方法論記事

近親繁殖マウス株に基づく歯髄炎の動物モデルとその組織学的解析

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DOI：

10.3791/69786

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2026年2月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Operative Dentistry, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 2Dow Institute of Advanced Biological and Animal Research, Dow University of Health Sciences, 3Department of Pathology, Dow International Medical College, Dow University of Health Sciences, 4Department of Oral Pathology, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 5Qatar University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、NMRI(海軍医療研究所)マウスにおける歯髄モデル作成のプロトコルを紹介します。さらに、顎の引き込みクリップの製作方法や動物の顎からの組織学的スライド作成の手順も説明されています。標準的なプロトコルに従うことで、方法論や結果のばらつきを避けることができます。

要約

海軍医学研究所(NMRI)のマウスは、歯髄炎症モデルの作成に関してこれまで報告されていません。本プロトコルでは、NMRIマウスを用いた動物モデルを提示し、パルピティスモデルの詳細な組織学的手順を提供して再現性を確保します。70匹のNMRIマウスを2つのグループに無作為に割り当てました。グループA(n=35)は歯髄曝露だけで歯髄炎が誘発され、グループB(n=35)は牙髄曝露後にZymosanを投与されました。右上顎臼歯の歯髄露出後、動物は指定された時間間隔(0、6、9、12、24、48、72時間)で生贄にされました。上顎は組織学および定量的組織形態学的解析のために採取されました。両群の組織学的解析で、時間依存的な炎症の徐々の増加が観察されました。両方の動物モデルは最大72時間までの炎症研究を可能にしました。本論文で提示された技術は再現可能であり、歯髄炎の組織学的研究の標準化に役立ちます。

概要

歯髄炎1、2、3、4の研究には様々な動物モデルが用いられています。これらの中でも、C57BL/6およびBALB/cに基づくマウスモデルは、歯髄炎研究5,6,7,8でのみ報告されています。両者とも近親交配で、繁殖には厳しい条件があります。現在のプロトコルで使用されているNMRIマウスは外交株であり、近親交配株に比べて多くの利点があります。設置やメンテナンスコストが低く抑えられます。高い繁殖率、優れた免疫力、低い死亡率により、コロニーの早期かつ大きな入れ替わりが起こります。したがって、物流的にも財政的にも実現可能である11。さらに、我々の結果は、このモデルで生じた歯髄炎症の疾患プロファイルが、近交マウス5,6,8の先行報告モデルと類似していることを示しています。さらに、NMRIマウスはZymosanへのパルプ曝露に最大72時間耐え、観察可能な疾患プロファイルを発達させます。これは他の近親交配株の代替として、歯質炎12の研究に有効な選択肢です。

ジモサンはサッカロマイセス・セレビジアエの細胞壁から抽出され、主にキチン質、マンナン、マンノタンパク質、そしてβ-グルカンから構成されています。ザイモサンとカンジダ・アルビカンは類似した細胞壁構造を共有し、宿主の自然免疫によりC型レクチン(病原体認識受容体)であるDectin-114を介して検出されます。デクチン1は主に樹状細胞とマクロファージによって発現します。真菌病原体中のß-グルカンを検出し、Syk/CARD9経路を用いて炎症メディエーターの形成を行います15。したがって、ZymosanはC. albicansの曝露が歯髄疾患に与える影響を研究する有効な代替手段であり、微生物を用いていません。これは、Zymosan曝露したパルプにおけるDectin-1転写物の早期検出を示す、私たちの既に発表された結果によって裏付けられています。同様に、CD68+veマクロファージを発現するDectin-1も観察されました。

過去の論文で説明された組織学的手法は、初心者研究者が自信を持って再現するには不十分であることが多いです。その結果、組織学的手技の最適化中に不必要な動物の損失が生じ、広範な試行錯誤が発生します。本プロトコルはスライド準備技術を標準化しており、ラットにも成功裏に適用されています。ここでは、顎の後退の再現可能な方法、歯髄曝露による歯髄炎の誘導、Zymosanを用いた歯髄炎症の誘導、そしてその後の組織学的解析を含む、歯髄筋モデルの重要なすべてのステップを詳細に説明しています。

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プロトコル

現在の動物実験はARRIVEガイドラインに従って設計されました。ダウ健康科学大学の動物研究倫理のための機関審査委員会は、この動物研究を承認しました(書簡番号:AR。IRB-06/DUHS/承認/2016/05)。プロトコルには合計70匹のNMRIマウスが含まれていました。動物たちはダウ先端生物学動物研究所の中央動物館施設から取得されました。このプロトコルのサンプルサイズは、以前の研究に基づいています。

1. 動物

注:研究対象となった動物の体重は26〜30gで、標準的なケージで以下の条件で飼育されました:温度±21°C、相対湿度±55%、12時間の明暗比、無料のろ過水と標準的な飼料(通常のチャウダイエット)で。攻撃性、不快感、刺激の兆候がないか定期的に監視されていました。痛みや不快感の際にはジクロフェナクナトリウム(皮下投与200 μL、25 mg/mL)が使用されました。実験の前に2週間ほど順応させられました。それぞれ10頭の動物が適切にラベル付けされたケージに収められていました。動物の識別のために、尾にマーカーが付けられました。

  1. 動物(n=70)をランダムに2つのグループに分けます:グループA(n=35)、グループB(n=35)。
  2. グループAでは、歯髄の露出だけで歯髄炎を誘発します(ステップ4.1.1からステップ4.1.9参照)。
  3. グループBの動物については、露出した歯髄にザイモサン溶液を塗布します(ステップ4.2.1からステップ4.2.3参照)。

2. ザイモサン溶液

  1. 以下18に記載されている、既に発表されたZymosan溶液の調製方法に従ってください。
  2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて、1 mLのZymosanから1 mg/mLの溶液を作ります。
  3. 溶液を121°Cで15分間オートクレーブします。
  4. 溶液を室温まで1時間冷やします。
  5. 溶液を4°C、300 x g で10分間遠心分離します。
  6. 上澄液を捨て、氷のように冷たい無菌PBSで再遠心分離してペレットを3回洗浄します。
  7. 溶液は4°Cで保存し、再度使用します。
    注意:溶液は30日以内に使用しなければならず、その後は廃棄可能です。

3. 顎の引き込みクリップ

  1. 0.7mmのステンレス製矯正用ワイヤーを使って顎の引き込みクリップを作りましょう。
  2. 長さ100mmのワイヤーを中心に直径5mmのループを作ります。
  3. ワイヤーの両部分をループから5mm、合計15mmの角度で急な曲がりなく直角に回してください。
  4. 回転から25mmの距離で切り欠きを作り、残りの端を外側に回します。図 1A を指針として使ってください。

4. 動物モデル

  1. グループA(n = 35)
    1. 動物を麻酔するには、0.1 mL/20 gのケタミン-キシラジンカクテル(87.5 mg/kg ケタミン + 12.5 mg/kg キシラジン)を腹腔内注射で行います。
    2. すべての処置には10倍傾斜の長腕ステレオ顕微鏡を使用してください(図1B)。傾いた腕を、動物の引っ込んだ上顎歯が直接見えるように配置します。(図1C)
    3. クリップを押し、切り欠き部分を上顎切歯と下顎切歯の間に挟みます。
    4. クリップを外した後、接着テープ(図1C)を使って端を固定します。
    5. 動かない手で歯科ピンセットを使って動物の頬を広げてください。(図1D、E)
      注意:過度な圧力は避けてください。ピンセットによる怪我は致命的な出血や動物の死を引き起こすことがあります。
    6. 右上顎第一大臼歯の中央に、10倍倍の倍率でE型低速ハンドピースを装着し、Eタイプ低速ハンドピースを用いてクラス1の空洞を作ります。この時点で歯髄の影が見えることがあります(図1D,E)。
    7. バーをゆっくりとゆっくりと掃くように動かします。回転数を制御するために電動モーターを使ってください。
    8. K型15番の歯内治療ファイルを使って歯髄を露出させます(図2B)。
      注意:#15の歯内療法用手探器の使用は非常に優しく行う必要があり、そうでなければ分岐穿孔が生じます。これは組織学的スライドの準備が完了して初めて明らかになります。#1/4ラウンドカーバイドバーの直径は0.25mmで、#15K タイプのやすりは幅0.15mmです。したがって、パルプへの露光サイズは0.15mmとなります(図2C)。
    9. 歯髄を開放して、腱炎の誘導を行ってください
  2. グループB(n = 35)
    1. ステップ4.1で示されたすべての手順を繰り返し、以下を追加してください。
    2. マイクロピペット(0.2〜2 μL)を使い、事前に準備された0.2 μLのザイモサン溶液を露出した歯髄に置きます。
      注意:ザイモサン溶液の調剤時には注意が必要です。誤って溶液が口腔内にこぼされると、動物の死に至る可能性があります。したがって、ガーゼは歯をドレープし、余分なザイモサン溶液がガーゼに吸収されるようにします(図2D)。
    3. 処理された歯髄は、ジモサン溶液による歯髄炎誘導のために開けたままにしてください。

5. サンプルの準備

  1. 0、6、9、12、24、48、72時間で各グループから5頭の動物を二酸化炭素吸入19で生贄にします。
  2. 7.25リットルの安楽死チャンバーを使いましょう。
  3. CO2でチャンバーをあらかじめ充填しないでください。
  4. 動物を直接チャンバーに入れます。
  5. CO2を1分間チャンバーの30%から70%の充填速度で加えます。
  6. CO2の流量は5L/minに保ちましょう。
  7. CO2を温めて、チャンバー内の空気と混ざるまで放置します。
  8. 23分以内に動物の意識喪失の兆候を観察してください。
  9. 動物の呼吸停止や目が灰色に変わるかどうかを監視してください。
  10. 呼吸停止後も少なくとも1分間はCO2 の流れを維持してください。
  11. 動物の死を確認してから部屋から取り出せ。呼吸がなく、目が青白く見えるか確認してください。
  12. 安楽死後すぐに動物の頭部を分離してください。
  13. 0時で犠牲にした動物の左側の未治療の上顎第一大臼歯を対照として使用してください。
  14. 適切にラベル付けされた15 mL円錐形チューブに10%緩衝ホルマリンを使い、上顎を2日間保存します。

6. 組織学

  1. 固定された顎を10%の蟻酸で3日間脱石させてください。
    注意:3日目以降は、手術用刃で顎を切れるかどうかを確認してください。それでも柔らかくない場合は、再び10%の蟻酸に浸し、毎日チェックして外科用刃で切れるまで続けます。
  2. 22番の刃で顎を切る。切開は咬合面に平行に、矢状面に沿って行い、刃は上顎臼歯の口蓋尖の口蓋側に直接位置します(図3A)。
  3. すべての歯の咬合面にインディアインクを塗りつけてください。
    注:このマーキングは、切片時に咬合面を認識するのに役立ちます(図3B)。
  4. 切断面をベースに向けて、ステンレス製のベースモールドケースにパラフィンワックスを埋め込みます。
    注:この埋め込みにより、切断面が最初にミクロトームに入り、サンプルの向きが正しく、矢状切片が図 3Eに示されるように作られます。
  5. 埋め込まれた顎を含んだ埋め込みカセットをベース型から取り出し、ミクロトームに入れます。
  6. 厚さ3μmの矢状面断片を作成し、クリーンで帯電した顕微鏡スライド(図3C)に置きます。
  7. 複合顕微鏡で染色されていないスライドを観察します。
    注意:切開した部分を観察し続け、咬合面に空洞が見えるようにしてください。切片が上顎第一大臼歯の長軸に沿って矢状面に沿って正しく行われていれば、歯髄全体に1つまたは2つの根と歯髄腔が確認できます(図3E)。この点以降、露光サイズが0.15 mmであるため、理論上は1つのセクションから50枚のスライドを制作できます。(3 μm = 0.003 mm, 0.003 × 50 = 0.15)
  8. 選定されたスライドに対して、根が1つまたは2つ、歯茎室全体を示すためにヘマトキシリンおよびイオシン染色の標準手順を行います。
  9. 染色されたスライドを複合顕微鏡で観察してください。
  10. 最大歯髄空間を観察できる最適なスライドを1時間間隔で5枚選びます。

7. 統計解析

  1. 標準的な統計ソフトウェアを使って統計解析を行います。
    注:定量的な組織形態学的解析のために、各時間区間の観察スライドは既に発表された基準に従って採点されました(表1)8。p=0.0018のボンフェローニ補正を用いたKruskal-Wallis H検定を用いて、異なる時間区間のスコアを比較しました。マン・ホイットニーU検定は、グループAとBの比較にp≤0.05で用いられました。すべての比較は標準的な統計ソフトウェアを用いて実施されました。

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結果

本プロトコルでは、NMRIマウスにおける歯髄炎症の2つの動物モデルに関する詳細なステップバイステップ手順と、対応する組織学的手法を提示します。適切な機器の使用はプロトコルの成功に不可欠です。この点で、10倍傾斜ロングアーム立体顕微鏡は最も重要な機器です。クラス1キャビティ準備は電動マイクロモーターを用いて最大速度の約3分の1(35,000rpm)で行われ、作業が容易で圧縮空気の必要性を排除しました。

図1と 図2 は、この動物モデルにおける傾斜長腕立体顕微鏡の有用性を示しています。傾斜した腕は動物の口腔内を直接視覚化することを可能にします。 図1A は顎クリップの寸法を示しています。寸法は提供されていますが、正確な寸法である必要はありません。試行錯誤を重ねて、オペレーターは自分に合った寸法を選べます。

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ディスカッション

現在のプロトコルでは、NMRIマウスにおけるタイプ3歯損傷モデル(不可逆的な歯髄炎)の開発が報告文献で初めて示されています。また、Zymosan誘発性歯髄炎症の組織学的解析を詳述し、動物の顎から組織学的スライドを作成する再現可能な方法も提供しています。

このプロトコルに従い、NMRIマウスを対象にタイプ3歯科損傷モデルが作成されました。以前の研究はラット、ウサギ、犬1、2、3、4で行われました。口腔の大きさにより、大型動物では歯肉炎症モデルの作製が比較的容易です。マウスのような小動物は非常に狭い口腔空間を持つが、サンプル数が多く倫理的な懸念が少ないという利点がある(20,21

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

この研究は自己資金で行われました。著者らは、ダウ健康科学大学組織学部のムハンマド・アディール氏の組織学支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ベースモールドイタリアのヒストライン研究所R4166C2:D23試料をパラフィンに埋め込むために
カーバイドバー #1/4 弾ミッドウェスト、ウィチタフォールズ、テキサス州389101
複合顕微鏡 Motic BA310Motic Inc. Co. Ltd、香港https://moticmicroscopes.com/products/ba310e
ジクロフェナクナトリウム 25mg/mLインダス・ファーマ(DYCLO)https://sahar.ph/product/dyclo-diclofenac-sodium-25-mg-ml-im-iv/200µL皮下
E型低速ハンドピース Rose201-M4中国の佛山であることhttps://www.beingfoshan.com/en/h-pd-353.html
カセットの埋め込み イタリアのヒストライン研究所R4004
安楽死チャンバーConductScience、イリノイ州アメリカCS-EUTH2A7.25リットル容量、マウスとラット用[最大500g]
ファルコンチューブ 15 ml巣188271
ホルマリン シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国158127buffered 
蟻酸 BDHラボラトリーサプライズ プール(イングランド) 2842810%
均質化器 オムニミキサーホモジナイザー、オムニ・インターナショナル、ジョージア州 アメリカhttps://omni-inc.com/high-shear-lab-homogenizers/omni-th-0-2ml-100ml/omni-tissue-homogenizer-th
インディア・インクシグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国198285
K型15 歯内管ファイルマニ、日本https://www.mani.co.jp/en/product/dental_01.html
ケタミン-キシラジンカクテルブルックス・ファーマ・プライベート・リミテッド / マイラボ(プライベート)Ltd.87.5mg/kgケタミン+12.5mg/kgキシラジン
ミクロトームHM 315 Rドイツ、マイクロム901100
マイクロモーターマラソンIIIBT-マラソン、サイヤン・マイクロテック株式会社、韓国https://www.saeyang.com/theme/basic/sub/product/view.php?it_id=1752202111最大速度の1/3での使用
マイクロピペット0.2-2およびマイクロ;L フランス、ギルソンhttps://www.gilson.com/default/
pipetman-p2-0-2-2-micro-l-metal
-ejector.html?srsltid=AfmBOoobE
0iSWY_902ZHGZ7AoJ6wzN5PI
0H4V4vkxHQgK1mq7Wg2kkbS		0.2-2 & micro;L 
リン酸塩緩衝塩水 シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国P4417
社会科学向け統計パッケージIBM、アーモンク、ニューヨークSPSS for Mac バージョン 23.0  
立体顕微鏡BMK-3リード明治テクノ、日本https://meijitechno.com/product/bmk-3-led-stereo-microscope/
手術用ブレード第22号フェザーサージカルブレード、フェザーセーフティカミザー株式会社、大阪、日本Facebook。12
ザイモサンAシグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国カタログ番号Z42501 mL Zymosan から 1mg/mL

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