Name: 哺乳動物細胞での糖タンパク質からN -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぼう、哺乳動物細胞でN-結合型糖鎖の動態をパルス-チェイス法とHPLCで解析する方法。放射性標識と酵素処理により糖タンパク質の糖鎖変化を定量し、細胞内タンパク質の代謝経路を解明する。

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我々は技術支援のためにZehavitフレンケルとサンドラTolchinskyに感謝。この作品に関連する研究は、イスラエル科学財団（1229年〜1207年）とドイツとイスラエルのプロジェクトの協力（DIP - DFG）からの補助金によってサポートされています。

以下のプロトコルは、全糖のか興味のある特定の糖タンパク質の糖鎖の解析を対象としています。手順は、プロトコル全体に述べたいくつかの変化と基本的にはどちらの場合も同じです。 <ol><li>各サンプルの90 mmディッシュ（サンプルは、異なるタイムポイントや治療法を表す可能性がある）で一晩増殖哺乳類細胞のサブコンカルチャを使用するN -結合型グリカンの代謝標識用のニーズ。このプロトコルは、NIH 3T3細胞に最適化されています。 </li><li> 10％透析FCSと5〜15分、4 mMのピルビン酸ナトリウムに付属している作りたての予め温めておいた（37℃）グルコースを含まない培地、5mlにインキュベートすることによりグルコースの細胞を飢えさせる。 </li><li> [ - 3 H 2]（65μCiの/ mlの低濃度は、総糖タンパク質の量のラベリングに使用される）マンノース標識、400μCiのを含む予め温めておいた（37℃）グルコースを含まない培地1mlで飢餓の媒体を交換してくださいと1時間の通常の組織培養条件で細胞をインキュベートする。 </li><li>チェイスに対応するサンプルがする必要がある一方、各サンプルから標識メディウムを外し、慎重に4℃の氷（これらのサンプルはパルスと呼ばれる）上にパルスと配置に対応するサンプルをPBS 2 mlを加え2mlで3回すすいだ予め温めておいた（37℃）、通常の完全培地、及びその後37℃CO 2インキュベーターに入れ° C、目的の追撃期間予め温めておいた定期的な培地5mlで。 </li><li>氷冷PBS 2mlでパルスのサンプル（以前氷上に置く）3回すすいでください。その後、細胞をセルスクレーパーを用いて2 mlのPBSでシャーレから掻き取り、そして2mlエッペンドルフチュー​​ブに配置されます。 </li><li> 16000Xg（6-10秒）で細胞を短期回転、上清を廃棄し、-80細胞ペレットを凍結℃に</li><li>チェイス時間の終了時追撃のサンプルについても手順5と6を実行します。 </li><li>冷凍庫からセルを削除し、バッファー300μlを添加することによって、それらを溶解させる、簡単にボルテックスして氷上で20分間インキュベートする、または、総糖タンパク質の分析の場合には、緩衝液Bで氷上でインキュベーション20分で、超音波処理が続く（4回、10秒、最大振幅）、その後5分間のサンプルを煮る。 </li><li> 4℃で20分間16000Xgでライセートを遠心新しいエッペンドルフチュー​​ブに上清を移し、ペレットを捨てる。 </li><li>合計糖タンパク質を分析する場合、分子ろ過と脱グリコシル化（ステップ17）に進みます。 H2Aの糖タンパク質の免疫沈降は、ここで紹介するため、（Repligen）プロテインA -アガロースビーズの20l/sample午前1時01分サスペンションを追加し、この例では、目的の糖タンパク質（私たちのウサギポリクローナル抗H2Aの抗体の3μL/サンプルアンチH2Aの抗体）、ステップ9から上清へ。 </li><li>常にゆっくりと回転して混合、4℃で4〜16時間のサンプルをインキュベートする。 </li><li> 30秒間16000Xgでビーズをスピンダウンし、注意深く上清を用いて真空を削除します。 </li><li> 500μlのバッファーDを追加し、ボルテックスで、ビーズを洗浄します。ステップ12のように回転し、上清を取り除く。洗浄を3回繰り返します。 </li><li>ビーズペレットに10μlの変性バッファー（NEBエンド- Hキットに付属）を追加し、5分（総蛋白質を分析する場合、脱グリコシル化は、マイクロコンフィルター、ステップ17で実行される）のサンプルを煮る。 </li><li> （30秒間16000Xg）ビーズをスピンダウンし、新しいエッペンドルフチュー​​ブに上清を移す。その後、遠藤Hの酵素の0.5μlを反応バッファー（また、NEB遠藤Hキットに付属）を10μlと一緒に各サンプルに追加され、サンプルは3時間、37℃でインキュベートする。 </li><li>タンパク質から放出される糖鎖を分離するために、試料を脱イオン水で5倍に希釈され、30kDaカットオフ、その後3分間14000Xg間遠心分離して、分子フィルター（マイクロコンUltracel YM30）の上に配置。脱イオン水と試料の繰り返しの遠心分離の50μLを適用する。このウォッシュアウトは、フロースルー保ち、さらに2回繰り返されます。 </li><li>あなたが全体の糖タンパク質を分析している場合、マイクロコンフィルターにライセートの上清を（ステップ9から）適用されます。 3分間14000Xgで繰り返し、遠心分離により3倍のバッファE、100μlの抽出液を洗浄してください。 10X遠藤Hの反応バッファーを3μlを追加し、エンドHの酵素1.5μlをマイクロコンの残留物に、そして37℃で3時間インキュベート℃にリリースグリカンは、ステップ16のように、3を繰り返し遠心分離による脱イオン水で溶出されています。 </li><li>必要に応じて、エンドH -抵抗性の糖タンパク質を含む手順16および17からretentatesは、​​その後37℃、緩衝液Cの15μlのN -グリコシダーゼFの200mUでインキュベートされる℃で16時間脱イオン水で溶出は、ステップ16のように行われます。 </li><li> Speed​​Vacコンセントレータで遠藤Hの反応フロースルー（ステップ16および17）を含むチューブを、と完全に試料を乾燥させ（これが45まで行うことができます℃で、このプロセスを加速する）。 </li><li> HPLC用サン​​プルを準備するには、HPLC溶媒（水、60:40、1％リン酸アセトニトリル）の12μl中、乾燥ペレットを懸濁します。 </li><li>定数の溶媒の流れ（1 ml /分）と圧力（1000と2000 psiの間に特定の値）にHPLCの装置を（フェリの列に接続されて）調整し、チューブを1分ごとに変更するにはフラクションコレクタを配置。 </li><li> HPLC装置にサンプルを読み込むと同時にフラクションコレクターを起動します。 </li><li>各サンプルの実行から、標準的​​なオリゴ糖混合物の実行から1 mlの48画分を集めた。 </li><li>各画分からのシンチレーションバイアルに500μlを、と水混和性のシンチレーション液3mlで内容を混ぜる。 </li><li>バイアルをロードし、シンチレーションカウンターにお読みください。 </li><li> CPMの読み出しは、分数の関数としてプロットされます。 </li><li>ピーク内のCPMの値は次のように、特定の糖鎖の種表す：分数を18-21 M8、M9のフラクション36から39にM5、フラクション22から26にM6、フラクション27から31にM7、フラクション32から35に対応フラクション40から42へG1M9とフラクション43から45へG2M9。 </li><li>各ピークの内画分のCPM値の合計は、特定の糖鎖の種の絶対量を反映している。より多くのマンノース残基を含む種がより多くのラベルを取得し、各糖鎖の種の"相対的なモル量は、"以下のように計算されているという事実を補正するために：各糖鎖の種の絶対量はそれに含まれるマンノース残基の数で割って。この値は、それぞれの特定の糖鎖の種のための"合計のパーセントを"得るために取得したすべての糖鎖生物種の相対的なモル量の総和で除算されます。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;">チェース（H） </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td>遠藤H（CPM）をリリースしました</td><td> 9万</td><td> 16800 </td></tr><tr><td> N -グリコシダーゼF（CPM）bでリリース</td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td>濃縮水（CPM）Cの糖タンパク質</td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td>濃縮水（CPM）、Dにおけるドリコール糖</td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td>濃縮水のドリコール糖（％）E </td><td> 1.4 ± 0.7 </td><td> 0.2 ± 0.2 </td></tr></tbody></table> 表1。deglycosidasesあると糖タンパク質の試料におけるドリコール糖の存在のN -結合型糖鎖の放出の分析。 私たちは、NIH 3T3細胞からライセートにパルス - チェイスの手順を適用する。マイクロコンろ過した後、標識したN -結合型糖鎖は、パルスラベリング（高マンノース型）の後と複合型（ゴルジ処理された糖鎖）に対応するだろう追いかける期間後のN -グリコシダーゼFとのさらなる治療、と遠藤Hで主にリリースされました遠藤H抵抗性オリゴ糖。この定量分析はドリコール糖は、初期の残留物のラベルの微々たる割合を占めていると判断。 注意事項： <ol class="lalpha"><li> NIH 3T3細胞は、パルスが[2 - 3 H]で標識されたマンノースと完全培地で追いかけた。マイクロコンYM30を介して細胞を溶解し、ろ過した後、高マンノースN -結合型糖鎖は、エンドH.とのインキュベーションによりretentatesから解放された</li><li>からマイクロコンのretentates（）の遠藤H耐熱材料は、その後、シンチレーションカウンターで測定したN -グリコシダーゼFと放出オリゴ糖でインキュベートした。 </li><li>メタノール：：前駆体の糖脂質を除去する水午前10時10分03秒、およびunextracted材料を1N NaOHで可溶化し、シンチレーションカウンターでカウントエンドH処理の前に（）で得られたマイクロコンのretentatesは、​​クロロホルムで4回抽出した。 </li><li>ドリコール - 糖鎖は、（c）のように1に記載し、シンチレーションカウンターでカウントからの抽出物から精製した。 </li><li>残留液中の総CPMのドリコール糖のパーセントのための3つの実験の平均値（D）（C + D）。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。パルスチェイス未処理細胞のとプロテアソーム阻害時に合計NIH 3T3糖タンパク質の解析 1Hパルスラベリングの後で。[2 - 3 H]我々はいくつかglucosylatedと期待されるプロファイルを得前駆体は、（グルコース2マン9 N -アセチルグルコサミン2（G2M9）とG1M9）残りが、M9に存在するラベルとM8種のほとんどが、後者はすべてのグルコースのトリミング一マンノース残基（図1）の結果である。空きマンノースまたはその他の小規模な前駆体は、精製の徹底を証明する、検出されなかった。かなり長い8Hチェースに続いてそこにM7 - 6とM5の少量にトリミングをより広範であったが、主要な種はM9とM8（図1 B）が続きました。チェイスはプロテアソーム阻害剤（30μMのMG - 132）の存在下で行われた場合、これらの同じトリミング種のマイナー蓄積（図1 C）のみがあった。 <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。合計糖タンパク質に比べてERAD基質の糖鎖の定量分析。 （A）図1に示すような実験では、各オリゴ糖の種の相対的なモル量は、マンノース含有量に基づいて算出した。私たちは、それぞれの糖鎖生物種で得られたCPMの値を変換し、すべての種の存在の相対的なモル量の総和に対する各種の％は、2つの実験の平均の追求を時間の関数としてプロットした。（B）と同様に（）ERAD基質ASGPR H2Aから放出その糖鎖を除いて分析した後、存在下で4時間追いかけるためにプロテアソーム阻害剤MG - 132の存在下または非存在下で4時間までのパルスラベルとチェイスは、。（C）の値からMG - 132の（A）と（B）ASGPR H2Aおよび糖タンパク質のプールのために比較されます。ER内のプロセスをトリミングN -結合型糖鎖の（D）スキーム。砂糖は、ゴルジ体以降に終了するものでM9 - 8と比較しERADを対象とするタンパク質（R）にリンクされているM6 - 5につながるプロセスをトリミング。結果は、ERADのプロセスが残っている5月6日マンノース残基を有する種を生成するためにN -結合型糖鎖のトリミングマンノースに関連付けられていることを示している。

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

パルスチェイス生細胞における糖鎖の分析HPLC分離とは、糖タンパク質の一生を通じてオリゴ糖の構造変化のダイナミクスを研究するための方法を提供する。このような変化がERのフォールディング、品質管理および売買システム2-5の信号を生成に関与していることを成長証拠がある。方法はないだけ関心のある特定の糖タンパク質のためだけでなく、我々は対照的な、特定のERADの基質の運命と細胞の糖タンパク質のプールのそれを比較して、この記事で示す総糖タンパク質、、の構造のダイナミクスを分析するために適用することができます。精製法は、単純な、それにもかかわらず、特定のです。このようなO -結合型糖鎖およびGPIアンカー型タンパク質のような男、 -厳格なdeglycosidasesと分子ろ過を使用して、[3 H 2]のラベルが付いた他の高分子を残して、糖タンパク質から遊離のみN -結合型グリカンが得られることが保証されます。ドリコール前駆体から放出されたオリゴ糖は、無視できる汚染物質（表1）です。 方法は、出発原料のごく少量を使用して、検出の高感度を提供します。非...

<table><tbody><tr><td>600E マルチ溶媒供給システムコントローラー</td><td>Waters</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル LiChrosolv（液体クロマトグラフィー用グラジエントグレード）</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K または Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 or 4208</td><td></td></tr><tr><td>濃縮装置 5301（48 x 1.5 / 2.0 ml 固定角ローターを含む）</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>透析済みF&amp;#8211;tal胎仔血清</td><td>Biological Industries</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium（グルコースフリー）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩 (Titriplex Iii)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;tal胎仔血清 (FCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Frac-100 分画コレクター</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 液体シンチレーション計数システム</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>マンノース, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (比放射能: 15-30Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-カルボベンゾキシル-ロイシル-ロイシル-ロイシナール (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-グリコシダーゼ F (1000 units/ml)</td><td>Roche Group</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-オクチルグルコシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3細胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>リン酸溶液 (49-51%, HPLC用)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Sepharoseビーズ</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル anti-H2 カルボキシ末端 &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム溶液 (100mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Spherisorb NH2 カラム, 5 &amp;mu;m, 4.6 x 250 mm</td><td>Waters</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-Cell 超音波処理装置 VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;緩衝液 A:&lt;/strong&gt; PBS中の1% Triton X-100, 0.5% w/v デオキシコール酸ナトリウム, プロテアーゼ阻害剤カクテル 2% v/v</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;緩衝液 B:&lt;/strong&gt; PBS中の0.5% w/v SDS, プロテアーゼ阻害剤カクテル 2% v/v</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;緩衝液 C:&lt;/strong&gt; N-グリコシダーゼ F 反応緩衝液: 200mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-オクチルグルコシド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2a &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;を安定発現させたNIH 3T3細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;緩衝液 D:&lt;/strong&gt; PBS中の0.5% Triton X-100, 0.25% w/v デオキシコール酸ナトリウム, 0.5% w/v SDS, プロテアーゼ阻害剤カクテル 2% v/v</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;緩衝液 E:&lt;/strong&gt; PBS中の0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-メルカプト&amp;#8211;エタノール, プロテアーゼ阻害剤カクテル 2% v/v</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳動物細胞での糖タンパク質からn -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Glcの添付ファイル<sub&gt; 3</sub&gt;マン<sub&gt; 9</sub&gt; N -アセチルグルコサミン<sub&gt; 2</subERでの新生ポリペプチドに対するオリゴ糖&gt;前駆体は分泌蛋白質に共通の変更です。この変更は、いくつかの生物学的プロセスに関与されたが、その機能の追加の側面は、糖タンパク質の品質管理や人身売買のシグナルの生産におけるその役割の最近の証拠で、浮上している。従って、N -結合型糖鎖とその処理に関連する現象が集中的に研究されている。最近プロテオーム解析のために開発されてきた方法は、大幅に糖タンパク質のN -結合型グリカンの特性を改善している。それにもかかわらず、彼らは関与する糖鎖プロセッシングの動態への洞察を提供していません。このために、ラベリングやパルスチェイス解析プロトコルは通常、複雑であり、非常に低い収率を与えることに使用されます。ここでは、代謝的に標識したN -結合型糖鎖の単離と解析のためのシンプルな方法を説明します。プロトコルは[2細胞のラベリングに基づいている -<sup&gt; 3</sup&gt; H関心のどちら特に免疫沈降したタンパク質からまたは分子濾過（アミコン）に続いて遠藤HとN -グリコシダーゼFと順次治療による一般的な糖タンパク質プールから]マンノース、変性溶解し、オリゴ糖の酵素的放出。この方法では分離されたオリゴ糖は単糖類の分解能で、それらを含有する単糖単位の数に応じて様々な糖鎖構造の間に差別を可能にするHPLC分析のための入力として機能します。この方法を用いて、我々は通常の状態にし、プロテアソーム阻害下でパルスチェイス後の全細胞の糖タンパク質の高マンノースN -結合型糖鎖のプロファイルを研究することができた。これらのプロファイルは、免疫沈降した小胞体関連分解（ERAD）基板から得られたものと比較した。我々の結果は、ほとんどのNIH 3T3細胞の糖タンパク質は比較的安定していることと、それらのオリゴ糖の大部分が男にトリミングされていることを示唆している<sub&gt; 9月8日</sub&gt; N -アセチルグルコサミン<sub&gt; 2</sub&gt;。対照的に、不安定なERADの基質は、人間にトリミングされています<sub&gt; 6月5日</sub&gt; N -アセチルグルコサミン<sub&gt; 2</subこれらの種をもつ&gt;と糖タンパク質は、プロテアソームによる分解の阻害により蓄積する。

我々は、哺乳類細胞におけるそれらの生合成後の糖タンパク質の初期の生活を通じて、N -結合型グリカンの変化の分析のための方法を説明します。これは、代謝的に標識した糖鎖、糖タンパク質およびHPLCによる検討からの酵素遊離のパルス - チェイス分析によって達成されます。

哺乳動物細胞での糖タンパク質からN -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析

小胞体における新生ポリペプチドへの前駆体オリゴ糖Glc3Man9GlcNAc2の付加は、分泌タンパク質に共通する修飾である。 although...

糖タンパク質上の遊離糖鎖の解析は、トリチウム標識マンノースを用いた糖鎖および細胞の標識から始まります。パルス用ディッシュを氷上で冷却し、チェイス用ディッシュは標識なしで目的のチェイス期間中インキュベートします。次に、サンプルを溶解し、目的の糖タンパク質を免疫精製して変性させ、その糖鎖を酵素的に遊離させます。オリゴ糖は、分子ろ過によってさらに精製され、30 kilodaltonsより大きいタンパク質やその他の不純物から分離されます。その後、グリカンをHPLCで分離します。溶出された各フラクションにおける放射性シグナルの強度を測定することで、各グリカン形態の量を決定します。こんにちは。テルアビブ大学の細胞研究・免疫学部、Hi Geraldo Letter Kremer研究室のエドワード・アゾです。また、Gerardo Letter Kremer Slabにも所属しています。本日は、代謝的にラベル化され結合したオリゴ糖の単離および分析の手順について説明します。当研究室では、細胞全体の糖タンパク質プールおよび個別の糖タンパク質の両方における糖鎖プロセシングのダイナミクスを研究するために、この手順を用いています。それでは、開始しましょう。この手順を始めるにあたり、90 mmディッシュで一晩培養したNIH 3T3細胞を使用してください。各サンプルについて、グルコース飢餓状態にするために細胞をサブコンフルエントの状態にします。20%透析FCSおよび8mMピルビン酸ナトリウムを添加した2倍濃度のグルコースフリー培地を調製し、この2倍濃度培地と同量の脱イオン水で希釈します。培地を予熱し、各細胞サンプルを5mLの新鮮な予熱済み培地中で5〜15分間インキュベートします。チェイス期間が12時間を超える場合は、無菌条件下で細胞を操作してください。インキュベーション期間の終了後、パルスおよびチェイス試料に対応するディッシュに印を付けます。免疫沈降による糖タンパク質解析のためにN-グリカンを標識するには、飢餓培地を、400 µCi/mLのトリチウム標識マンノースを添加し、あらかじめ温めておいたグルコースフリー培地1 mLに置換します。全糖タンパク質の標識および解析には、65 µCi/mLを使用してください。飢餓培地を交換した後、細胞を通常の組織培養条件下で1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション終了後、すべてのサンプルから標識培地を除去します。パルス群に相当するサンプルに、4°CのPBS 2 mLを注意深く加え、氷上に置きます。これらのサンプルをパルスサンプルと呼びます。あらかじめ温めておいた通常の完全培地2 mLを使用します。チェイスサンプルを3回洗浄します。その後、細胞にあらかじめ温めておいた通常培地5 mLを加えます。チェイスサンプルを二酸化炭素インキュベーターに入れ、37 °Cで任意のチェイス期間中培養します。チェイスサンプルの培養中に、氷上に置いてあったパルスサンプルを2 mLの氷冷PBSで3回洗浄します。その後、セルスクレーパーを用いて、ディッシュから細胞を回収します。2 mLのPBSを用いて、遊離させた細胞を2 mLのEORチューブに移します。16,000 ×gで6〜10秒間遠心分離して上澄みを除去し、細胞ペレットを-80 °Cで凍結保存します。チェイスサンプルのインキュベーションが終了したら、それらを洗浄してください。パルスサンプルの場合と同様に、遠心分離を行い保存します。細胞溶解の手順に進む準備ができたら、フリーザーから細胞を取り出します。IP解析については、300 µLのバッファーを加えて細胞を溶解させます。短時間ボルテックスし、氷上で20分間インキュベートします。全糖タンパク質のサンプル分析を行う場合は、300 µLのバッファーBを加えます。細胞を氷上で20分間インキュベートした後、最大振幅で10秒間×4回の超音波処理を行います。その後、サンプルを5分間煮沸します。最後に、すべてのライセートを 16,000 Gs で 4°C、20 分間遠心分離します。上清を新しい EOR チューブに移し、ペレットを廃棄します。ここまでに示した H2A 糖タンパク質の免疫沈降について、目的タンパク質を調べるための IP に進みます。溶解細胞の上清に、サンプルあたり20 µLのprotein A/G beadsと、サンプルあたり3 µLのラボ所有のrabbit polyclonal anti-H2A抗体を加えます。サンプルを4 °Cで4〜16時間、緩やかな回転により絶えず混合しながらインキュベートします。インキュベーション終了後、ビーズを遠心分離して沈殿させ、バキュームを用いて上清を慎重に除去し、500 µLのバッファーTを加えてビーズを4回洗浄します。ビーズを遠心分離して上澄みを除去し、ビーズに結合したタンパク質を遊離させます。Endo Hキットの変性バッファー10 µLをビーズペレットに加え、サンプルを5分間加熱煮沸します。ビーズを遠心分離し、上澄みを新しいEORチューブに移します。elluタンパク質の脱糖鎖化を行う準備が整いました。酵素とOHを用いて、IPサンプルおよび全タンパク質サンプルの両方から糖鎖を遊離させます。IPサンプルには、2x endo H反応バッファー10 µLとともに、endo H酵素0.5 µLを各サンプルに加えます。その後、サンプルを37 °Cで3時間インキュベートします。全糖タンパク質については、細胞溶解液の上清を分画分子量 30 kilodalton の MicroCon フィルターに適用します。14,000 Gs での遠心分離を繰り返し、全タンパク質抽出物を 100 microliters のバッファー E で 3 回洗浄します。洗浄後のタンパク質が残っている MicroCon に、10 x endo H 反応バッファー 3 microliters と endo H 酵素 1.5 microliters を加え、IP サンプルとともに 37 degrees Celsius で 3 時間インキュベートします。3時間のインキュベーション終了後、IPサンプルを脱イオン水で5倍に希釈し、新しいMicroConフィルターの上に載せて14,000 Gsで3分間遠心分離します。次に、IPサンプルと全タンパク質サンプルの両方に50 µLの脱イオン水を加え、遠心分離して洗浄します。この操作をさらに2回繰り返します。切断された糖鎖を含むフロースルー液は、必要に応じてEndo H耐性糖タンパク質を含むチューブに回収してください。その後、200 mUのN-glycosidase Fを15 µLのバッファーCに溶解し、37 °Cで16時間インキュベートします。示した通りに脱イオン水で溶出を行います。プロセスを加速させるため、最大45 °Cまで加熱可能な高速真空濃縮機を使用して、サンプルを完全に乾燥させます。乾燥したペレットを12 µLのHPLC溶媒で再懸濁し、HPLC装置に装着したSPHEカラムまたはアミノカラムにサンプルをロードします。付属の書面プロトコルに従ってサンプルを走行させます。各サンプルの走行につき48分画を回収してください。シンチレーションカウンターを用いて回収した分画のCPM値を測定し、分画番号に対するCPMの読み取り値をプロットします。付属の書面プロトコルに記載されている通り、すべての糖鎖種のマンノース残基の割合を算出します。以下は、1時間のパルスラベル標本から得られた全糖タンパク質の糖鎖分析の代表的な結果です。得られたプロファイルでは、HPLC分画のCPM読み取り値を分画番号の関数としてプロットしています。各ピークは、既知の糖鎖標準物質のHPLC分析によって同定された特定の糖鎖種を表しています。それぞれの糖鎖種について、全糖鎖に占めるモルパーセントをチェイス時間（追跡時間）の関数としてプロットしています。ここに示されているのは、プロテアソーム阻害剤MG 1 32で処理したサンプルから免疫沈降により単離した、特定のミスフォールド糖タンパク質の分析結果です。チェイス期間中にトリミングされた糖鎖種M5Sixが蓄積することから、ミスフォールドしたタンパク質上のオリゴ糖は、分解される前に広範なマンノーストリミングを受けるという結論に至ります。これは、同様に処理したサンプルの全糖タンパク質上のオリゴ糖とは対照的です。後者の場合、チェイス期間中もM9Eightが主要な糖鎖種であり続け、M5Sixの量はわずかに増加するのみでした。このことは、全糖タンパク質プールのうち、小部分のみが小胞体関連分解（ERAD）の標的となることを示唆しています。略称 rad. 同伴する書面プロトコルでさらに詳しく説明している通り、生細胞におけるパルスラベルとHPLC分析を組み合わせることで、糖タンパク質の寿命における非結合型オリゴ糖組成のダイナミクスを追跡する方法を示しました。この手順を行う際は、チェイスサンプルの放射性モノマーによる汚染を避けることが重要です。汚染が発生すると、サイズ分離中のチェイス期間にグリカンの不要なラベル付けが起こります。また、糖鎖の分画の整合性を確保するために、HPLCを一定の圧力に調整することも重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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