方法論記事

無菌性心膜炎のラットモデルにおける心房電気生理異常およびカルシウム処理異常の光学マッピング

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DOI：

10.3791/69767

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2026年1月27日

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1Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Research Center of Ion Channelopathy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Institute of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Key Lab for Biological Targeted Therapy of Education Ministry, 5Hubei Provincial Engineering Research Center of Immunological Diagnosis and Therapy for Cardiovascular Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 6Department of Cardiology, Xuzhou Central Hospital, 7Institute of Cardiovascular Diseases & Department of Cardiology, Sichuan Provincial People's Hospital, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、ラットの無菌心膜炎心臓における電圧とカルシウム過渡期の二重光学マッピングを記述し、術後心房細動の基礎となる炎症誘発性心房再構築を評価することを目的としています。

要約

術後心房細動(POAF)は心臓手術後に多く発生し、心房炎症やリモデリングと関連しています。無菌心膜炎(SP)モデルはこの状態をラットでも再現しており、炎症誘発性心房電気生理学の研究に貴重なプラットフォームを提供します。このプロトコルは、SP誘導後のランゲンドルフ灌流ラット心臓の準備と、同時二重光学マッピングを用いて膜貫通電圧およびカルシウム過渡現象を記録する方法を説明しています。心臓は電圧感応染料RH237とカルシウム指示薬Rhod-2 AMで染色され、運動アーティファクトを最小限に抑えるためにブレビスタチンで収縮性を抑制します。高速イメージングにより、制御されたペース配分プロトコル中に心房活動電位とカルシウム動態の時空間的マッピングが可能になります。定量的パラメータには活動電位持続時間、伝導速度、カルシウム過渡期持続時間、ピークまでの時間、交互大きさが含まれます。この手法は、炎症ストレス下での心房伝導の異質性、電気-カルシウム結合、不整脈脆弱性を正確に評価することを可能にします。この可視化されたアプローチは、POAFメカニズムの研究や心房再構築を標的とした薬理学的または遺伝的介入の検証に再現可能かつ多様なプラットフォームを提供します。

概要

術後心房細動(POAF)は、心胸腔手術後によく見られる合併症であり、通常、術後2〜4日以内にピークを迎える一時的な心房細動(AF)が特徴です。POAFは自己制限されることが多いですが、脳卒中のリスク増加、入院期間の延長、医療費の上昇と関連しています。心房筋の炎症ストレスは、その病因の主要な要因と考えられています。

無菌心膜炎(SP)モデルは、POAFの研究に用いられた確立された小動物モデルです。このモデルでは、心外タルクの塗布により、術後の変化を模倣した局所的な心膜炎症が誘発されます。このモデルを用いた以前の研究では、構造の再構築、ギャップ接合部発現の変化、カルシウム処理異常が不整脈形成の素因を示している5,6,7。しかし、従来の電気生理学的手法では時空間情報が限られており、完全な心房表面全体で伝導異質性や電気-カルシウム結合の動態を捉えるのは困難です。

光学マッピングにより、心房表面を横断する膜貫通電圧およびカルシウム過渡現象(CaT)を同時に高解像度で画像化でき、心房伝導、再分極、カルシウムシグナル伝達の正確な可視化が可能となります。本プロトコルでは、ランゲンドルフ灌流SPラットの心臓における二重光学マッピングを記述します。このアプローチにより、制御されたペース配分プロトコルの下で伝導速度、活動電位持続時間(APD)、CaT特性、交互波の定量化が可能になります。炎症を起こした心房準備に電気的およびカルシウム処理の評価を統合することで、この手法はPOAFのメカニズム的基盤の研究や標的治療介入の検証に強力なツールを提供します。

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プロトコル

すべての動物処置は、施設動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認され、承認ID [2024]IACUC Number 4241のもと、機関および国家のガイドラインに従って実施されました。研究全体を通じて、動物福祉ガイドラインの厳格な遵守が維持され、明確に定義された人道的評価項目が示されました。持続的な倦怠感、突然の20%を超える体重減少、呼吸困難、通常の飲食困難、または重度の術後合併症を示すラットは、苦痛を最小限に抑えるためにイソフルランの過剰摂取(5%、酸素流量1L/分)で即座に安楽死処分されました。

1. 溶液および試薬の調製

  1. 修正チロド溶液(mM単位):128.2 NaCl、4.7 KCl、1.3 CaCl2、1.05 MgCl2、1.19 NaH2PO4、20 NaHCO3、11.1 グルコース。95% O2/5%CO2で泡を作り、pHを7.38〜7.42に調整し、37 ± 1 °Cに温めます。
  2. ブレビスタチン:DMSO(5 mg/mL)に溶解し、-20°Cで光保護状態で保存します。最終濃度10μMで使用。
  3. RH237(電圧感応染料):DMSO(2 mg/mL)に溶解し、−20°Cで光保護で保存します。最終濃度2μMで使用します。
  4. Rhod-2 AM(カルシウム指標):DMSOに溶解(1 mg/mL);−20°Cで保存し、光保護済みです。最終濃度は0.89μMで使用します。
  5. プルロニックF-127(界面活性剤):DMSO(市販試薬)中の20%溶液。
  6. ペントバルビタールナトリウム(1%):麻酔用に10 mLの生理食塩水に0.1gを溶解します(40 mg/kg、無茶)。
    注意:染料やDMSOストックは適切な個人防護具(PPE)で取り扱いましょう。ブレビスタチンや染料を光から守ること。バイオセーフティおよび化学物質安全のルールを守りましょう。

2. 装備

  1. 温度制御(37 ± 1 °C)、貯留槽、気泡柱、蠕動ポンプ(流量10-12 mL/分)を備えたランゲンドルフシステム。
  2. イメージング:高速CMOSカメラ(≥1 kHzフレームレート;アトリウムでは80×80ピクセルの視野≥)、LED励起源(530 ± 25 nm)、二色性ビームスプリッター(~630 nm)、放射フィルター(Rhod-2 ~590 nm;RH237>700 nm)、レンズは絞り調整付き、光学テーブルで振動遮断付きです。励起光源:最大電流5AのLEDレーザー、最大出力2.2Wの緑色ライト。
  3. 刺激:定電圧刺激器、バイポーラペーシング電極。
  4. 生理学:水中心電図電極;サーミスタプローブ;心室光の汚染を減らすための黒い背景基質(ゴム);優れた外科用器具;ネズミ用の人工呼吸器。詳細な在庫は 材料表でご覧いただけます。

3. ラットにおける無菌性心膜炎(SP)の誘発

  1. オスのスプラグ・ドーリーラット(200-220g)に1%のペントバルビタールナトリウム(40 mg/kg、独立投与)で麻酔します。麻酔の深さ(ペダル反射の喪失)を確認してください。
  2. 直接視覚化のもと、ポリエチレンまたは金属カニューレを用いてラットを挿管します。チューブを慎重に気管内に差し込み、カリナのすぐ上に位置し、移位を防ぐために固定します。潮汐量2 mL/100 g、呼吸55回/分、I:E = 1:1の人工呼吸器に接続します。胸部の対称的な拡張と安定した呼吸を観察して、効果的な換気を確認しましょう。
    注意:気管支挿管や誤管抜管を防ぐため、深くまたは浅い位置への挿入は避けてください。
  3. 手術フィールドを準備しろ。胸骨近くの小さな胸骨旁開胸術(第2肋間空間)を行います。優しく心臓をさらけ出してください。
  4. 胸腺を持ち上げて両方の心房を視覚化します。細かい鉗子で心房表面の心膜を慎重に開けてください。
  5. 細かいヘラ(タルカムパウダー用量:50 mg/100 gラット体重)を使って左右心房面に均等に塗布します。大血管や心室にこぼれないように注意してください。胸腺を心房の上に置き換えて、タルクの移動を制限してください。
  6. 胸の筋肉を肋間手術切開部を覆う位置を変えます。0.5%ポビドンヨウ素による消毒後、筋肉と皮膚を縫合して胸腔を閉じ、術後にペニシリン(160,000 U/100 g、例)を投与します。
  7. シャム:心包切開術やタルク塗布なしの開胸術。
    注意:心房外膜にのみ薄く均一なタルク層を塗布してください。過剰なタルクや心室汚染は死亡率を増加させ、心房特異的な測定結果を混乱させる可能性があります。過去の研究では、ラットにおける無菌心膜炎手術が重度の心房性心筋炎を引き起こし、著しい線維化とIL-6、IL-1β、TGF-β1などの炎症因子の上昇を引き起こすことが確認されています 3,9。

4. 心臓の隔離とランゲンドルフ灌流

  1. 手術後3日目には、鼻のコーン を通じて イソフルラン(2-3%)で麻酔し、全身ヘパリン(250 U/kg、独立投与)を投与して血管内血栓形成を防ぎ、冠動脈循環を妨げ、ランゲンドルフ灌流を妨げます。この時期は、我々のin vivo での知見に基づいて選ばれました。これは、AF誘発性がSP3の3〜4日後にピークを迎えることで、急性の炎症による不整脈相を捕捉しつつ、造影料の負荷や光学記録に干渉する後の癒着を回避できるというものでした。
    注意:始める前に、新鮮な準備をしてください。ガスと温度の平衡。光学系を合わせてフィルターや二色性を確認しましょう。取得ソフトウェア(1-2kHz、露光1ms)を設定し、蛍光カードでキャリブレーションを行います。
  2. 胸腔を露出させるために迅速の正中開胸術を行います。心臓を一 括 り切除し、大動脈弓の一部を使い、すぐに氷のように冷たく酸素入りのタイロデ溶液に浸して代謝を止め、組織の生存能力を保つ。カニュレーションのために大動脈長0.5mmを保ちつつ、周囲の結合組織を慎重に切り離してください。大動脈を4-0シルク縫合糸でランゲンドルフカニューレに固定し、気密シールを確保し、カテーテルの下端が心房の上縁と合うようにします。酸素化タイロデを用いて逆行灌流を開始し、10〜12 mL/分の一定流量で、灌流液温度を37 ± 1 °Cに保つ。 再現性のために、ラット大動脈カニューレの仕様は以下の通りです:外径:1.4 mm;内径:1.0 mm;全長:3〜4cm;挿入深さ:大動脈根部に約0.5〜1.0cm;先端形状:ややテーパー;材料:ステンレス鋼または鈍くなった金属管。カニューレは、通常60〜80 mmHgの灌流圧に耐えられるほど硬く、曲がりがまらないようにし、先端は冠動脈開口を塞がないようにすべきです。
  3. 心臓の即時再灌流効果を観察してください。灌流の成功は、冠動脈から残留血液が迅速かつ迅速に洗い流され、均一なピンク色の心筋の回復、そして自然なリズム収縮の再開によって示されます。さらなる実験を行う前に、最小限の心筋浮腫と安定した心拍数(通常300〜400 bpm)が必要です。同時に心臓の心電図も記録してください。光マッピングプロトコルを開始する前に、心臓を少なくとも20分間安定した灌流のもとで平衡状態にしてください。

5. 動き抑制と排気

  1. ブレビスタチンを灌流液(最終10μM)に加えます。陣痛が止まるまで約10分間灌流してください。
  2. 低血圧カテーテルを肺静 脈から僧 帽弁を通じて左心室に挿入し、心室を減圧することで腔内圧を下げつつ、心房形態と信号の完全性を維持できます。再現性のため、カテーテルの仕様は以下の通りです:外径:1.4 mm;内径:1.0 mm;全長:1.5 cm;心臓への挿入深さ:1.0 cm。心房の幾何学や信号を保存するために心房を開かないでください。

6. 染料の装着

  1. 心臓灌流:心停止後、室温で10〜12 mL/分の一定流量で心臓を灌流します。
  2. カルシウム指示染色:Rhod-2 AM(最終濃度0.89μM)と20μLの20%プルロニックF-127を100mLの灌流液に加えます。この溶液を約30分間心臓に灌流し、心房と心室が均一な赤色蛍光を示すまで続けます。
  3. 電圧感応染料染色:100mLの灌流液に最終濃度2μMのRH237を加えます。心房と心室がピンク色になるまで~5分間心臓を灌流します。
  4. 再温めと洗浄:心臓を元の灌流システムに戻します。生理温度まで温め直し、5〜10分間フュージョンして未吸収の染料を洗い流します。
    注:弱いCaT信号はしばしばRhod-2負荷が不足していることを示します。ロードを10〜15分延長して、プルロニックが新鮮かどうか確認してください。動きが続く場合は、ブレビスタチンの効力と光の保護を確認しましょう。

7. イメージングジオメトリと信号分離

  1. 心臓を37°Cの画像洗浄槽に入れます。左心房(LA)をカメラの方に向けてください。一次と二次のLED光源をLAに合わせます。
  2. 心臓を支えてドリフトを防ぎ、心房を優しく広げ、鍼で固定して最適な視覚化を図ります。心室を黒いゴムシートで覆い、心室光害を最小限に抑えましょう。
  3. 右心房(RA)にバイポーラペーシング電極を設置してください。心房の近くに心電図を設置し、大きなP波捕獲を行います。

8. 取得およびペース配分のプロトコル

  1. マッピングソフトウェア(OMapRecord4.0ソフトウェア)を起動してください。フレームレートを1-2kHzに設定;LED負荷を3〜4Aに調整;視野はロサンゼルス全体を包括するものでした。ゲインや露出を調整して、どちらのチャンネルでも飽和しないようにしてください。カメラのゲインと露出を最適化し、彩度を避けつつ信号対雑音比を最大化します。画像パラメータ:露光1ミリ秒;最大カメラ周波数30kHz;サンプリングレートは12.5 kHz;解像度は2048×2048ピクセル;ROIフレームレートは最大3.5kHzまで、空間分解能70μm。これらの設定は高音質のAPおよびCaT録音を保証します。
  2. S1S1のペース配分(ベースライン):RAペーシングは7Hz(パルス幅2〜4ms;拡張期閾値の2倍)。APD/CaTの持続時間(CaD)、ピークまでの時間、伝導速度に関する≥5秒ムービーを取得します。
  3. S1S2プロトコル(難治性/AF):7 Hzで30回のS1ビートを送り、その後1回のS2を投与;S1-S2間隔を140ms(10/5/1ms)ごとに減らし、難治性に短縮します。記録的なCaT回復(A2/A1)、有効不応期間(ERP)、心房誘導率/持続時間。
  4. 漸進的ペーシング(オルタナン):RAペーシングを8Hzから18Hzに1〜2Hzごとに増やします。各レートで≥5秒を記録して、Ca-ALT、APD-ALT、DIS-ALTを定量化します。同時進行中のデュアルチャンネル映画と同期した心電図/刺激トレースを保存して分析します。
    注意:ペース配分中は温度と灌流を一定に保つこと;低体温症は伝導を減少させ、オルタナの人工物を増幅させます。

9. データ処理と定量化

  1. OMapScope 4.0ソフトウェアを使って光信号を解析します。3×3ガウス空間フィルタを適用し、各ピクセルを隣接ピクセルと平均化することでノイズを減らしつつ信号形態を保持しました。活性化時間は、アップストローク中の最大dF/dtの点として定義され、そこから最も初期と最新の活性化部位間の線形距離を対応する活性化時間差で割って伝導速度を計算します。APD70/90 は、活動電位の最大dF/dTからAP振幅の70%または90%の再分極までの時間と定義されました。CaD70/90 は、カルシウム過渡期(Ca²⁺)のピークから70%または90%の崩壊までの時間と定義されました。オルタナンは次のように定量化されました。Ca-ALTは1から小さい平均CaT振幅と大きいものの比率を引いたものとして計算され、APD-ALTは長いAPD80 値と短いAPD値の差として、DIS-ALTはノード線で区切られた空間的に位相がずれたオルタナンとして計算されました。RyR回復比は、連続した2つのCaTピーク(小さい/大きい)の比率として計算されました。

10. 重要パラメータと受容基準

  1. 灌流:10-12 mL/分、37 ± 1°C;安定洞調律またはペースリズム;LAはよく浸透している。
  2. SNR:両チャンネルでアップストロークのdF/F ≥3;獲得期間中の光漂白は最小限です。
  3. 運動:ブレビスタチン投与後の残留運動は無視できるほど小さい;フレーム間の安定した画像登録。
  4. 温度:継続的なモニタリング;取得時に浴<36°Cまたは>38°Cのデータセットは除外します。

11. 統計分析

  1. すべての統計解析はGraphPad Prism 9を用いて実施されました。データはSEM±平均として提示されます。データ分布の正規性はシャピロ・ウィルク検定を用いて評価されました。正規分布のデータでは、両群間の差をペアなしの両側Student's t検定で解析しました。正規分布でないデータにはマン・ホイットニーU検定が適用されました。カテゴリ変数はχ2 検定を用いて分析されました。Pは0.05<統計的に有意とされました。

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結果

AF誘導性
異所性活動と再突入は、POAFの開始と継続に寄与する重要なメカニズムです。再突入波長(λ)はERPと伝導速度(CV)の積によって決まり、すなわちλ = ERP×CVです。偽手術心臓では、S1S2ペーシングが不整脈なしの安定した心房反応を引き起こしました(図2A)。対照的に、SP治療を受けた心臓はしばしば異常反応を示し、心房外出(図2B)や心房細動に変化した再入室(図2C)が見られました。定量解析により、S2間隔が徐々に短縮されることで、Sham対照群と比較してSP心臓で心房性外出または細動の発生率が有意に増加することが示されました(図2D)。心房有効不応期(ERP)は両群間で変化がなかった(図2E)。

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ディスカッション

このプロトコルは、炎症駆動モデルであるPOAFのSPに従った、分離ラット心臓におけるAPとCaTの二重光学マッピングを記述しています。プログラム可能なペーシングのもとで、VmおよびCa2+ 信号を無傷心房表面全体で同時に高解像度記録することで、APD、ピークまでの時間、伝導速度、再分極の空間的異質性、CaD、CaT振幅、CaTピークまでの時間、地域的なCaの取り扱い変動を評価できます。また、周波数依存型オルタナ(APD-ALT、Ca-ALT、DIS-ALT)の検出・定量、さらにRyR回復率および難耐率の解析も可能にします。さらに、このアプローチは不整脈性トリガー(異所性活動および再入)、SPモデルによって誘発される機能的ローターベースの再突入、そしてそれらが顕著な交互作用を示す領域との共局在を特定し、炎症誘発性の心房電気的再構築と不整脈形成のメカニズム的洞察を提供します。特に、心膜でのタルク曝露は、炎症による電気的再構築を示す初期の電気生理学的変化と関連していました。それにもかかわらず、AFは電気的、構造的、機能的要素を含む多因子性障害です。したが...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は中国国立自然科学基金(No. 82470328, 82170326to Y.D.)の支援を受けました。いいえ。J.L.82300350に言えません)。中国鄭州河南医科院電気生理学研究所の郝国良博士と王公信博士の皆様に、光学マッピングにおける卓越した支援に感謝申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブレビスタチンアブカムAB120425
CaCl2シグマ・オルドリッチ10043-52-4
CMOSカメラマッピングラボOMS-PCIE-2002
心電図システム成都技術者BL-420F
FE32 -メーターメトラー・トレド30254108
フィルター/二色性ミラーマッピングラボRH237 >700 nm;
CaT 590 nm
グルコースシグマ・オルドリッチ921-60-8
イムゲ浴マッピングラボ該当なし
KClシグマ・オルドリッチ7447-40-7
ランゲンドルフ灌流系Radnoti / Custom該当なし
LED電源(530nm以上、25nm)マッピングラボ該当なし
MgCl2シグマ・オルドリッチ7786-30-3
NaClシグマ・オルドリッチ7647-14-5
NaH2PO4シグマ・オルドリッチ10049-21-5
NaHCO3シグマ・オルドリッチ144-55-8
OMapRecord4.0ソフトウェアマッピングラボ該当なし
OMapScope4.0ソフトウェアマッピングラボ該当なし
蠕動ポンプコール・パーマーMasterflex®L/S®
プルロニックF-127インビトロジェンP3000MP
RH237(電圧染料)サーモフィッシャー / インビトロジェンS1109
Rhod-2 AM(カリフォルニア指標)サーモフィッシャー / インビトロジェンR1245MP
小動物用人工呼吸器ユヤンビオV-100
ペントバルビタールナトリウムシグマ・オルドリッチP3761
スプラグ・ドーリーネズミ(200–220g、男性)地元の認定ベンダー該当なし
滅菌タルク粉シグマ・オルドリッチT1586
刺激装置マッピングラボLEDC-2002
水浴(温度制御)寧波新志SC-15

参考文献

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