哺乳動物細胞での糖タンパク質からN -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析

糖タンパク質上の遊離糖鎖の解析は、トリチウム標識マンノースを用いた糖鎖および細胞の標識から始まります。パルス用ディッシュを氷上で冷却し、チェイス用ディッシュは標識なしで目的のチェイス期間中インキュベートします。次に、サンプルを溶解し、目的の糖タンパク質を免疫精製して変性させ、その糖鎖を酵素的に遊離させます。

オリゴ糖は、分子ろ過によってさらに精製され、30 kilodaltonsより大きいタンパク質やその他の不純物から分離されます。その後、グリカンをHPLCで分離します。溶出された各フラクションにおける放射性シグナルの強度を測定することで、各グリカン形態の量を決定します。

こんにちは。テルアビブ大学の細胞研究・免疫学部、Hi Geraldo Letter Kremer研究室のエドワード・アゾです。また、Gerardo Letter Kremer Slabにも所属しています。本日は、代謝的にラベル化され結合したオリゴ糖の単離および分析の手順について説明します。

当研究室では、細胞全体の糖タンパク質プールおよび個別の糖タンパク質の両方における糖鎖プロセシングのダイナミクスを研究するために、この手順を用いています。それでは、開始しましょう。この手順を始めるにあたり、90 mmディッシュで一晩培養したNIH 3T3細胞を使用してください。

各サンプルについて、グルコース飢餓状態にするために細胞をサブコンフルエントの状態にします。20%透析FCSおよび8mMピルビン酸ナトリウムを添加した2倍濃度のグルコースフリー培地を調製し、この2倍濃度培地と同量の脱イオン水で希釈します。培地を予熱し、各細胞サンプルを5mLの新鮮な予熱済み培地中で5〜15分間インキュベートします。チェイス期間が12時間を超える場合は、無菌条件下で細胞を操作してください。

インキュベーション期間の終了後、パルスおよびチェイス試料に対応するディッシュに印を付けます。免疫沈降による糖タンパク質解析のためにN-グリカンを標識するには、飢餓培地を、400 µCi/mLのトリチウム標識マンノースを添加し、あらかじめ温めておいたグルコースフリー培地1 mLに置換します。全糖タンパク質の標識および解析には、65 µCi/mLを使用してください。

飢餓培地を交換した後、細胞を通常の組織培養条件下で1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション終了後、すべてのサンプルから標識培地を除去します。パルス群に相当するサンプルに、4°CのPBS 2 mLを注意深く加え、氷上に置きます。これらのサンプルをパルスサンプルと呼びます。

あらかじめ温めておいた通常の完全培地2 mLを使用します。チェイスサンプルを3回洗浄します。その後、細胞にあらかじめ温めておいた通常培地5 mLを加えます。

チェイスサンプルを二酸化炭素インキュベーターに入れ、37 °Cで任意のチェイス期間中培養します。チェイスサンプルの培養中に、氷上に置いてあったパルスサンプルを2 mLの氷冷PBSで3回洗浄します。その後、セルスクレーパーを用いて、ディッシュから細胞を回収します。

2 mLのPBSを用いて、遊離させた細胞を2 mLのEORチューブに移します。16,000 ×gで6〜10秒間遠心分離して上澄みを除去し、細胞ペレットを-80 °Cで凍結保存します。チェイスサンプルのインキュベーションが終了したら、それらを洗浄してください。

パルスサンプルの場合と同様に、遠心分離を行い保存します。細胞溶解の手順に進む準備ができたら、フリーザーから細胞を取り出します。IP解析については、300 µLのバッファーを加えて細胞を溶解させます。

短時間ボルテックスし、氷上で20分間インキュベートします。全糖タンパク質のサンプル分析を行う場合は、300 µLのバッファーBを加えます。細胞を氷上で20分間インキュベートした後、最大振幅で10秒間×4回の超音波処理を行います。その後、サンプルを5分間煮沸します。

最後に、すべてのライセートを 16,000 Gs で 4°C、20 分間遠心分離します。上清を新しい EOR チューブに移し、ペレットを廃棄します。ここまでに示した H2A 糖タンパク質の免疫沈降について、目的タンパク質を調べるための IP に進みます。

溶解細胞の上清に、サンプルあたり20 µLのprotein A/G beadsと、サンプルあたり3 µLのラボ所有のrabbit polyclonal anti-H2A抗体を加えます。サンプルを4 °Cで4〜16時間、緩やかな回転により絶えず混合しながらインキュベートします。インキュベーション終了後、ビーズを遠心分離して沈殿させ、バキュームを用いて上清を慎重に除去し、500 µLのバッファーTを加えてビーズを4回洗浄します。

ビーズを遠心分離して上澄みを除去し、ビーズに結合したタンパク質を遊離させます。Endo Hキットの変性バッファー10 µLをビーズペレットに加え、サンプルを5分間加熱煮沸します。ビーズを遠心分離し、上澄みを新しいEORチューブに移します。

elluタンパク質の脱糖鎖化を行う準備が整いました。酵素とOHを用いて、IPサンプルおよび全タンパク質サンプルの両方から糖鎖を遊離させます。IPサンプルには、2x endo H反応バッファー10 µLとともに、endo H酵素0.5 µLを各サンプルに加えます。その後、サンプルを37 °Cで3時間インキュベートします。

全糖タンパク質については、細胞溶解液の上清を分画分子量 30 kilodalton の MicroCon フィルターに適用します。14,000 Gs での遠心分離を繰り返し、全タンパク質抽出物を 100 microliters のバッファー E で 3 回洗浄します。洗浄後のタンパク質が残っている MicroCon に、10 x endo H 反応バッファー 3 microliters と endo H 酵素 1.5 microliters を加え、IP サンプルとともに 37 degrees Celsius で 3 時間インキュベートします。

3時間のインキュベーション終了後、IPサンプルを脱イオン水で5倍に希釈し、新しいMicroConフィルターの上に載せて14,000 Gsで3分間遠心分離します。次に、IPサンプルと全タンパク質サンプルの両方に50 µLの脱イオン水を加え、遠心分離して洗浄します。この操作をさらに2回繰り返します。切断された糖鎖を含むフロースルー液は、必要に応じてEndo H耐性糖タンパク質を含むチューブに回収してください。その後、200 mUのN-glycosidase Fを15 µLのバッファーCに溶解し、37 °Cで16時間インキュベートします。

示した通りに脱イオン水で溶出を行います。プロセスを加速させるため、最大45 °Cまで加熱可能な高速真空濃縮機を使用して、サンプルを完全に乾燥させます。乾燥したペレットを12 µLのHPLC溶媒で再懸濁し、HPLC装置に装着したSPHEカラムまたはアミノカラムにサンプルをロードします。

付属の書面プロトコルに従ってサンプルを走行させます。各サンプルの走行につき48分画を回収してください。シンチレーションカウンターを用いて回収した分画のCPM値を測定し、分画番号に対するCPMの読み取り値をプロットします。

付属の書面プロトコルに記載されている通り、すべての糖鎖種のマンノース残基の割合を算出します。以下は、1時間のパルスラベル標本から得られた全糖タンパク質の糖鎖分析の代表的な結果です。得られたプロファイルでは、HPLC分画のCPM読み取り値を分画番号の関数としてプロットしています。

各ピークは、既知の糖鎖標準物質のHPLC分析によって同定された特定の糖鎖種を表しています。それぞれの糖鎖種について、全糖鎖に占めるモルパーセントをチェイス時間（追跡時間）の関数としてプロットしています。ここに示されているのは、プロテアソーム阻害剤MG 1 32で処理したサンプルから免疫沈降により単離した、特定のミスフォールド糖タンパク質の分析結果です。

チェイス期間中にトリミングされた糖鎖種M5Sixが蓄積することから、ミスフォールドしたタンパク質上のオリゴ糖は、分解される前に広範なマンノーストリミングを受けるという結論に至ります。これは、同様に処理したサンプルの全糖タンパク質上のオリゴ糖とは対照的です。後者の場合、チェイス期間中もM9Eightが主要な糖鎖種であり続け、M5Sixの量はわずかに増加するのみでした。このことは、全糖タンパク質プールのうち、小部分のみが小胞体関連分解（ERAD）の標的となることを示唆しています。

略称 rad. 同伴する書面プロトコルでさらに詳しく説明している通り、生細胞におけるパルスラベルとHPLC分析を組み合わせることで、糖タンパク質の寿命における非結合型オリゴ糖組成のダイナミクスを追跡する方法を示しました。この手順を行う際は、チェイスサンプルの放射性モノマーによる汚染を避けることが重要です。汚染が発生すると、サイズ分離中のチェイス期間にグリカンの不要なラベル付けが起こります。

また、糖鎖の分画の整合性を確保するために、HPLCを一定の圧力に調整することも重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。