Name: の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶショウジョウバエの心臓蛍光標識法。Drosophila melanogasterの幼虫と成虫の心管を抗体染色し、共焦点顕微鏡で形態学的構造解析を行う手法です。発生生物学研究に有用です。

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著者は、この原稿の準備に関する重要な読書と有益な提案のためにSIバーンスタイン（サンディエゴ州立大学）を感謝。この作品は、SIバーンスタイン、SDSU、へとR. Bodmer、BIMRにNIHの補助金によって支えられて、とアメリカ心臓協会の西部米国アフィリエイトからG.フォーグラーへとA. Cammaratoにポストドクトラルフェローシップによる。

あなたが始める前に<ol><li>以下のソリューションを準備します。 <ol class="lalpha"><li>リラックスバッファー（10 mM EGTAを含む人工的なショウジョウバエの体液（ADH）（&quot; ショウジョウバエの心臓の鼓動を可視化する&quot;を参照）） </li><li>固定液（1 × PBS中4％ホルムアルデヒド） </li><li> PBSTx（PBS、0.1％トリトン- X - 100を含む） </li><li> PBSTxで適切に希釈した一次および種特異的蛍光標識二次抗体</li></ol></li><li>心臓の管（大人ハエおよび/ ​​または幼虫の）次のことを公開するショウジョウバエを解剖する<ol class="lalpha"><li> &quot; ショウジョウバエの心臓の鼓動を可視化&quot;のセミ無傷ショウジョウバエの心臓標本のプロトコル、または</li><li>次の変更とショウジョウバエの幼虫NMJ解剖プロトコル 1：使用すると、幼虫の解剖時にADHを酸素化し、腹側正中線から少し後ピンに置き換える。幼虫は腹側正中線に沿って切断されています。固定前に任意の組織を削除しないでください。 </li></ol></li></ol>蛍光染色<ol><li>すべての心がリズミカルに酸素ADHに拍動していることを確認してください。すぐにリラックスできるバッファとADHを交換してください。収縮が抑制されるようにそれぞれの心臓のチューブを調べます。 </li><li>固定液でリラックスしたバッファを置き換えることによって、心を修正。穏やかに振盪しながら室温で20分間インキュベートする。 （幼虫の準備の揺れには任意のステップで必要ではない、と心臓組織の整合性に悪影響を及ぼすと考えられる）。 </li><li>継続的に振とうしながら室温で試料をPBSTxで10分間3回洗浄する。 </li><li>大人のための、慎重に戻ってどのような残っていることがより楕円と少ない丸みになるような腹部のクチクラの腹側縁をトリミング。さらに、腹部と胸部の間にシングルカット、慎重にそしてきれいに別体のセグメントの両方とで心臓の前方領域に最小限のダメージを確認してください。幼虫の心のために、慎重に微細な鉗子を用いて体脂肪を取り除く。幼虫の心臓が特に壊れやすいので、他の筋肉や結合組織からはほとんどサポートしているので、脂肪除去は、細心の注意を払って実行する必要があります。これは心臓に損傷を与える可能性があるとして、気管枝を削除しないでください。 </li><li> PBSTxで希釈した一次抗体の50〜100μlを含むウェルの96ウェルプレートに、中心部に位置する心臓のチューブとの接触を避け、エッジで腹部クチクラのトリミング背部を転送します。ウェルあたり12以上の試料を置きます。継続的に攪拌しながら2時間室温でインキュベートする。インキュベーションをさらに4℃で一晩行うことができます℃の</li><li>一次抗体溶液を除去します。継続的に撹拌しながら室温で100μlのPBSTxで10分のために心を3回洗浄する。 </li><li>最後の洗浄緩衝液の除去に続いて、Alexa594 -ファロイジン（1:1000）を添加したPBSTxの二次抗体を100μlを、追加してください。室温で継続的に振とうしながら一時間インキュベートする。漂白蛍光団を防ぐためにカバーのサンプルを保管してください。 </li><li>二次インキュベーションに続いて、継続的に振とうしながら室温でPBSTx 100μlの10分のために心を3回洗浄する。洗浄ステップを通してカバーのサンプルを保管してください。 </li><li>トリトン- X - 100の除去については、10分間PBSを100μlの心の最後の時間をすすいでください。標本は、マウントする前に数日間、4℃で暗所に保存することができます。 </li></ol>アダルトハーツのために取り付け<ol><li> Vectashieldマウンティング培地の10μlを、顕微鏡のスライドに2つの18 × 18 mmのカバーガラスを付着する。カバースリップは〜10〜15ミリメートル離れて配置されるべきである。で、間に2つのカバースリップメディアをマウントするの小規模な3番目のドロップを置きます。 </li><li>第三カバーの中央にVectashield20μlを置きます。 </li><li>注意深くクチクラの極端な端をPBSの洗浄溶液から心のそれぞれを削除し、ゆっくりと第三カバースリップで封入剤のドロップにドラッグ心臓側を下に置きます。カバースリップ上のドロップあたり5つまで心を置きます。 </li><li>すべての心が下向きにしていることを確認するために顕微鏡下で確認してください。 </li><li>慎重に心を含んでいるカバーを反転し、すぐにそのようなカバーガラスのペアの間にVectashieldの液滴と心臓の管が付いている液滴は、ヒューズそのカバースリップのペアを含むスライドの上に置きます。 &quot;ブリッジは&quot;カバースリップによって形成されるべきである。心は、カバースリップと顕微鏡用スライドの間で中断されます。 </li><li>心は今上向きに直面していることを保証するために顕微鏡下で確認してください。 </li><li>マニキュアとの縁でカバーグラスを修正。 </li><li>心は今蛍光または共焦点顕微鏡を介してイメージを作成する準備が整いました。 </li></ol><ol><li>顕微鏡スライド上にドロップ（〜20μl）のVectashieldを置きます。 </li><li>慎重にタングステン針を使用してダウンVectashieldと向きそれらの背側に2つの幼生の標本まで転送する。 </li><li>個別に封入剤から標本をドラッグし、並行してそれぞれの位置を合わせます。 </li><li>試料の両側にカバースリップを配置。鉗子を使用して、後部カバースリップ上の1つの側面を敷設し、そのためのブリッジを形成する前カバースリップにそれを下に下げることによって、最初にトップのサードカバースリップを配置。毛管力は、幼虫の心臓の適切な配置を支援する後方から前方へVectashieldの流れが発生します。 </li><li>マニキュアで、その縁で、場所にすべてのカバースリップを修正し、慎重に20から30μlをVectashieldとカバーグラスの間にスペースを埋める。 </li><li> 4でマニキュアとストアを持つシール° C、または-20℃で長期保存のための</li></ol>代表的な結果正しく実行されると、背脈管のすべてのコンポーネントと関連付けられている組織はそのまま残り、容易に可視化する必要があります。バックグラウンド蛍光は最小限に抑えてください。大人、非常によく腹側縦筋層の汚れのため、実質的な信号（図1および図2）を生成します。根底にある円形の心筋細胞は、しかし、上を覆う腹側層と強烈な信号として生成することではない傾向がある。成人の心臓の前&quot;円錐室&quot;の心筋細胞は収縮物質の相当量が含まれており、その結果、この地域は、心臓の管の残りの部分に最も堅牢な相対として表示されます。幼虫の心臓は大人の収縮心筋細胞（図3）と同様のスパイラル筋原繊維の配置を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="図1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="図1b" /> 図1：トップ。ミオシン- GFPを発現し、成人キイロショウジョウバエの全心臓のチューブを示す蛍光顕微鏡写真。イメージが余線分スライドモジュールを搭載したツァイスイメージャZ1蛍光顕微鏡で撮影されました。ミオシン- GFPは緑色で示され、アクチンがAlexaFluor ® 594ファロイジン（赤色）とα-アクチニンで染色され、抗α-アクチニン抗体（青）で標識されている。調製手順がよく保存された構造を持つ心臓サンプルの回収を可能に注意してください。 CC =円錐形の容器、AM =翼の筋肉、V =内部バルブ、VLL =腹側縦筋層。ボトム。ちょうど収縮心筋のスパイラル筋原線維の構成を示す腹側長手方向の層の下にある心臓の3番目の腹部のセグメントを介してCCから成人の心臓管の領域。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">ここをクリックして</a> 、図1aの拡大版のため、および<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">ここで</a> 、図1bの拡大のために<img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="図2" /> 図2：AlexaFluor ® 594ファロイジン（赤色）と抗Pericardin（コラーゲンタイプIV）（緑）抗体で染色された成人の心臓の前方部分の代表的な共焦点スタック。 Pericardinはおそらく腹側筋層の長手方向に指向筋原線維に由来する、腹側表面に沿って心臓に関連付けられています。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンのために。 <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="図3" /> 図3：三段階ショウジョウバエの幼虫の適切な心のセグメントA7の蛍光顕微鏡写真。イメージが余線分スライドモジュールを搭載したツァイスイメージャZ1蛍光顕微鏡で撮影されました。アクチンがAlexaFluor ® 594ファロイジン（緑色）とα-アクチニンで標識され、抗α-アクチニン抗体（赤）で染色される。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">ここをクリックして</a>図3の拡大バージョンのために。

<ol><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li>
<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
<li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%2C+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change.</a> J. Morphol. 2, 351-399 (1936).</li>
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<li>Kelso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 7150, 151-156 (2007).</li>
<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

ここでは、 キイロショウジョウバエの背の容器と蛍光または共焦点顕微鏡を介してイメージングのための関連する組織を準備し、染色のための有用なプロトコルを提示。私達はによって洗練されたと一般的に幼虫と成体ショウジョウバエの心臓管の in situイメージングでよく解決を可能にする効果的な染色のために私たちの研究室で用いられる手順の簡潔なアカウントを提供しています。その他は、省略形2、3、4に類似した方法を記載している。 染色の手順を実装する際に重要な追加の詳細は、考慮が必要です。例えば、他の生体物質に見られるように、かなり準拠してショウジョウバエの心臓の筋線維は非常に脆く、以下の固定となる。特に注記のうち5かなり繊細な心管に取り付けられた支持翼の繊維、、6、7の複数のペアがあります。従って、不要な操作を制限することが物理的なストレスや固定組織に直接損傷を減少させ、保存状態の良い、完全に無傷の構造を視覚化する可能性が高くなります。さらに...

<table><tbody><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-テトラ酢酸 (EGTA)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、10%、メタノールフリー、Ultra Pure</td><td>試薬</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 ファロイジン</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;#174; DAPI含有蛍光用封入剤</td><td>試薬</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>タングステンピン</td><td>試薬</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>ピンホルダー</td><td>試薬</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

市販<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;背脈管、または心臓は、収縮心筋細胞、心臓の壁の両側に沿って整列心膜細胞、支持翼の筋肉と、成人では、腹側縦筋細胞の層の単層で構成された管状構造である。収縮繊維の家は、筋原線維と細胞外マトリックスの相同成分と相互作用細胞骨格/亜膜性のタンパク質複合体、の密集バンドルを含む筋肉の細胞構築の成分を保存。ここでは、固定するためのプロトコルと解剖の幼虫やセミ無傷の大人の心の中から特定の心筋梗塞の要素の蛍光標識を記述する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;。具体的には、幼虫の心の中にF -アクチンサルコメアのとα-アクチニンのラベルを示す。さらに、我々はミオシン- GFPは野生型の大人の心で、大人のハエを表現し、α-アクチニンとpericardin、IV型細胞外マトリックスのコラーゲンで、F -アクチンとα-アクチニンの標識行います。特に注意がハンドリングを最小限に抑え、心臓の管と関連した組織の整合性を維持するための機会を最適化する半無傷の大人の心の取り付け戦略に与えられます。これらの製剤は、蛍光と共焦点顕微鏡を介して画像処理に適しています。全体的に、この手順は、強力な遺伝的に扱いやすいモデル系から心臓の構造的な特性を慎重かつ詳細な分析が可能になります。

ここでは、幼虫および成体から心臓管の様々な要素の蛍光標識するための基本的なプロトコルを記述する<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;。これらの標本は、蛍光または共焦点顕微鏡を介して画像処理に適しています。この手法は、強力なモデル生物からの心の機能の詳細な構造解析を可能にします。

キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の背側血管、すなわち心臓は、単層の収縮性心筋細胞と心膜細胞から構成される管状構造であり……

こんにちは。バーナム医学研究所の発達・老化プログラム、Ralph Boer研究室のNikita Ariです。そして、同じ研究室のGil lerです。本日は、幼若および成体Presolar心臓構造の蛍光標識の手順について解説します。本手順は、成体ショウジョウバエの心臓構造を蛍光標識し、共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いて形態学的および構造的解析を行うための心臓チューブを調製するために、研究室で使用されています。まず、半完全な成体の胸部と腹部の間に切り込みを1箇所入れ、体節を分離します。次に、成体クチクラの突出した腹側端を切り揃えます。次に、成虫または解剖した幼虫の標本を移し、一次抗体および二次抗体でラベル付けします。ラベル付け後、洗浄した成虫標本のクチクラ端を持って、カバーガラス上のvector shieldの一滴の上に心臓側を下にして配置し、洗浄した成虫標本をマウントします。その後、スライドガラス上に2枚のカバーガラスで挟まれた封入剤の一滴の上にカバーガラスを反転させて載せ、ブリッジを形成します。これにより、心臓が直立した状態で懸垂されます。幼虫の心臓のマウントについても同様に行います。標本を腹側が下になるようにスライドグラス上に移し、スライドの両側にカバーガラスを2枚設置します。最後に、幼虫の後端近くにあるカバーガラスの上に3枚目のカバーガラスを置くことで、ブリッジを形成します。これで心臓のイメージング準備が完了しました。本手順を開始する前に、本シリーズの別のビデオプロトコルに記載されているAD Hを含むAD Hリラクシングバッファー、10 mM EGTA固定液（1×PBS-P-B-S-P-B-S、TXに4%ホルムアルデヒドを配合したもの）、および適切に希釈した一次抗体と蛍光標識二次抗体を準備します。PBS TX中で、ビデオプロトコル「Visualizing the Beating Heart in Drosophila」および「Drosophila Larval NMJ Dissection Protocol」に示されているセミインタクト・ショウジョウバエ心臓標本作製法に従い、成虫および幼虫のショウジョウバエを解剖して心管を露出させます。ただし、変更点として、幼虫の解剖時には酸素飽和させたAD Hを使用し、後方のピンを腹側正中線からわずかにずらして配置してください。腹側正中線に沿って切開します。以降のステップで固定を行うまで、組織を一切除去しないでください。まず、顕微鏡下で、すべての心臓が酸素供給済みのA DH中でリズムよく収縮と弛緩を繰り返していることを確認し、標識の手順を開始します。次に、速やかにA DHを弛緩バッファーに交換し、各心管を再確認して収縮が抑制されていることを確かめてください。弛緩緩衝液を固定液に置き換え、心臓の固定を行う。緩やかに振盪しながら、室温で20分間インキュベートする。なお、幼生標本の場合、どの工程においても振盪は不要であり、心臓組織の完全性を損なう可能性があることに注意すること。20分後、固定液を除去し、検体をPBSTXで10分間ずつ3回洗浄します。成虫については、室温で絶えず振盪させながら、腹部と胸部の間を注意深く、かつきれいに1回切断します。心臓の前方に最小限の損傷しか与えないよう、両方の体節を分離してください。心臓の円錐状の室がある腹部前方を切断しないよう注意してください。顕微鏡で標本を観察し、きれいに切断されているかを確認します。次に、腹部クチクルの突出した腹側縁を慎重に切り取り、残った部分が円形ではなく、より楕円形になるように調整します。幼虫の心臓の場合、微細ピンセットを用いて脂肪体を慎重に取り除きます。この操作は細心の注意を払って行ってください。幼虫の心臓は非常に脆弱であり、他の筋肉や結合組織による支持がほとんどないため、心臓を損傷させる恐れがある気管分枝は除去しないでください。次に、PVS TXで希釈し、96ウェルプレートの1ウェルあたり50 µLずつ分注した一次抗体でインキュベートします。成虫の場合、中央に位置する心管に触れないように、トリミングした背面クチクラの端を持ち、プレートに移します。1ウェルあたり12個体を超えないように配置し、室温で継続的に撹拌しながら2時間インキュベートします。ピンセットで幼虫検体の端を保持し、P-B-S-T-Xを満たしたウェルへ移します。なお、インキュベーション終了時に幼虫検体を振らないでください。一次抗体溶液を除去します。室温で100 µLのP-B-S-T-Xを用いて、心臓を10分間ずつ3回洗浄します。その後、Alexa 594 Phinを添加したPBS txで希釈した二次抗体100 µLを加え、以降は蛍光退色を防ぐためサンプルを遮光し、室温で1時間インキュベートします。二次抗体溶液を除去し、室温で100 µLのP-B-S-T-Xを用いて、心臓を10分間ずつ3回洗浄します。最後に、心臓を100 µLのPBSで10分間すすぎ、TRITTON X 100を除去します。検体は、封入まで数日間、4 °Cの暗所で保存可能です。まず、封入手順に向けてスライドグラスを準備します。顕微鏡スライドグラス上に、Vector Shield封入剤を10 µLずつ、等間隔に3滴滴下します。外側の2滴の上に18 by 18 mmのカバーガラスを2枚載せ、カバーガラスの間隔を約10 to 15 mmに保ちます。さらに、3枚目のカバーガラスの中央にvector shieldを20 µL滴下します。次に、解剖した成虫のクチクラの端をしっかりと保持します。PVS洗浄液から慎重に取り出すため、心臓側を下にして、3枚目のカバーガラス上の封入剤の滴の上に静かに置きます。この際、カバーガラス上の1滴あたり最大5個までの心臓を配置してください。カバーガラス上の液滴に心臓を配置した後、顕微鏡下で全ての心臓が下を向いていることを確認します。次に、心臓が載ったカバーガラスを慎重に反転させ、素早くスライドガラス上に配置します。この際、反転させたカバーガラス側の心管を含む液滴が、カバーガラス間のスペースにあるベクターシールド液滴と融合するようにカバーガラスを保持します。このように組み合わせることで、3枚のカバーガラスがブリッジを形成します。心臓を中間カバーガラスと顕微鏡の間に吊り下げます。ブリッジの下にスライドさせ、顕微鏡下で、マニキュアを用いて成虫のショウジョウバエの心臓が上を向いていることを確認してください。カバーガラスの端を固定します。これで、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡による心臓のイメージング準備が整いました。幼生心臓を封入するには、微細ピンセットを用いて、顕微鏡スライドガラス上にBTA shieldを約20 microliters滴下します。幼生のクチクラ端を掴み、慎重に滴の中に移します。タングステン針を用いて、幼虫を背面が下になるように配置します。1枚のスライドに最大2匹の幼虫を載せてください。次に、各個体を封入剤の中から引き出し、幼虫を平行に整列させます。ピンセットを使用して、位置を合わせた心臓の両側にカバーガラスを配置します。3枚目のカバーガラスを上に置く際は、まず片側を前面のカバーガラスに乗せ、そこから背面側のカバーガラスへと下ろします。これにより、ブリッジ状の構造を形成します。毛細管現象によりVector Shieldが後方から前方へ流れ、幼虫の心臓が適切に整列します。最後に、すべてのカバーガラスの端をマニキュアで固定し、カバーガラスの間の隙間に20〜30 µLのVector Shieldを慎重に充填してマニキュアで封印します。短期間の保存の場合は4 °Cで、長期間の保存の場合は-20 °Cで保存してください。正しく行われれば、背側血管のすべての構成要素および関連組織が損なわれず、容易に可視化されるはずです。成体では、背景蛍光は最小限に抑えられる必要があります。腹側の縦走筋層は非常に良好に染色され、十分なシグナルが得られます。しかし、その下層にある環状心筋細胞は、上層の腹側層から得られるものほど強いシグナルが出ない傾向があります。成体心臓の前方円錐腔の筋細胞には相当量の収縮物質が含まれており、その結果、この領域は心管の他の部分に比べて最も堅牢に見えます。幼生心臓の画像では、螺旋状の筋原線維配列が示されています。成体の収縮心筋細胞と同様に、蛍光および共焦点顕微鏡観察に向けた卵形心臓の調製および染色のプロトコルを説明しました。本手順を実施する際は、不必要な操作を制限することが重要です。これにより、心臓構造をより完全な状態で保存し、維持することが可能になります。なお、本プロトコルはあくまで基本的な指針として提供されるものです。他の免疫組織化学染色と同様に、抗体によって異なる条件が必要となるため、個別に最適化を行う必要があります。以上です。ご視聴ありがとうございました。染色の成功をお祈りしております。

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生物学

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初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

本プロトコールは、OCT画像化および光遺伝学的心臓ペーシングのために、心臓においてeNpHR2.0またはReaChRオプシンを発現するショウジョウバエメラノガスターの生成を記載する。ショウジョウバエOCTイメージングおよび心拍調節のための詳細な指示は、異なる発達段階における生きた動物における回復可能な心停止、徐脈、および頻脈のシミュレーションを含む、報告されている。...

ショウ ジョウバエのメラノガスター モデルの開発による心機能のイメージングと光遺伝学的制御

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

ショウジョウバエの心臓切片作製および蛍光イメージングプロトコルは、心臓の構造と病状の研究を簡素化します。このアプローチには、従来の解剖に必要な技術的専門知識をバイパスして、簡単な切片作成、染色、およびイメージングが含まれます。これにより、アクセシビリティが向上し、ショウジョウバエは、より広範な科学コミュニティ内で心臓関連研究のモデルとしてより広く利用できるようになります。...

クライオ切片による ショウジョウバエ の心臓蛍光染色のための新規で効率的な方法

学ぶショウジョウバエの心臓蛍光標識法。Drosophila melanogasterの幼虫と成虫の心管を抗体染色し、共焦点顕微鏡で形態学的構造解析を行う手法です。発生生物学研究に有用です。

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

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