CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング

Summary

シンプルで具体的な方法は、分別工程なしで蛍光標識し、細胞表面タンパク質の拡張検出用に実証された。細胞表面タンパク質の差の存在量は、（2 - D）二次元電気泳動とEttan™DIGE技術を用いて解析した。

Abstract

表面タンパク質は、その環境に反応すると、隣接細胞と相互作用する細胞の能力の中心となっています。彼らはほとんどすべての細胞内シグナル伝達の誘導剤であることが知られている。また、彼らは環境適応や薬物治療で重要な役割を果たしており、しばしば疾患の病因と病理学（1）に関与している。タンパク質 - タンパク質相互作用は、シグナル伝達経路に固有であり、これらの複雑な生物学的プロセスのより多くの洞察を得るために、高感度かつ信頼性の高い方法は、細胞表面のタンパク質を研究するために必要とされる。二次元（2 - D）電気泳動は、差動の変化を研究するために複雑なタンパク質サンプルのバイオマーカーや他の標的の検出のために広範に使用されます。彼らの低濃度（細胞タンパク質の1 2％）が部分的に原因の細胞表面タンパク質は、分画もしくは濃縮のいくつかの他のタイプなしで2 - Dゲルで検出するのは困難である。彼らはまた、しばしば不十分な彼らの疎水性の性質と高分子量（2）による2 - Dゲルで表されます。本研究では、我々はタンパク質のこの重要なグループの特定のラベリングと検出のためのCyDye DIGEフルーア最小限の染料を使用して完全な細胞のための新しいプロトコルを提示する。結果は、細胞内タンパク質の最小限のラベルを持つ細胞表面タンパク質の大量の特定のラベルを示した。このプロトコルは、使用するために、迅速に簡単です、そしてすべての3つのCyDye DIGEフルーア最小限の色素（CY 2、サイ3、Cyの5）の細胞表面タンパク質を標識するために使用することができます。これらの機能は、DeCyder 2次元差分解析ソフトウェアを用いてタンパク質発現の変化のEttan DIGE技術と解析との2次元蛍光差ゲル電気泳動（2 - D DIGE）を用いて多重化することができます。細胞表面タンパク質のレベルは、時間の種々の長さのためのCHO細胞（表1参照）の血清飢餓の間に続いた。存在量の小さな変化を高精度に検出され、その結果は定義されている統計的手法によってサポートされています。

Protocol

細胞の培養

1. グルタミンとF - 12ハムの培地私は10％ウシ胎児血清、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlの硫酸ストレプトマイシン（Invitrogen）を含むの標準的な細胞培養の手順を使用して、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO - K1）を成長する。
2. 無血清培地に培地を交換する。 CyDye DIGEフルーアと異なる時間点Cy3またはCy5最小限の色素（以下、節の細胞表面のラベルを参照）にあった細胞表面タンパク質にラベルを付けます。
3. CyDye DIGEフルーアCy2と、各時点とラベルからの細胞のプールが同数。それぞれの2 - Dゲルのための内部標準としてこれらを使用してください。
4. 実験の大半は、CHO - K1細胞で行うことができますが、マウス胚線維芽細胞（3T3 L1）とマウスの腹水リンパ腫リンパ芽球（EL4）も（データは示さず）が使用できます。
5. グルタミンIIを含むDMEM培地での後者の2つの種類の細胞を成長させる、しかし、そうでない場合は、CHO - K1細胞に使用する同一の条件を使用してください。

細胞表面のラベリング

1. 慎重に数えて、5〜10 x106細胞のアリコートに分割し、非酵素的に接着細胞を切り離します。懸濁液中で増殖する細胞の場合は、切り離し手順を省略します。
2. 5分間、約800 × gで細胞懸濁液を遠心してください。培地を含む上清を取り除く。
3. 1ミリリットルの氷冷ハンクス平衡塩溶液（HBSS）pH8.5中でresuspendionでペレットを洗浄してください。 4 800 XG℃で2分間で遠心分離。
4. 上清を除去し、200μlの氷冷標識バッファー（HBSS pHは8.5、1 Mの尿素）で細胞ペレットを再懸濁します。
5. 暗所で氷上で20分間、600 pmolのCyDye DIGEフルーア最小限の色素との完全な細胞にラベルを付けます。
6. リジン20μlの10mMのを加えて反応をクエンチ。 10分間インキュベートする。
7. 4 800 × gで遠心分離℃で2分間に続いて500μlのHBSS pHを7.4に再懸濁によって二回表面標識細胞を洗う。

細胞溶解と分画

1. 150μlの冷溶解バッファー（7 M尿素、2 Mチオ尿素、4％CHAPS、30mMのトリス、5mMの酢酸マグネシウムのpH 8.5）で表面標識細胞を溶解する。時々ボルテックスしながら少なくとも1時間氷上にしておきます。
2. 4℃で10 000 × gでライセートを遠心℃で5分間。上清を新しいチューブに移す。このサンプルは、すべての細胞タンパク質を含有する非画したサンプルです。
3. 並行して、前の2次元ゲル電気泳動への膜と細胞質分画に（膜分画キットを使用して、Pierce）を分画するし、上記のように、細胞ペレットを洗浄する。膜画分は、内部と細胞表面の膜タンパク質が含まれています。
4. 比較のために、標準的なEttan DIGEの手順^3を実行し、溶解、ラベル、および、最終的に、細胞を分画する。 Dクワントキット（GEヘルスケア） - 2を用いてサンプル中のタンパク質濃度を決定する。

2次元電気泳動

1. イモビのDryStripゲル、イモビDryStrip Reswellingトレイ、一晩450μlのDeStreakの補液で24センチメートル（0.5％、IPGバッファー）を用いてpH 3 - 11NL（24センチ）再水和。
2. マニホールドの陽極カップローディングでDryStripゲルをイモビ、指示に従ってEttan IPGphor II IEF Systemを使用して等電点電気泳動（IEF）を実行するCyDye標識サンプル（50μgの総タンパク質量に相当）適用されます。
3. IEF後、大（26 × 20センチ）12.5％ポリアクリルアミドゲル（SDS - PAGE）上の二つの手順と場所でストリップを平衡化します。 0.5％アガロース（ブロモフェノールブルーを含むバッファを実行しているの）とのオーバーレイ。色素フロントがゲルの底に達するまで30分間、5 W /ゲルで、その後15 W /ゲルでEttan DALTtwelve大きな垂直軸システムを用いて2次元電気泳動を実行します。

イメージングとデータ解析

1. 2次元電気泳動を完了した後、台風9410可変モードのイメージャを使用してCy2と、Cy3またはCy5用ゲルをスキャン。
2. 膜画分、細胞質分画、およびDeCyder 2次元差分解析ソフトウェア^4を使用^して非画した試料からスポットマップを比較する。

後染色

1. イメージング後、銀は標準的な手順⁵にしたがってゲルを染色。

タンパク質の同定

1. 、収穫の成長、などの非画したサンプルのため、上記の分取量（10 x106 CHO細胞から約1 mgの総タンパク質）の細胞を、洗浄し、溶解する。スパイクとしてCy5標識細胞表面標識サンプル（上記参照）を使用し、そしてタンパク質の非標識取量と一緒に適用されます。
2. 上記のような2次元電気泳動を行うが、今回は、aplly 600μgのラベルの付いていないセルは、アノードカップのアプリケーションによってスパイクラベル付け50μgの細胞表面と一緒にライセート。正しいスポットピッキングを可能にするために、基準マーカを使用して、となる配置提言³に記載のゲルキャスティングの前にガラス板をトゥイーン。
3. ディープパープルの全タンパク質染色^3を使って総タンパク質の染色をCy5で細胞表面のスポットのマップを、得るためにCy5をチャネルでゲルをスキャンします。
4. DeCyder 2次元ソフトウェアを使用して2つのスポットのマップを一緒に一致させるとCy 5標識細胞表面タンパク質に対応する全てのスポットのピックリストを作成します。 Ettanのスポット処理ステーションを使用して細胞表面タンパク質を選んで、ゲルプラグから抽出し、EttanのDigesterを使ってtrypsinate。 MALDI - TOF質量分析法を用いて識別する。

表1。Ettan DIGEの実験は図1の細胞表面タンパク質標識プロトコールに従ってラベル血清枯渇細胞からサ ​​ンプルを用いて行った。

サンプル	血清枯渇の時間	CyDyeでLabelled	ゲル番号
1	-	CY 3、CY 2	1
2	30分	CY 5、CY 2	1
3	2時間	CY 3、CY 2	2
4	4時間	CY 5、CY 2	2
5	16時間	CY 5、CY 2	3

Discussion

タンパク質濃度

twoラベリングワークフローの概要を図1に示されています。細胞表面タンパク質標識プロトコールに従ってラベル際に細胞がまだそのままなので、唯一の細胞表面タンパク質は、染料にさらされている。細胞内部だけでなく外部の標識とタンパク質が（図1）ラベルが付いている前に、標準的なEttan DIGEプロトコールでは、細胞を溶解している。細胞表面タンパク質は、特に定量することができないので、細胞表面のタンパク質標識プロトコルのタンパク質への染料の相対的な量は、知られていない。しかし、それは細胞表面のタンパク質が細胞タンパク質²の非常に低い割合を構成することが知られている。染料の600 pmolのに約5〜10 × 10 ⁶細胞を使用した。本研究でnonfractionatedサンプルの唯一の12.5から25パーセントは、2次元電気泳動のために使用されて以来、それは少数の細胞を使うこともできます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	試薬	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	試薬	GE Healthcare	80-6484-51
IPG バッファー pH 3-11NL	試薬	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	試薬	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	試薬	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	試薬	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF ユニット	機器	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor マニホールド	計器部品	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve ゲルキャスター	ツール	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve 分離ユニットおよび電源・制御ユニット	計器	GE Healthcare	80-6466-46	230 Vユニット 80-6466-27
Typhoon 9410 可変モードイメージャ		機器 GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	その他	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
尿素	試薬	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOneジチオスレイトール(DTT)	試薬	GEヘルスケア	17-1318-01
モフェノールブルー	試薬	GEヘルスケア	17-1329-01
ス	試薬	GEヘルスケア	17-1321-01
デシル硫酸ナトリウム(SDS)	試薬	GEヘルスケア	17-1313-01
プラスワングリセロール87%	試薬	GEヘルスケア	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T、3% C	試薬	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	試薬	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne 過硫酸アンモニウム試薬		GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	試薬	GE Healthcare	17-1323-01
膜タンパク質の2Dサンプル調製	試薬 Pierce	, Thermo Scientific	89864
硫酸ストレプトマイシン	試薬	Invitrogen	15140-122