多種抗体に対応した経済的かつ普遍的な補償ビーズの調製

サマリー

本プロトコルは、再組換えタンパク質A/G/L結合ポリスチレンマイクロスフィアを用いて、フローサイトメトリーにおける蛍光補償のための多種互換補償ビーズをコスト効率よく調製する方法を説明しています。

要約

このプロトコルは、多色フローサイトメトリーにおける蛍光補償のための多種互換補償ビーズを費用対効果が高く再現性のある方法で準備する方法を説明しています。ここでは、複数の免疫グロブリン結合ドメインを含む免疫グロブリン結合タンパク質A/G/L(Protein A/G/L)を再組換えし、大腸菌(E. coli)で発現させ、ニッケル親和性クロマトグラフィーで精製し、EDC/NHS化学によってカルボキシル化ポリスチレン微小球と共有結合しました。得られたビーズは多様な種やサブクラスの抗体に結合し、補償セットアップに適した強く明確な蛍光信号を生成します。これらの結果は、異なる補償要件に適した蛍光強度を達成するためにビーズ径やタンパク質負荷の選択に関する実用的な指針を提供します。プロトコルの成功は、効率的なタンパク質精製と、フローサイトメトリー解析中の対照ビーズと比較して共役ビーズの明確で高強度の蛍光ピークを示すことを示します。このシンプルでスケーラブルなアプローチにより、標準的な実験室で安定し多用途な補償ビーズの定期的な準備が可能となり、コスト削減とフローサイトメトリーの柔軟性の向上につながります。

概要

フローサイトメトリーは、免疫学、細胞生物学、臨床研究において細胞集団の多パラメータ解析に不可欠なツール^{となっています。}従来の多色フローサイトメトリーにおける重要な課題は蛍光スピロープであり、蛍光色素の発光スペクトルが複数の検出器チャネルに重なり、信号の汚染や誤解釈を引き起こすこと(^4,5)。したがって、正確なデータ解釈には適切な補償が不可欠です。

従来、補正制御は単色染色セルを用いて作成されてきました。しかし、細胞数の制限、抗原発現の変動、抗体の細胞間結合の違い^{が課題となります}。その結果、フルオロクロム共役抗体に結合するよう改変された合成ビーズが実用^{的な代替手段}として登場しています^7,8。ビーズは一貫した結合能力、高い蛍光強度、細胞抗原^{発現レベル}からの独立性という利点を提供します。単一種またはFc制限型捕捉試薬と比較して、複数の免疫グロブリン結合ドメイン(タンパク質A、G、L)を組み込むことで種のカバー範囲と抗体形式の適合性が拡大し、単一のビーズ製剤で多様なフルオロクロム結合抗体を受け入れることが可能になります。

補償に用いられるビーズの中では、タンパク質A、タンパク質G、Lなどの免疫グロブリン結合タンパク質の結合により、異なる種の抗体アイソタイプとの広範な適合性が得られます。タンパク質AおよびGは多くのIgGサブクラスのFc領域に結合し、一方タンパク質Lは免疫グロブリンのκ軽鎖に結合し、Fab断片および単鎖抗体への結合能力を拡大します(^10,11)。

商業用補償ビーズは存在しますが、その比較的高コストが予算の限られた研究所には負担がかかり、そのため広範な応用が制限されることがあります^。これらの課題を踏まえ、研究者がビーズサイズ、抗体結合ドメイン、補償制御に用いる抗体タイプを定義できる柔軟でカスタマイズ可能なビーズプラットフォームが必要です。このプロトコルの目的は、多色フローサイトメトリー用の複数種互換補償ビーズを準備するための、シンプルで経済的かつ再現性のある方法を提供することです。このプロトコルは、タンパク質A、G、Lから複数の免疫グロブリン結合ドメインを含む組換え融合タンパク質の設計、発現、精製を記述し、その後、定義された直径のカルボキシル修飾ポリスチレンビーズへの共有結合を行います。

プロトコルは融合タンパク質の分子設計、大 腸菌 での発現と精製、複数のフルオロクロム結合抗体と適合するビーズベースの補償試薬の調製方法を概説しています。このプロトコルは、免疫学、腫瘍学、トランスレーショナルスタディなど多様な研究環境で多色フローサイトメトリーを行う研究室を対象としており、特にコスト削減、種間適合性、柔軟な補償管理が求められる分野で重要です。

プロトコル

注意: 表1 に記載されたバッファーおよび試薬は新たに準備してください。使用直前にEDCおよびNHS溶液を準備してください。保管しないでください。その他の緩衝剤(溶解液、結合液、洗浄液、MES、PBS、Tris)については、事前にストック溶液を準備し、4°Cで保存してください。 使用前に適切な反応温度(室温または4°C)に平衡保存バッファーを保ちます。FACSバッファーおよび貯蔵バッファーは新鮮に準備するか、4°Cで保存されていることを確認してください。

1. 組換えタンパク質A/G/Lの発現と精製

1. 組換えタンパク質A/G/Lの発現
   1. 標準的な熱ショックプロトコルを用いて、pET28-タンパク質A/G/Lプラスミドを大 腸菌 BL21(DE3)の適合細胞に変換します。
   2. 形質転換細胞をLB寒天に50μg·^mL-1 カナマイシンを包み込み、37°Cで一晩培養します。
   3. 単一のコロニーをカナマイシンを含むLBブロス5〜10 mL(50 μg·^mL-1)に接種し、37°Cで200 × gで振って一晩培養します。
   4. 一晩培養液を、カナマイシンを含むLB200mL(最終濃度50μg·^mL-1)に1:100の希釈で移します。
   5. 培養液を37°Cで培養し、600 nM(OD600)での光学密度が0.6–0.8に達するまで培養します。
   6. 最終濃度0.5 mMにイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加え、28°Cで12〜16時間インキュベートしてタンパク質発現を誘導します。
   7. 細胞は4°C、4000 g 、遠心分離で10分間採取×。
   8. 上清液を捨て、細胞ペレットを溶解バッファーに再懸浮させます。すぐに処理するか、ペレットを-80°Cで保存してください。
      一時停止点:細胞ペレットは溶解前に数週間、-80°Cで保存されることがあります。
2. 細胞溶解
   1. 細菌ペレットを湿った細胞質量1グラムあたり10 mLの溶解バッファーに再懸浮させます。
   2. 細胞を1000バールに設定した高圧均質剤で溶融し、溶液が粘度が低く半透明になるまで2〜3サイクルかけます。
      注:または、パルスモード(5秒オン/10秒オフ)を用いたソニック処理で8〜12サイクルの超音響処理を行うことで、過熱を回避できます。顕微鏡で小さなアリコットを調べて完全な溶解を確実にします。
   3. 溶解液を12000 g × 4°Cで30分間遠心分離します。
   4. 上清液を可溶性タンパク質分画として採取し、精製します。
3. Ni-NTA親和性精製
   1. カラム平衡と試料負荷
      1. Ni-NTAカラムを10 mMイミダゾールを含む結合バッファー(CV)で平衡させます。
      2. 清算済み解体液を0.45μMフィルターでろ過し、最終濃度10mMにイミダゾールを加え、0.5 CV·^min-1でカラムに負荷します。
      3. 結合効率を監視するために流通過分率を収集します。
   2. 洗浄
      1. カラムを10 CVの結合バッファーと20 mMイミダゾールを含む洗浄バッファーで、流量1 CV·^min-1で洗浄します。
   3. 洗脱
      1. 標的タンパク質を1 CV·^min-1の流量でエリュションバッファーで希釈します。
      2. タンパク質含有成分を特定するために、A280を採取しモニタリングします。
   4. バッファー交換とタンパク質貯蔵
      1. 精製されたタンパク質溶液を50 kDa分子量カットオフ(MWCO)遠心超ろ過チューブに移します。
      2. 3,500 × g で4°Cで15〜20分間遠心分離機で、望ましい濃度に達するまで加熱します。
      3. フロースルーを廃棄し、バッファ交換のために保持液にpH 7.4のPBSバッファを等量に加えます。
      4. 遠心分離とPBS交換を2〜3回繰り返し、元のバッファを完全にPBSに置き換えます。
      5. 最終濃度測定の後、残留物を採取し、タンパク質濃度を測定します。
      6. SDS-PAGEで溶出分を検証します。タンパク質A/G/Lの期待分子量は約90 kDaです。
      7. 精製したタンパク質をアリコートし、-80°Cで保存して使用します。
         注意:この段階でプロトコルを一時停止できます。精製タンパク質A/G/Lは後でビーズ結合のために-80°Cで保存できます。濃縮後、200mLの細菌培養から約10mgの精製タンパク質A/G/Lが得られ、最終濃度は2〜5mg·mL⁻¹でした。

2. ビーズをタンパク質A/G/Lに結合させる

1. ビードプレウォッシュ
   1. 渦巻きビーズストックは最大速度で室温(20〜25°C)で20〜30秒間、均等に再懸濁します。0.2 mL 8 μMビーズ(5 mg)を1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
   2. ペレットビーズは遠心分離で、室温で5000 g × 3分間使います。
   3. ペレットを乱さずに慎重に吸引し、上澄液を捨てます。
   4. 1 mL 0.1 M MESバッファーを加え、ピペッティングまたは穏やかな渦巻きで優しく再懸浮させ、再び室温で5000 × g を3分間遠心分離し、上清液を除去します。この洗いを1回繰り返します(合計2回のMES洗い)。
2. EDC/NHSとの発足
   注意:EDCおよびNHSは刺激物であり、適切な個人用防護具を用いて排気フード内で取り扱うべきです。
   1. ビーズを0.5 mLのMESバッファーに再懸浮させ、その後、50 μL 50 mg·^mL-1 NHS、100 μL 50 mg·^mL-1 EDCを順次添加します。
      注意:EDCおよびNHSの溶液は使用直前に新鮮に準備しなければなりません。
   2. ボルテックスビーズを貯蔵し、室温のロータリーシェーカーで30分間孵化させて活性化させます。
3. 活性化試薬を除去して洗浄します
   1. ペレットビーズ:室温で5000 × g、3分。上清液を慎重に取り除きます。
   2. PBSバッファー1mLを加え、優しく再懸濁し、遠心分離機(室温で5000× g、3分)して上清液を除去します。活性化試薬を除去するためにPBS洗浄を1回行います。
4. タンパク質結合
   1. 活性化ビーズペレットを0.4–0.5 mLのPBS(最終反応容積目標0.5–0.6 mL)で再懸濁します。効果的なタンパク質濃度を高めるために、低量に保ちましょう。
   2. プロテインA/G/Lを100μg加え、優しく混ぜます。
   3. 反応を室温のローリングシェーカーで2時間培養して急速結合させ、夜間は4°Cで培養します。ビーズが落ち着かないように、優しく巻くようにしてください。
5. 焼入れ/終端反応
   1. ペレットビーズ(5000 × g、3分)を塗り、上清液を除去します。
   2. 残存するNHSエステルをクエンチするために1 mL 0.1 M Tris(pH = 7.4)を加えます。再懸浮させ、室温で30分間ローリングシェイカーで孵化させます。
   3. ペレットビーズを形成し、同じ1.5mLマイクロ遠心分離機チューブ内で1 mLのPBSで洗浄します。再び遠心分離機(5000 × g、 3分)して上清液を捨てます。その後、0.5mLの貯蔵バッファーでビーズを再懸浮します。
      一時停止点:この段階でプロトコルを一時停止できます。リサスペンドビーズは4°Cで保存可能です。
6. 混ぜて保存する
   1. 共役ビーズと非共役ビーズを数えます。共役ビーズと非共役ビーズを新しい1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブで25%〜75%の比率で混ぜます。
   2. ビーズ混合物を1mLの貯蔵バッファー(PBS含有1%BSAと0.05%抗菌防腐剤を含む)に懸浮させます。
   3. 懸濁液をラベル付きのチューブに移し、4°Cで保存します。 光保護は必須ではありません。使用前に優しく再懸浮させてビーズの分布が均一になるようにしてください。このような条件下では、ビーズは少なくとも6ヶ月間は安定しています。

3. 代表QC

1. 100μLの蛍光抗体と共役ビーズ100μLを室温のFACSバッファーで15〜30分間インキュベートします。
   注意:各チューブには蛍光抗体は1種類のみ含まれているべきです。
2. 1 mL PBSでビーズを洗浄し、300〜500 μL PBSに再懸浮させてフローサイトメーターで動作させます。
3. 抗体に結合した蛍光分子(例:FITC結合抗体には488 nMレーザーとFITC検出器)に基づいて検出チャネルを設定します。代表的な光電子増倍管(PMT)の0〜200 Vの電圧範囲を出発点として使用し、機器の性能に応じて調整することができます。サンプルごとに少なくとも10,000件のイベントを収集してください。
4. FSC/SSCによるビーズのゲート。陽性ビーズは蛍光球チャネルに高いMFIを持つ明確な単一ピークを示すべきです。ネガティブコントロールは背景のみを表示するべきです。

結果

組換え融合タンパク質A/G/Lは816個のアミノ酸からなり、分子量は90.5 kDaと計算されています(補足ファイル1)。この融合タンパク質は、タンパク質Aから5つのIgG結合Bドメイン、タンパク質Gから2つのIgG結合ドメイン、タンパク質Lから5つのκの軽鎖結合Bドメインを保持しつつ、アルブミン結合ドメインは除去されています(図1A、 補足表1)。共有結合を促進するためにC末端にシステイン残基が追加され、Ni–NTA親和性クロマトグラフィーを用いた効率的な精製を可能にするために6× His タグが導入されました(図1A)。

SDS–PAGE解析では約90 kDaの顕著なバンドが認められ、これはタンパク質A/G/Lの期待サイズに対応しており、発現タンパク質の大部分が可溶性であることを示しました。Ni–NTA親和性精製後、ターゲット...

ディスカッション

このプロトコルは、組換えタンパク質A/G/Lに基づく蛍光補償ビーズの実用的かつ効率的なワークフローを説明しています。この手順には、細菌発現、Ni-NTA親和性精製、EDC/NHS化学を用いた精製タンパク質のカルボキシル修飾ポリスチレン微小球への共有結合が含まれます。得られるビーズは複数の種やサブクラスの抗体に結合でき、フローサイトメトリーにおける蛍光補償のための多用途かつコスト効率の高いツールを提供します。

市販のカルボキシル修飾マイクロスフィアの使用により、この手順が大幅に簡素化されます。一般的な生物学実験室では、均一かつ単分散のカルボキシル化マイクロスフィアの合成は技術的に要求が高く、粒子サイズや表面電荷の変動を引き起こすことが多いです。これに対し、市販のマイクロスフィアは安価で高品質かつ再現性が高く、例えば250 mgのカルボキシル修飾マイクロスフィアは約21ドルで購入でき、反応の安定で信頼性の高い基材を提供します。

市販の抗体キャプチャビーズは通常、供...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AF647 ラット Ig2a	バイオレジェンド	141711
APCマウス IgG1	バイオレジェンド	353311
BL21(DE3)有能な細胞	サンゴン	B528414
BSA	ソーラービオ	A8010
EDC	サーモ・フィッシャー	22980	CAS: 1892-57-5
FITC アルメニアンハムスター IgG	バイオレジェンド	400905
イミダゾール	シグマ・オルドリッチ	I202	CAS: 288-32-4
IPTG	ゴールドバイオ	I2481C	CAS: 367-93-1
カナマイシン	サンゴン	A600286	CAS: 8063-07-8
KCl	アラジン	P112134	CAS: 7447-40-7
KH2PO4	アラジン	P434010	CAS: 7778-77-0
MES	シグマ・オルドリッチ	M3671	CAS: 145224-94-8
Na2HPO4	アラジン	S274390	CAS: 7558-79-4
NaCl	アラジン	C111549	CAS: 7647-14-5
NHS	サーモ・フィッシャー	24500	CAS: 6066-82-6
Ni NTAビーズ 6FF	スマート・ライフサイエンス	SA005005
PEマウス IgG2a	バイオレジェンド	362603
プロクリーン300	ビヨタイム	ST853
Tris	シグマ・オルドリッチ	252859	CAS: 77-86-1
トリプトン	オキソイド	LP0042
超遠心フィルター、50 kDa MWCO	ミリポール	UFC9050
均一カルボキシルポリスチレン微小球	トマイクロ・バイオテック	10ml、25mg/ml	上海、中国
酵母エキス	オキソイド	LP0021