Name: 非放射性その場でハイブリダイゼーションプロトコール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学ぶノルウェースプルースを含む多様な植物種に適用可能な非放射性インサイトゥハイブリダイゼーション法。RNase処理とプロテイナーゼK濃度の調整により、組織適合性と効率性を向上させた実験プロトコルを詳しく解説します。

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我々は、スピーカーの音声になるボランティアのための私達の映画の音楽を提供し、マイケルエリオットの株式にアンダースBovinに非常に感謝しています。サポートがカールTrygger財団、農業科学、スウェーデン研究評議会（VR）のスウェーデンの大学戦略的研究プログラム農業ゲノム機能（AgriFunGen）、および環境のためのスウェーデンの研究評議会、農業科学、及び空間計画（FORMASによって提供されていました）。

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<li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

Pの二つの側面トドマツプロトコルはAに比較して最適化されたシロイヌナズナ/ B.セイヨウプロトコル、RNase A処理およびプロテイナーゼKの濃度。 RNaseはバックグラウンド信号を除去し、従って信号の特異性を17増加させる。プロテイナーゼK処理、プローブが入ると興味のRNAのプールにハイブリダイズすることができるように組織を透過するために必要です。 DAL13アンチセンスプローブは、30分（図2D、FおよびH）のためにRNaseで処理のセクションに比べてのRNase処理（図3C、E、G）なしで高いシグナルを与えた。以来のRNase治療は、それがプロトコルから削除された信号を増強しなかった。 1、3および5μg/ mlを、プロテイナーゼK処理は、3つの異なる濃度で試験した。 P.の場合トドマツ 、低または無信号が1μg/ mlのプロテイナーゼK（図3C - D）を用いて観察された。 5μg/ mlのプロテ​​イナーゼKを使用する場合は信号強度に明らかな差が見られなかったので、強い信号は、3μg/ mlの（図3E - F）、5μg/ mlの（図3G - H）プロテイナーゼKの両方が得られた3μg/ mlのに比べて、我々は我々のプロトコルの3μg/ mlを使用することにしました。 P.の高いプロテイナーゼKの濃度の必要可能性が高いですトドマツ男性の円錐Aに比べシロイヌナズナとB.セイヨウ花芽は、フェノール類および多糖類の高いレベルでよりコンパクトな組織によるものです。 固定時のとA.いくつかの違いを埋め込 ​​むシロイヌナズナ/ B.セイヨウプロトコルとP.トドマツプロトコルは明白です。興味の組織はRNAの保持を提供するために固定されており、不十分な固定材料はmRNAが非常に豊富であるにもかかわらず、低いか検出できないシグナルを与えるかもしれないので、これは重要なステップです。組織は、クリアと組織の損傷を避けるために、漸進的な変化のワックスに埋め込 ​​まれ、脱水され、そしていくつかのプロトコル0.85パーセントNaClにさらにセル3の収縮や腫れを防ぐために脱水エタノールに追加されます。埋め込み時の脱水工程は、最低でRNase活性を保つために氷の上で行うことができます。 P.でトドマツプロトコル4％パラホルムアルデヒド固定ソリューションは、いくつかはそれはおそらく何の違い3をなさないと主張それにもかかわらず、優れたRNAを保持する17を与えることになっている0.25％のグルタルアルデヒドを、含まれています。材料を切削後、ハイブリダイゼーションの前に（すなわち、脱蝋再水和し、透過処理、プローブの非特異的結合を減らすために治療し、最後に脱水）スライド上に固定し、前処理されています。 全体の検出手順ここで紹介するプロトコルで、通常の実験室で行うことができる、信号は1〜3日以内に通常の開発と背景上の信号と​​の比率を継続的に監視することができます。 DIG標識プローブは、通常、放射性標識プローブに比べて、より明確なシグナルを与える、より安定しており、連続した実験で再利用することができます。一方、感度は放射性プローブ17に比べて低減されます。situハイブリダイゼーションでは 、特定のmRNAに特異的な標識プローブを使用して式を検出する。ラジオ標識は、堅牢かつ高感度標識法ですが、それは放射能の処理を必要とし、その結果が検出される前にそれは数週間かかる。一方、抗原-標識プローブは、有害性の低い、より安定しており、わずか17数日間検出媒体への露出を必要とする。従って、抗原標識方法は、現在支配している。プロトコルに関係なく最も重要なステップは、プローブの設計です。ケアは、プローブは高い特異性を持ち、高品質のUTPsで標識されていることを確認する注意が必要です。時にはハイブリダイゼーション温度および/または反応の長さは、特定のプローブに調整する必要があります。 DIG標識プローブに基づいて私たちの修正されたプロトコルは、A.に至るまで種で同時にmRNA発現の局在を容易にするP.のシロイヌナズナトドマツ 、およびマイナーの調整で他の植物種で利用できるようになるはずです。プロトコルは、男性のコーンの横に、また植物シュートのさまざまな段階でとPから接合子と体細胞胚の両方でテストされています良い結果（。。カールグレンら未発表結果）とモミ属 。

<table><tbody><tr><td>無水酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404-200ml</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>アクリルアミド（直鎖状）</td><td>Ambion</td><td>9520</td><td></td></tr><tr><td>抗DIG抗体</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング剤</td><td>Roche Group</td><td>11 175 041 910 または 11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50g</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>脱イオンホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デンハルト液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532-5ml</td><td></td></tr><tr><td>DEPC（ジエチルピロカルボネート）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA ラベリングキット (SP6/T7)</td><td>Roche Group</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド (25%)</td><td>Histolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>Ambion</td><td>9510G</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear II</td><td>Histolab</td><td></td><td>組織の包埋には、Tissue-clear、Histoclear II、キシレンまたはそれに類するものを使用できます。</td></tr><tr><td>Histowax</td><td>Histolab</td><td></td><td>包埋にはHistowaxまたはParaplastを使用できます。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1kg</td><td>包埋にはHistowaxまたはParaplastを使用できます。</td></tr><tr><td>Phusion&amp;#8482; High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Finnzymes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe-on Plus スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5mg</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-clear</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>組織の包埋には、Tissue-clear、Histoclear II、キシレンまたはそれに類するものを使用できます。</td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1377-100ml</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ラボで標準的に使用している製品を使用すること</td><td></td><td>Triton X-100とTween-20のいずれか一方、または両方を使用してください。</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83853-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ラボで標準的に使用している製品を使用すること</td><td></td><td>Triton X-100とTween-20のいずれか一方、または両方を使用してください。</td></tr><tr><td>Western Blue</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

非放射性その場で</emノルウェースプルースと植物種の範囲に適用>ハイブリダイゼーションプロトコール

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

ハイスループット発現解析技術は、現在入手可能なので、個々の組織を解剖時の問題により制限されている科学者に発現プロファイルのオーバーフローが組織特異的発現の観点からその解決方法を与える。発現データは、in situハイブリダイゼーションなどを用いて発現パターンを確認し、補完する必要がある、するために使用される技術は、細胞特異的mRNAの発現をローカライズ。 in situハイブリダイゼーション法 、時間のかかる、面倒であり、しばしば種や組織に応じて大規模な最適化が必要です。 場の実験ではそのような針葉樹ノルウェートウヒ（ ドイツトウヒ ）などの木本種で実行することが比較的困難です。ここでは、P.を含む植物種の広い範囲で高速かつ適用可能なin situハイブリダイゼーションのプロトコールで修正されたDIGを、提示モミ属 。変更されたRNase処理とプロテイナーゼKの濃度を含むだけでいくつかの調整、と、我々一裸子植物二被子植物の種の雄の生殖器官の相同遺伝子の組織特異的発現を研究するためのプロトコルを使用することができます。P.トドマツ、シロイヌナズナとセイヨウアブラナ 。プロトコルは、研究の種との遺伝子にも同様に働いた。AtAP3とBnAP3がAにある2番目と3番目の渦巻き花器官で観察されたシロイヌナズナとB.セイヨウとP.から男性の円錐のmicrosporophyllsのDAL13 モミ属 。 Pの組織をpermeablizeするために使用されるプロテイナーゼKの濃度は、よりコンパクトな組織とフェノール類と多糖類のより高いレベルが原因の可能性ではなく、1〜3 g / mlのg / mlで、に増加する必要があったモミ属 。すべての種のためにRNase処理は、特異性の増加に対応することなく減少し、信号強度のために削除されました。草花や針葉樹の両方から相同遺伝子の組織特異的発現パターンを比較することによって我々は、 その場プロトコルの DIGだけ微調整して、ここで提示した実証は植物種の広い範囲に適用することができます。したがって、プロトコルは広範な生物種固有の最適化とDIG標識プローブを支持して放射性標識プローブの面倒な使用の両方を避けることができます。私たちは、映画におけるプロトコルの技術的な要求の手順を説明するために選択しました。 アンナカールグレンとジェニーカールソンはこの研究にも同様に貢献した。 対応する制作者：Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.seでAnna.Karlgren @ ebc.uu.seとJens F.のSundströmでアンナカールグレン

我々は、修正されたDIGを説明<em&gt;その場で</em高速とノルウェートウヒを含む植物種の広い範囲で適用できる&gt;のハイブリダイゼーションプロトコル、。変更されたRNase処理とプロテイナーゼKの濃度を含むだけでいくつかの調整、と、プロトコルは、さまざまな組織や種の研究に使用されることがあります。

今日利用可能なハイスループット発現解析技術により、科学者は膨大な量の発現プロファイルを得ることができるようになったが、...という点におけるそれらの解像度は、

欧州トウヒおよび広範な植物種に適用可能な、非放射性in situハイブリダイゼーションプロトコル。Carre Etal. こんにちは、AM GaNです。私たちは、スウェーデンのOBS大学およびスウェーデン農業科学大学で研究を行っています。私たちは、いくつかの異なる植物種に適用可能な昆虫訪問プロトコルを確立しました。本日は、その中でも特に精緻な操作を要する手順について解説します。このプロトコルでは、包埋、切片作成、および実際の昆虫訪問実験におけるさまざまなステップについて説明します。それでは、ラボ1の「固定および包埋」のプロトコルにおけるステップ9から11へ進みます。ステップ9、ペトリ皿とモールドを60 °Cで予熱します。ステップ10、ピンセットを加熱し、組織を皿の中に均等に配置します。組織が完全に浸るまで、組織用パラフィンをさらに追加してください。ステップ11では、パラフィンを室温で凝固させます。プロトコルのステップ12から19までを順に実施してください。ホットプレートの電源を入れ、溶かした組織用ワックスを用意します。コールドルームからサンプルを取り出します。ステップ13では、メスを使用して組織のワックスブロックを慎重に切り出します。スライスしやすくするために、サンプルの形状を整えます。ステップ14では、ブロックの底部と踵部分を加熱して融合させます。その後、準備したサンプルを4°Cで硬化させます。ステップ15では、ワックスブロックを6～8 µmの厚さに薄切します。ミクロトームを用いて、切片を1本の長いリボン状に連結させます。リボンを切り取り、紙の上に移動させます。この時点で、実体顕微鏡下で個々の切片を観察し、目的の切片を選択することが可能です。組織がエオシンで染色されていれば、観察は容易になります。ステップ17では、スライドにRNaseフリーのMilli Q水を滴下します。リボンを小さく切り、スライドガラス上に置きます。スライドガラスをホットプレートに移動させます。ステップ17：リボンを42 °Cのプレート上で1〜2分間平坦化させます。Kimwipeを使用して水分を拭き取ります。ステップ19、組織がスライドに密着するように、スライドを42 °Cで一晩インキュベートします。in situ ハイブリダイゼーション 4.1 in-situ セクション。プロトコルの前処理ステップ36から48に従ってください。ステップ36では、組織層の切片を脱パラフィンします。スライドは等間隔に配置し、異なる容器間での移動を容易にするためにラックに入れます。切片を脱水します。エタノール系列にて、激しく撹拌しながら無水酢酸を加えます。ステップ45、無水酢酸処理の準備。4.2 in situ ハイブリダイゼーション。プロトコルにおけるステップ49から52。ステップ51、ProOne Plusスライドのエージング。溶液は粘性が高いため、気泡が入らないように注意してください。スライドは湿室でインキュベートします。4.3 初期化。ハイブリダイゼーション後、プロトコルのステップ53から72までを実施する。ステップ62では、スライドをバッファーブロックと共にプラスチック容器に入れてインキュベートする。ステップ63、スライドがちょうど浸かる程度のブロッキング溶液を加えます。抗体はエイジング法を用いてスライドに添加します。エイジング法はProb Bon Plusスライドでのみ有効です。同様の設計のスライドを使用する場合は、ステップ65、毛細管現象によって抗Dig抗体溶液が吸い上げられるようにしてください。この手順を繰り返します。ステップ70と同様に、サンドイッチしてWestern blue溶液を吸い上げます。anti-dig抗体溶液のときと同様に、Western blue溶液を2回吸い上げる点に注意してください。ステップ65およびステップ71において、スライドを暗所で1〜5日間インキュベートします。室温で、実体顕微鏡を用いてハイブリダイゼーション信号のモニタリングを行うことができます。スライドがサンドイッチ状態にある間に、紫色から茶色の染まりが観察できるはずです。これが実際のCWステーション実験における結果の様子です。ここでは、紫色または茶色の染色としてシグナルを確認できます。

non-radioactive-situ-hybridization-protocol-applicable-for-norway

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

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このプロトコルが正常に定量的な脊椎動物種間で複数の組織の種類のレベルとmRNA発現の空間パターンを検出するために使用されています。メソッドは、低濃度の転写物を検出すると同時にスライドの何百もの処理を可能にすることができます。我々は、例として、鳥類の胚の脳形成の発現プロファイリングを使用して、このプロトコルを提示します。...

放射性その場で</em組織における多様な遺伝子発現パターンを検出するための>ハイブリダイゼーション

RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、...

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

ここではin situハイブリダイゼーションの単純な蛍光（FISH）昆虫や植物組織中のウイルスや細菌の局在のための方法を説明します。このプロトコルは、全体のマウントおよび顕微鏡用切片におけるmRNAの可視化のために拡張することができます。...

蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

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ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

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非放射性その場でハイブリダイゼーションプロトコール

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