  2. オープンソースの画像解析ソフトウェアを使用して、サイズと円形性を測定します。手順 8.1 で保存した TIFF ファイルを開くには、[ファイル] |ファイルを開き、選択します。フリーハンド選択を選択し、オルガノイドをトレースします。次に、[分析] |測定。結果の面積と円度の値は、ステップ 8.3 の解析に使用されました。
  3. t検定を実行してデータを分析し、統計ソフトウェアを使用して対照線と比較して有意差があるかどうかを評価します。

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結果

脳オルガノイドを生成し、Nakamuraら9に基づいてわずかな変更を加えた比較的単純なプロトコルを使用して2Dニューロン培養を実施しました(図1)。以前のプロトコルでは、V字型の96ウェルプレートが使用されましたが、この研究では、細胞が各ウェルの中心に自然に凝集できるように、U字型の96ウェル低付着プレートを使用しました。健康な対照iPS細胞系414C2を使用して、30日目にFOXG1陽性ニューロンを含む脳オルガノイドを誘導することに成功し(図2A、D、E)、60日目に2D培養ニューラルネットワークを誘導することに成功しました(図3A)。

患者由来の iPSC 株は、MELAS8 の病態生理学を調査するために使...

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ディスカッション

ヒト胚性幹細胞(ESC)/iPS細胞から誘導されたオルガノイドは、まれな難病の有望な疾患モデルであるのに対し、脳オルガノイドの生成には、通常、数か月続く長期培養期間10 と、培地を連続的に撹拌し、長期の3D細胞培養のための安定した条件を維持する人工容器などの高価な機器の使用が必要です。本研究では、標準的な細胞培養装置を用いて、短時間で脳オルガノイドを確立しました。m.3243A>GミトコンドリアDNA変異体を保有するMELAS患者由来のiPS細胞を用いて、疾患細胞特異的表現型の同定に成功しました。

2019年にNakamuraらによって報告された以前に公開されたプロトコルに従い、わずかな変更を加えました。彼らの最初の研究では、V字型の96ウェル低付着プレートを使用して、0日目にiPS細胞を凝集しました。しかし、本研究では、細胞がウェルの中心に自然に凝集するように、U字型の96ウェル低付着プレートを採用しました。私たちは、高品質の低付着プレートの使用が成功に不可欠である...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

414C2 iPS細胞は理化学研究所BRCから入手した。助成金は、日本学術振興会科研費(24H00648 to M.F.、23K08971 to C.S.)とAMEDトランスレーショナル・リサーチ・ネットワーク・プログラム(25yf0126001j002 to M.F.)が提供しました。この研究は、ドイツ学術交流局(DAAD)のF.B.へのフェローシップによって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10cm細胞培養皿コーニング353003
6ウェルプレート超低接着面コーニング3471
70 & mu;M細胞ストレーナーコーニング352350
アキュターゼナカライ・テスク12679-54iPSCを解離させるために使われる酵素
B27サプリメントサーモファイッシャー・サイエンティフィック17504001
ビタミンAを含まないB27サプリメントサーモファイッシャー・サイエンティフィック12587010
&β;-メルカプトエタノール(2-ME)シグマM3148機関の規則に従って破棄してください。
細胞培養6ウェル多板コーニング353046
セルセーバーのヒントBMBio ECOBMT-200Wワイドボアピペットチップ
セルスクレーパー住友爆能株式会社MS-93100
共焦点顕微鏡ツァイスLSM710
クライオスタットライカCM3050
カルチャーマウスラミニン1R&D3400-010-02解離ニューロンの2次元培養プレートのコーティングに使用されます
DMEM/F12富士フィルム 和光純化学株式会社042-30795
蛍光マウンティングメディウムダコS302380-2取り付け媒体
FOXG1抗体アブカムab196868
グルタマックスサーモファイッシャー・サイエンティフィック35050061
ヤギ抗マウスIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa fluor plus 488サーモファイッシャー・サイエンティフィックA32723
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor Plus 555サーモファイッシャー・サイエンティフィックA32732
ヘパラン硫酸塩(HS)シグマH7640
高容量RNAからcDNAへのキットサーモファイッシャー・サイエンティフィック4387406RNAからcDNAを合成するために用いられます
ホエヒスト 33258サーモファイッシャー・サイエンティフィックH3569
イメージJバージョン 1.52aオルガノイドのサイズと円形を測定するために用いられます
iMatrix-511シルクタカラバイオ株式会社892021iPSC培養用プレート用コーティング
インスリン富士フィルム 和光純化学株式会社 090-06481
IWP2トクリス・バイオサイエンス3533
キーエンス BZ-X810キーエンスBZ-X810図3Aの画像取得に使用されました
LSM710カールツァイスAG共焦点顕微鏡
LSM980カールツァイスAG共焦点顕微鏡
LUNA ユニバーサル qPCR マスターミックスニューイングランド・バイオラボM3003
マトリゲルコーニング354277
N2サプリメントサーモファイッシャー・サイエンティフィック17502001
神経基底培地サーモファイッシャー・サイエンティフィック21103049
ニューロン解離ソリューション 富士フィルム 和光純化学株式会社291-78001
非必須アミノ酸(NEAA)ナカライ・テスク06344-56
普通のヤギ血清ジャクソン免疫研究所 005000121
Nunclon Sphera 96-well、Nunclon Sphera処理済みU字型底部マイクロプレートサーモファイッシャー・サイエンティフィック174929
パラホルムアルデヒド(PFA)ナカライ・テスク09154-85機関の規則に従って破棄してください。
PBSナカライ・テスク14249-24
PBSナカライ・テスク27575-31
ペニシリン/ストレプトマイシン(PS)ナカライ・テスク26253-84
ポリLオルニチン(PO)シグマP3655
ポリオキシエチレン(10) オクチルフェニルエーテル(トリトン)富士フィルム 和光純化学株式会社168-11805
PRISM グラフパッドバージョン 9.5.0
QIAamp DNAミニキット 奇アゲン51304全DNA抽出に用いられます
RNeasyミニキット奇アゲン74104全RNA抽出に用いられます
SB-431542ケイマン・ケミカル13031
スライドグラス松波CRE-05
ステムフィット AK02Nタカラバイオ株式会社AK02N未差異iPSCの培養および分化0日目から6日目までの培地
ショ糖富士フィルム 和光純化学株式会社196-00015
ティッシュテックO.C.T.コンパウンドサクラファインテック株式会社4583低温保存培地
TUBB3抗体プロメガG712A
Y27632富士フィルム 和光純化学株式会社030-24021ROCK阻害剤
禅カールツァイスAG2.3SP1(ブラックエディション)撮影された画像を分析するソフトウェア 共焦点顕微鏡(LSM710)を用いる
禅カールツァイスAG2.6(ブルーエディション)撮影された画像を分析するソフトウェア 共焦点顕微鏡(LSM980)を使った

参考文献

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