人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

Summary

ほとんどのアッセイは、単一セルの分解能が不足しているため脳組織の細胞の不均質性は、クロマチンにおけるエピジェネティックなマーキングの研究のための重大な制約をもたらす。ニューロンは通常、グリア細胞および他の非神経細胞が混在しています。私たちは、人間の脳から神経細胞核を抽出して収集するプロトコルを提供しています。

Abstract

人間の脳のニューロンは、主に出生前の開発中に分裂となるため、完全な生涯を通じて、その核を維持する。しかし、少しは開発し、老化の過程で、または慢性の精神神経疾患における神経細胞のクロマチンと核組織の変化についてはほとんど知られていない。しかし、ほとんどのクロマチンおよびDNAベースのアッセイ（FISH以外の）不足、単一セルの分解能日付を記入すること。神経細胞の典型的に様々な亜集団がグリア細胞と他の非神経細胞の種類と混ざりされているため、この目的のために、脳組織のかなりの細胞の不均質性は、重要な制限をもたらす。一つの可能​​な解決策は、細胞型特異的な文化を育てることですが、神経細胞を含むほとんどの中枢神経系の細胞は、、数週間で、最高の状態で、持続可能なex vivoのであり、したがって潜在的に完全な寿命にわたって動作エピジェネティックな機構のための不完全なモデルを提供するであろう。ここで、我々は凍結（固定しない）人間の死後の脳から核を抽出し、精製するプロトコルを提供しています。方法は、抗NeuN抗体による超遠心やimmunotagging続いて、低張溶解緩衝液中で核の抽出を行います。標識された神経核は、蛍光活性化ソーティングを使用して別々に収集されます。このメソッドは、種の広い範囲内の任意の脳の領域に適用し、サイトと修正特異的抗ヒストン抗体とクロマチン免疫沈降の研究のための、およびDNAメチル化および他のアッセイに適しているはずです。

Protocol

核抽出

1. douncerに5 mlの溶解バッファー¹で冷凍死後の脳組織の250mgを入れ、氷の上に置きます。ソートFACS後の約500万人の核を受信するには、我々は通常、サンプルあたり組織の1000mgのを使用してください。
2. 組織が融解した後、しばらく氷上で1分間組織をダウンス。
3. ホモジナイズした組織を取り、15 mLの明確な遠心チューブに入れてください。チューブを氷上に置く。
4. 、ピペットでショ糖溶液²の9 mLを取る明確な超遠心チューブの底にピペットを入れ、ショ糖液²の上にホモジナイズした組織液で濃度勾配を作成するためにショ糖液^2を離します。
5. 超遠心機の中で回転しながら、それらがすべてバランスされることを確認するために超遠心チューブを秤量する。最上層に溶解バッファー^1を添加することにより重量に任意の調整を行う。
6. チューブの重量を測定された後、ローターのバケットに入れます。
7. SW28ローター中にすべてのバケツを置き、慎重に超遠心機にローターを配置。
8. 4℃で2.5時間107163.6 RCFでサンプルを超遠心機℃に
9. 遠心分離が完了するとチューブの下部にある原子核を含むペレットを乱さないように注意しながら、、真空を使用して、濃度勾配で見つかった残骸の層と一緒に、上清を取り除く。
10. 各ペレットに1X PBS 500μLを追加し、20分間氷上に放置。これは、後で簡単に機械的ストレスの量は核の経験を少なくなる、ピペッティングによってそれを溶解すること、ペレットが独自に少しを溶解することができます。
11. 原子核は、20分間氷上でインキュベートした後、機械的に完全に1XPBS内核を溶解するために上下にピペッティングし。
12. 超遠心管から核を含有する溶液を除去し、単一の2 mLのマイクロ遠心チューブに2本の管の内容を組み合​​わせる。再び、氷の上にサンプルを置きます。

FACSのために免疫染色

1. この時点で、一次および二次抗体、およびブロッキングミックスで構成される免疫染色液を作る。各サンプルについて、NeuN抗体、1XPBSに0.5％BSA、10％正常ヤギ血清を含む、およびAlexa Fluor 488の1μLミックスをブロッキングの100μL、1.2μLを含む1XPBS300μLを組み合わせる。コントロールのサンプルについては、一次抗体のNeuNを除外し、代わりに、単により多くの1XPBSを追加。
2. 渦暗所で室温にて5分間、免疫染色混合物とインキュベート。
3. 染色混合物がインキュベートされている間、サンプルのコントロールを行います。ソートFACSの場合、サンプルは、単独で核を含む、"未染色のコントロール"が必要とされると呼ばれる、番目のサンプル、ネガティブコントロール、一次抗体のNeuNも必要とされることなく、二次抗体のAlexa Fluor ® 488核を含む。
4. ネガティブコントロール用1XPBS 980 ULを含む別の2 mlチューブに染色制御用1XPBS、そして別の20μLを含む2 mlのマイクロチューブに溶液を含む原子核のアリコートを20μL。核含有1XPBSとバックアップを1 mLのサンプルの音量を上げる。すべてのサンプルは氷上に戻って配置されます。
5. 免疫染色の混合物がインキュベート終了したので、適切なサンプルに401μLのその内容を追加します。負のサンプルのみを二次抗体のAlexa Fluor ® 488を含む混合物を受け取る一方核のサンプルは、NeuNおよびAlexa Fluor 488の両方を含む混合物を受け取ります。
6. 45分間暗所で回転するように寒い部屋にサンプルを取る。
7. サンプルは45分間、暗所でインキュベートした後、氷の上に置くとFACSの施設にそれらをもたらす。 FACSの施設への輸送中に、サンプルは氷上で、暗所で保管してください。

FACS

1. FACSの施設で、40ええとフィルタを通してサンプルをフィルタリングする。次に、ソートの前にいくつかの予備データを取得するためには、低温に保たれている間、数分間楽器を介してそれらを実行する。
2. この時点で、それは、ソートに必要な適切なゲートを設定する必要があります。いくつかの異なるゲートは、ソートのサンプルに使用されます。最初のゲートは、サンプル内にある別の原子核の大きさのアイデアを与え、実際の原子核からごみのseparatationすることができます。秒のゲートは、私たちが個々に核をソートすることができます。破棄いかなる凝集体はこの時点で破棄されます。最後に、第3のゲートは、私たちの二次抗体で検出された蛍光色素のことと一致する、特定の蛍光波長に設定されています。このゲートを配置することで、並べ替えることができます、したがって、別のNeuN +の、NeuNから神経細胞の核 - 核。
3. すべてのゲートが選択された後、核が1XPBSに並べ替えることができます。
4. 一全サンプルが通過した、楽器によってソートされた試料のアリコートを実行することにより、ソートの純度を確認してください。サンプルの蛍光が広がっていない、のではなく、単一の象限内に含まれていることを確認してください。 90％以上の純粋なサンプルを選択することが最善です。

FACSの後

1. サンプルがソートされると、原子核の処理を開始することができます。ソートされたサンプルの10mLを取り、それにショ糖液²の2 mlを加え、1M CaCl ₂及び1メートルマグネシウム（エース_）2の30 ulの50μlの。念のため、常に核に修正されていないなので、サンプルを氷上で保管してください。
2. ソートされたサンプルの10未満mLのがある場合は、1XPBSを追加することによって、10mLに音量を上げ上げ、またはそれに応じて追加の材料を調整する。
3. サンプルを15分間氷上で数回と場所を反転。
4. サンプルは15分間氷上でインキュベートした後、4℃で15分間1786 RCFで、スイングバケットローターでそれらを遠心^℃に
5. チューブの下部にある白いペレットが剥がれないように、真空の使用で上清を捨てる。
6. 先に進むの実験に必要なあらゆる溶液200μlにペレットを溶解し、上下にピペッティングし。
7. 小さなチューブにソリューションを転送し、さらに使用するまで-80℃の冷凍庫に保存してください。

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、より一般的にはエピジェネティックな神経細胞クロマチンの変化と、上に、神経核の分子表現型上に、通常の開発と老化の間に、または神経学的または精神疾患に焦点を当てた研究のために特に有用であろう。潜在的な老化の過程でニューロンからグリアの配給量の変化や病気に起因するを含む脳組織の細胞の不均質性は、懸念さ^1のときの方法が特に有利で ​​ある。例えば、クロマチン免疫沈降の技術と現在のソートプロトコルを組み合わせることにより、我々は最近、神経栄養因子（BDNF）遺伝子のプロモーター、およびその他の神経細胞の遺伝子のための²由来の脳で神経特異的ヒストンメチル化パターンを説明した。同様のメソッドは、遡及誕生デート³の成人の大脳皮質から神経細胞を収集するために以前に使用されていた。ソート技法は、マウス脳の²で採用され、ために核の安定性の凍結後融解した組織を、我々はここで紹介するアプローチは、種の広い範囲に適用可能であることが予想される。れましたため、わずか10,000細胞のクロマチン免疫沈降法をさらに包括的なゲノムカバー率⁴で実現可能なので、我々は上記で推奨する...

Materials

1。溶解バッファー
0.32M	スクロース	5.47グラム
5mMの	CaCl 2の	250μlの
3mMの	MG（アセテート）2	150μlの
0.1 mMの	EDTA	10μlの
10mMの	トリス- HCl、PH8	500μlの
1mMの	DTT	17μlの
0.1パーセント	トリトンX - 100	50μlの
オートクレーブした水で50mlにボリュームを調整

2。蔗糖液
1.8 M	スクロース	30.78グラム
3mMの	MG（アセテート）2	150μlの
1mMの	DTT	17μlの
10 mMの	トリス- HCl、PH8	500μlの
オートクレーブした水で50mlにボリュームを調整

3。バッファをダウンス
10 mMの	トリス	0.242グラム
4mMの	MgCl 2の	0.163グラム
1mMの	CaCl 2の	0.03グラム
pHを7.5に調整し、オートクレーブした水を加えて200mlにボリューム