非放射性その場でハイブリダイゼーションプロトコール
2009年4月17日
我々は、修正されたDIGを説明その場でのハイブリダイゼーションプロトコル、。変更されたRNase処理とプロテイナーゼKの濃度を含むだけでいくつかの調整、と、プロトコルは、さまざまな組織や種の研究に使用されることがあります。
欧州トウヒおよび広範な植物種に適用可能な、非放射性in situハイブリダイゼーションプロトコル。Carre Etal. こんにちは、AM GaNです。私たちは、スウェーデンのOBS大学およびスウェーデン農業科学大学で研究を行っています。
私たちは、いくつかの異なる植物種に適用可能な昆虫訪問プロトコルを確立しました。本日は、その中でも特に精緻な操作を要する手順について解説します。このプロトコルでは、包埋、切片作成、および実際の昆虫訪問実験におけるさまざまなステップについて説明します。
それでは、ラボ1の「固定および包埋」のプロトコルにおけるステップ9から11へ進みます。ステップ9、ペトリ皿とモールドを60 °Cで予熱します。ステップ10、ピンセットを加熱し、組織を皿の中に均等に配置します。
組織が完全に浸るまで、組織用パラフィンをさらに追加してください。ステップ11では、パラフィンを室温で凝固させます。プロトコルのステップ12から19までを順に実施してください。
ホットプレートの電源を入れ、溶かした組織用ワックスを用意します。コールドルームからサンプルを取り出します。ステップ13では、メスを使用して組織のワックスブロックを慎重に切り出します。
スライスしやすくするために、サンプルの形状を整えます。ステップ14では、ブロックの底部と踵部分を加熱して融合させます。その後、準備したサンプルを4°Cで硬化させます。
ステップ15では、ワックスブロックを6～8 µmの厚さに薄切します。ミクロトームを用いて、切片を1本の長いリボン状に連結させます。リボンを切り取り、紙の上に移動させます。
この時点で、実体顕微鏡下で個々の切片を観察し、目的の切片を選択することが可能です。組織がエオシンで染色されていれば、観察は容易になります。ステップ17では、スライドにRNaseフリーのMilli Q水を滴下します。
リボンを小さく切り、スライドガラス上に置きます。スライドガラスをホットプレートに移動させます。ステップ17：リボンを42 °Cのプレート上で1〜2分間平坦化させます。
Kimwipeを使用して水分を拭き取ります。ステップ19、組織がスライドに密着するように、スライドを42 °Cで一晩インキュベートします。in situ ハイブリダイゼーション 4.1 in-situ セクション。プロトコルの前処理ステップ36から48に従ってください。
ステップ36では、組織層の切片を脱パラフィンします。スライドは等間隔に配置し、異なる容器間での移動を容易にするためにラックに入れます。切片を脱水します。エタノール系列にて、激しく撹拌しながら無水酢酸を加えます。
ステップ45、無水酢酸処理の準備。4.2 in situ ハイブリダイゼーション。プロトコルにおけるステップ49から52。ステップ51、ProOne Plusスライドのエージング。
溶液は粘性が高いため、気泡が入らないように注意してください。スライドは湿室でインキュベートします。
4.3 初期化。ハイブリダイゼーション後、プロトコルのステップ53から72までを実施する。ステップ62では、スライドをバッファーブロックと共にプラスチック容器に入れてインキュベートする。
ステップ63、スライドがちょうど浸かる程度のブロッキング溶液を加えます。抗体はエイジング法を用いてスライドに添加します。エイジング法はProb Bon Plusスライドでのみ有効です。同様の設計のスライドを使用する場合は、ステップ65、毛細管現象によって抗Dig抗体溶液が吸い上げられるようにしてください。
この手順を繰り返します。ステップ70と同様に、サンドイッチしてWestern blue溶液を吸い上げます。anti-dig抗体溶液のときと同様に、Western blue溶液を2回吸い上げる点に注意してください。
ステップ65およびステップ71において、スライドを暗所で1〜5日間インキュベートします。室温で、実体顕微鏡を用いてハイブリダイゼーション信号のモニタリングを行うことができます。スライドがサンドイッチ状態にある間に、紫色から茶色の染まりが観察できるはずです。
これが実際のCWステーション実験における結果の様子です。ここでは、紫色または茶色の染色としてシグナルを確認できます。
概要
本記事では、欧州トウヒを含むさまざまな植物種に適用可能で効率的な、改良版DIGインサイチューハイブリダイゼーションプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、さまざまな組織や種への適用性を高めるため、RNase処理やプロテイナーゼK濃度の変更といった特定の調整が盛り込まれています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 植物生物学
- 分子生物学
- in situ ハイブリダイゼーション法
背景
- in situ ハイブリダイゼーションは、組織における遺伝子発現を研究するための有用な手法です。
- 従来の手法は時間がかかり、種特異的である場合があります。
- 既存のプロトコルを改良することで、効率性と汎用性を向上させることができます。
- 本研究では、さまざまな植物種に適したプロトコルに焦点を当てます。
研究目的
- より迅速で適応性の高いin situハイブリダイゼーションプロトコルを開発すること。
- 本プロトコルの欧州トウヒおよびその他の植物種への適用可能性を実証すること。
- 研究者向けに詳細な手順を提供すること。
使用方法
- 植物組織の包埋および切片作成。
- in situ 解析のための前処理およびハイブリダイゼーション工程。
- 結果を最適化するための特定の試薬および条件の使用。
- 顕微鏡下でのハイブリダイゼーション信号のモニタリング。
主な結果
- 改良されたプロトコルにより、複数の植物種におけるin situハイブリダイゼーションが効率的に実施可能となりました。
- RNase処理とプロテイナーゼK濃度の調整により、組織への適合性が向上しました。
- ハイブリダイゼーションシグナルの鮮明な可視化が達成されました。
- 本プロトコルは、さまざまなアプリケーションにおいて効率的かつ再現性があります。
結論
- 改変DIGインサイチュハイブリダイゼーションプロトコルは、植物研究において価値の高いツールである。
- これにより、多様な植物組織における遺伝子発現の迅速かつ効果的な解析が可能となる。
- 今後の研究では、本プロトコルを基盤として、植物生物学におけるより幅広い応用展開が期待できる。
よくある質問
産業界における重要性
このプロトコルは、植物系における高解像度の空間的遺伝子発現解析を可能にし、組織特異的な発現パターンを確認することで、初期探索におけるターゲットバリデーションを支援します。放射性同位体への依存や広範な種特異的な最適化を軽減し、種間比較研究における再現性とスケーラビリティを向上させます。本手法は、植物ベースのバイオファーマパイプラインにおける表現型スクリーニングおよびトランスレーショナルなバイオマーカー探索に対し、メカニズム的なリスク低減（de-risking）の価値を提供します。
バイオ製薬研究開発における戦略的活用
初期発見および標的バリデーション
- 科学的価値： 組織特異的なmRNA局在を確定させることで、治療上の仮説を検証し、生殖発達経路における遺伝子機能を明らかにします。
- 運用上の価値： 裸子植物および被子植物モデルにおける雄性生殖器官での遺伝子発現を直接可視化することにより、機能的なターゲット検証を可能にします。
- 予測的価値： Arabidopsis、Brassica、および欧州唐子松の花器における相同遺伝子（例：AP3相同遺伝子）の保存された発現パターンを実証することで、予測の信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： DIGラベルプローブを用いた一貫性のあるシグナル検出により、下流のハイブリダイゼーションアッセイに向けた標準化組織切片を調製します。
- 再現性： RNase処理を排除し、プロテイナーゼKの濃度を調整することで、シグナル強度を高め、種間での変動を低減します。
- 拡張性： 最小限のプロトコル調整で、多様な植物種へのハイスループットな適用を容易にし、比較ゲノミクスにおけるプラットフォームの再利用を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳の連続性： モデル被子植物から裸子植物への適用可能性を実証し、バイオマスおよびバイオポリマー生産に関連する多年生木本系への知見の外挿を支持する。
- メカニズムによるリスク低減： 配列相同性と保存された発生構造における空間的発現を関連付けることで、遺伝子機能割り当てにおける曖昧さを軽減する。
- バイオマーカーの整合性： 生殖組織における遺伝子発現と表現型形質の空間的相関を可能にし、植物分子農業におけるバイオマーカーの探索を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法はディスカバリーバイオロジー（探索生物学）フェーズに適合しており、植物ベースの発現系におけるリード化合物のスクリーニングに先立ち、仮説に基づいたターゲット同定を可能にします。
- 探索生物学： 特定の組織および発生段階における候補遺伝子の空間的発現を検証することで、仮説検証を支援する。
- スクリーニング： 定量的な空間的リードアウトを生成し、形質転換組織または処理済み組織における化合物効果のモニタリングに向けたアッセイ設計に情報を provide する。
- 分析： イメージングおよび実験条件間の比較分析に適した、検出可能な発色シグナル（紫から茶色）を生成する。
- トランスレーショナルリサーチ： 生殖器官における遺伝子発現パターンと発生表現型を関連付け、形質検証パイプラインにおける進展決定を支援する。
- エンタープライズ再利用： 種をまたいだ遺伝子発現分析のための標準化され適応性のあるワークフローを確立し、冗長な最適化の手間を削減する。
運用および企業への影響
- 科学的価値：放射性物質による危険を伴わず、空間分解能を持つ直接的なmRNA検出を行うことで、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用の価値：RNase処理を排除し、プロテインase Kの使用を標準化することで再現性を高め、プロトコルの失敗率を低減します。
- 戦略的価値：創薬の早期段階で明確な発現データを提供することにより、ターゲット選定におけるgo/no-go判断を加速させます。
- ポートフォリオへの影響：種を越えて保存された発現パターンに基づいて、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にし、ダウンストリームアプリケーションにおける成功率を向上させます。
実施上の考慮事項
- 植物試料の組織学、組織包埋、および切片作成に関する専門知識が必要である。
- ミクロトーム、ハイブリダイゼーションオーブン、および発色検出システムの利用が可能であることに依存する。
- 組織密度およびフェノール含有量に基づいたproteinase K濃度の標準化が必要である。
- 種やプローブの長さに応じて、インキュベーション時間および温度の調整が必要となる。
- 高度に木質化した試料や二次代謝産物が豊富な試料では、組織の自家蛍光および化合物の浸透が制限要因となる。
