Name: ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶSDS-PAGEと免疫ブロッティングによるヒト皮質組織中のAβ多量体検出法。抗原エピトープ検索を用いたホモジネート調製と熱誘導抗原回収により、アルツハイマー病研究における信頼性の高いタンパク質解析が可能です。

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エレインPranskiと優秀な技術支援のためのキャロラインSuwynへとハリーレヴァインIII、M.ポールマーフィー、および重要な会話のためにギアリング​​マーラに感謝します。資金は、RR - 00165、PO1AG026423、P50AG025688、AG030539、ウッドラフ財団、エモリー大学研究委員会によって提供されていました。

パート1：明確に組織ホモジネートの調製<ol><li>約30にも乳棒ストローク（すなわち400μlのバッファを追加すると - （プラス2倍プロテアーゼ阻害剤カクテル[サンタクルス] [およびMg + + -遊離Ca + +] 0.1Mリン酸緩衝生理食塩水）の氷冷緩衝液の4倍のボリュームで固定されていない皮質組織をホモジナイズダウンス100mgの組織への）。 </li><li> 3000グラム（4℃）で5分間ホモジェネートを回転させる。慎重に-80明確上澄み液と、これらの抽出物のストアアリコートを削除° Cを使用するまで。 </li><li>メーカーの指示（ThermoFisher）によると、ビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いて明らかにホモジネートの総タンパク質濃度（μg/μl）を決定します。 </li></ol>パート2：SDS - PAGEのサンプル調製<ol><li>よく10、10から20パーセントトリシンゲル（Invitrogen）を用いて、ウェル毎にロードできる最大量は、〜25μlのです。総体積が2倍のSDSサンプルバッファーと10倍還元剤を含む、ウェル当たり読み込むことができる明確ホモジネートの最大量は10μlのですので。明らかに20％（w / v）の皮質ホモジネートは、ウェルあたり50μgの総蛋白質を考慮し、5μg/μLのより大きいの総タンパク質濃度を持つ必要があります。 5mg/mlのタンパク質より少ないサンプルでは、​​ウェルあたり少なく総タンパク質をロードする必要となります。しかし、高タンパク質レベルは、単量体および凝集したAβ（50 -60μgの総タンパク質が最適である）の検出に最適です。 常にウェルあたりの総タンパク質の同量をロードする。 </li><li>それぞれのゲルのため、負荷などSeeBlue Plus2（Invitrogen社）などの分子量マーカーの10μlを持つだけでなく少なくとも一つ。ポジティブコントロールとして、合成Aβ40または別の同様のAβ42ペプチド（1xPBSで希釈）を10 - 100ngを実行します。 </li><li>たての融解、明らかホモジネートを用いて、氷上で反応混合物を準備します。 5〜10秒間ボルテックスチューブ、100℃、乾燥槽内の熱℃で5分間、その後すぐにキャップで結露を除去するためにすべてのサンプルをスピン。 </li></ol>パート3：SDS - PAGEゲル電気泳動<ol><li> 、メーカーの指示（Invitrogen社）によると、トリシンSDSランニングバッファーを用いて、X細胞確かにロックミニセルGelboxで10〜20％トリシンゲル上にボルテックスのサンプルをロードする</li><li>約90分間125Vの定電圧で泳動する。 4KDaマーカーのバンドがゲルの下端から約1cmになるまでのサンプルが実行してみましょう。 </li></ol>パート4：ゲルから膜への転送タンパク質<ol><li>慎重にメーカーの指示（Invitrogen社）によると、プラスチックケースからゲルを取り出して、X細胞IIブロットモジュール内部の転送サンドイッチを組み立てる。トリス - グリシントランスファーバッファー（20％メタノール）によるプリウェットブロッティングパッドおよび0.2μmのニトロセルロース膜、およびパッドまたはろ紙/メンブレンサンドイッチをブロッティングから気泡を取り除く。 </li><li> X細胞Gelboxでは、転送バッファで、内部チャンバーを記入し、DIH 2 O（メタノールへの暴露が時間をかけてプラスチックgelboxを身に着けることができる）と外室を埋める。 </li><li> 25mAの一定のアンペア数で2-3時間の転送を実行します。 </li><li>転送が完了したら、サンドイッチを分解すると、両方の正方形のプラスチックペトリ皿で1xPBS、（または他の適当な容器）にDIH 2 Oと膜にゲルを置く。 </li><li>タンパク質の転送の効率を可視化するために、ゲルは単にブルーSafeStain（インビトロジェン社）で染色することができ、ポンソーSレッド染色（シグマアルドリッチ）を有する膜、両方の製造元の指示に従って。この染色は、免疫ブロット法に干渉することはありません。染色は、非効率的なタンパク質の転送があることが判明した場合は、手順3で転送時間を変更します。 </li></ol>第5部。抗原エピトープの検索＆イムノ<ol><li>抗原賦活化は、免疫ブロット中に抗体の結合のための膜にAβエピトープを明らかにする重要なステップです。どんな蒸し器、電子レンジ、または100の温度を一定に維持° Cで十分です水浴。蒸し器での抗原の検索の場合は、室温で、1xPBSで満たされたヘビーデューティKapakのプラスチック袋の膜を熱融着させる。あらかじめ温めておいた蒸し器のフラットポーチを置く、ポーチは、さらに15分間インキュベート、拡大して始まると。膜が過度のしわを防ぐため、袋から取り出す前に、ゆっくりと冷却してください。 </li><li>室温で、慎重に蒸し袋からメンブレンを取り出し、5分（0.05％のTween - 20で生理食塩水、pH8.0のをTris緩衝TBS - Tで洗浄、続い1xPBSで5分間メンブレンを、すすぎ[シグマ] ）、オービタルシェーカー上で。揺れ、一時間ブロッキング溶液で膜（TBS - Tで2.5％脱脂乳）をインキュベートする。洗浄せずに、泡を避け、（1:1,000で6E10 [1μg/mlの] 5,000 [0.2μg/ml]希釈、Covance）ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を含んでいる皿やプラスチック製の袋に膜を転送S.一時間してから、4℃で振盪24〜48時間室温でオービタルシェーカー上でインキュベートする（より長いインキュベーションがより良好な信号を与えるかもしれない）。 </li><li> TBS - Tで30分間メンブレンをリンス（ワンクイック3 × 10分のリンスに続いてリンス）。 </li><li>室温でシェーカー上で90分間ブロッキング溶液に1:10,000に希釈したHRP -標識二次抗体のメンブレン（Amersham ECLヒツジ抗マウス、GE Healthcare）を、、インキュベートする。 </li><li> TBS - Tで30分間メンブレンをリンス（ワンクイック3 × 10分のリンスに続いてリンス）。 </li><li>シェーカー上で、プラスチックシートプロテクターの間に、糸くずのろ紙上に余分な試薬をオフブロットおよびフィルムカセットにメンブレンを置き、5分間たてのSuperSignalウエストのピコの電気化学発光試薬（ThermoFisher）で膜をインキュベートする。ダストフリーキムワイプ、必要に応じて追加のSuperSignal試薬をオフに汚点。 </li><li>最大30分30秒の間隔でコダックバイオマックスMRフィルムに感光させるとフィルムの開発者で開発する。 5分後、Aβモノマーのバンドは、おそらく飽和状態になることがあります。 </li><li>膜は、室温で30分間の復元プラスストリッピングバッファーで振盪することによって（TBS - Tで洗浄後に）取り除かれ、必要に応じて追加の抗体で再プローブすることができます。 </li></ol>パート6：代表イムノブロット： <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1a.jpg" alt="図1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1a"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1b.jpg" alt="図1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1b"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1c.jpg" alt="図1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1c"> 図1a - C。7ヒト被験者から50μgの総タンパク質を含む清澄ホモジネートは、多量体AβとAPPの存在について分析されています。抗体6E10でイムノブロッティングするAβモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、およびすべてのアルツハイマー病のケースでAPP（上部バンド）、同様に2段のAD症例の豊富な高い分子量のAβの多量体を明らかにする。合成Aβ40は、低分子量のバンドのアイデンティティを確認する。 AD：アルツハイマー病、DLB：レビー小体型、NDと認知症：ヒトNondemented（）30分のフィルム露光、（b）に 5分間のフィルム露光、（C）30秒のフィルム露光。

<ol><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebral+proteopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+amyloid%2C+and+Alzheimer%27s+disease%3A+a+perspective+in+honor%5BTitle%5D)+AND+%22of+Carl+Cotman.+Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li>
<li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li>
<li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li>
<li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li>
</ol>

アルツハイマー病1,4,5の病因におけるAβ凝集の重要性にもかかわらず、いくつかの研究ではヒト皮質組織試料2に、多様なAβ多量体の分布を説明したり、定量化している。一般的に使用される免疫組織化学法は、固定皮質組織内で個別の多量Aβの種の識別のために許可されていません。固定されていない皮質組織ホモジネートでは、Aβ多量体を分離し、生化学的にゲル電気泳動と抗体ベースの検出方法を用いて評価することができる。しかし、対象とするAβエピトープを検出し、集約されたAβの正確な定量化を防止する、集約と翻訳後修飾ペプチドの構造内に隠されている場合があります。 SDS - PAGE及びAβ6,7のN末端 ​​領域に対する抗体でイムノブロッティングと組み合わせた熱による抗原エピトープの検索を使用して、我々は分離し、自然に人間の脳から単離されたAβ多量体を発生する検出することができます。明らかに組織ホモジネート中の異なるAβ多量体の集団は、デンシトメトリーにより定量することができる。さらに、天然由来のさらなる構造特性評価を可能にするAβの免疫ブロットとゲルまたは膜抽出の組み合わせは、翻訳後にヒ...

<table><tbody><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-29130</td><td>バッファー 25ml に 1 錠</td></tr><tr><td>BCAタンパク質定量キット</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell および XCell II Blot Module キット CEマーク</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDSサンプルバッファー (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGEサンプル還元剤 (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 プレステイン標準マーカー</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine ゲル 1.0 mm, 10ウェル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625BOX</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜, 孔径 0.2 &amp;mu;m</td><td>Invitrogen</td><td>LC2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDSランニングバッファー (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine転写バッファー (25X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>免疫染色を妨げない</td></tr><tr><td>ATXポンソーS赤染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09276</td><td>免疫染色を妨げない</td></tr><tr><td>Kapak熱シール可能プラスチックサンプルポーチ</td><td>Fisher Scientific</td><td>0181225AA</td><td></td></tr><tr><td>A&amp;#946;(1-16)に対する6E10マウスモノクローナル抗体</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>WB用に 1:1,000 から 1:5,000 まで希釈</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>ECLマウスIgG, HRP標識全A&amp;#946; (羊由来)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>1:10,000 に希釈</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学発光基質</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Biomax MR フィルム</td><td>Carestream Health</td><td>870 1302</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト皮質組織におけるaβ多量体のsds-page/immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

β-アミロイドの異常折り畳み及び重合（Aβ）ペプチドは、アルツハイマー病の発症の神経変性カスケードを開始すると考えられている<sup&gt; 1</sup&gt;。アルツハイマー病の脳老人斑のコアに見られるβ-シートが豊富なアミロイド線維への自己凝集する傾向があるまたは42アミノ酸のペプチド - Aβは、主に40です。証拠を増やすと、その低分子量は、可溶性Aβの多量の線維Aβのアミロイドよりも毒性が示唆<sup&gt; 2</sup&gt;。脳組織における低および高分子量の多量のAβ種の同定と定量は、アルツハイマー病の研究に不可欠な目標である、とも用いられる方法は他のproteopathiesに有毒な多量体の同定と特性評価に適用することができます<sup&gt; 3</sup&gt;。天然由来のAβ多量体は、Aβ特異的抗体を用いたイムノブロッティングに続いてSDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出することができます。しかし、多量Aβの分離と検出には小さいポアサイズのニトロセルロース膜に高濃度の皮質ホモジネートと抗原の検索を使用する必要があります。ここでは、明らかに人間の大脳皮質のホモジネート、SDS - PAGEによるタンパク質の分離、および抗原エピトープの検索/AβペプチドのN末端領域に対する抗体6E10とウェスタンブロッティングの準備のためのテクニックを説明します。このプロトコルを使用して、我々は一貫してアルツハイマー病の病理と人間からの皮質組織でAβモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、およびより高い分子量のマルチマーを検出する。

我々は明らかに人間の皮質ホモジネート、SDS - PAGEによるタンパク質の分離、抗原の検索とAβペプチドに対する抗体でイムノブロットを調製するためのテクニックを説明します。このプロトコルを使用して、我々は一貫してアルツハイマー病の病理と人間からの皮質組織で単量体と多量体Aβを検出する。

ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

$\beta$-アミロイド（A$\beta$）ペプチドの異常な折り畳みと重合は、アルツハイマー病における神経変性カスケードを開始させると考えられています。

このプロトコルでは、ヒト皮質組織におけるbeta maltersの検出を可能にします。まず、ホモジナイズした組織をプローブソニケーションし、低速遠心分離によって清澄化します。次に、SDSバッファー中で煮沸し還元したサンプルをポリアクリルアミドゲルにロードします。ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、リン酸緩衝生理食塩水中で膜を蒸気加熱します。最後に、オービタルシェーカーを用いて、一次抗体、HRP標識二次抗体、そしてルミノール発光試薬の順に膜を一夜浸漬し、X線フィルムで露光します。こんにちは、エモリー大学ヤーキーズ国立霊長類研究センター神経科学部のラリー・ウォーカー研究室のレベッカ・ローゼンです。本日は、熱誘起抗原賦活化を伴うSDSゲル電気泳動およびイムノブロッティングを用いて、Abetaマルチマーと皮質ホモジェネートを検出する方法をご紹介します。当研究室ではこの手順を用いて、アルツハイマー病患者および高齢の非ヒト霊長類から得られた非固定皮質組織における、異なるAbetaマルチマーのレベルと分布を研究しています。それでは始めていきましょう。固定していない皮質組織約100 mgから開始し、氷冷したバッファー約400 µL中で、ペッスルを用いて約30回均一にホモジナイズします。重量対容量比20%の場合、組織重量とバッファー容量の比率は1 mg：4 µLとなります。ホモジナイズ後、ホモジネートを4 mLポリプロピレンチューブに移し、出力5で5秒間のプローブ超音波処理を3回行います。超音波処理後、ホモジネートを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、3000 Gで5分間遠心分離します。清澄化した上清を慎重に取り除き、これらの抽出液を50 µLずつ分注して、使用時まで-80 °Cで保存します。次に、解凍したばかりの清澄化ホモジネート分注液について、製造元の指示に従い、bio acidまたはBCAアッセイを用いて総タンパク質濃度を測定します。清澄化した20%皮質ホモジネートのタンパク質濃度は5 µg/µL以上であるはずであるため、プレートリーダーの測定範囲内に収まるよう10倍に希釈することが可能です。BCAアッセイでは、同じ清澄化ホモジネート分注液を用いて変性サンプル反応液を調製します。総タンパク質を概ね 50 〜 60 µg 使用し、各サンプルの総タンパク質量が同一になるように皮質ホモジネートの量を調整します。流す 10 〜 20% trice ゲルの1つにつき、総量 25 µL になるようにサンプルを調製します。各ゲルについて、10 〜 100 ng の合成 a beta 40 または a beta 42 ペプチドを 1X PBS で 10 µL に希釈し、これに 12.5 µL の 2X SDS サンプルバッファーと 2.5 µL の 10x 還元剤を加えた陽性対照を調製します。ベータコントロールを含むすべてのサンプルの調製後、ボルテックスミキサーで5〜10秒間撹拌し、ドライバスを用いて100 °Cで5分間加熱します。その後、すべてのチューブを迅速に遠心し、キャップ内部の結露を除去します。トリスSDS電気泳動バッファーに浸したゲルボックス内のゲルにサンプルをロードし、少なくとも1つのウェルに未希釈の分子量マーカーを10 µLロードします。125 Vの定電圧で約90分間、または4 kDaのマーカーがゲルの下端から約1 cmの位置に達するまで電気泳動を行います。プラスチックケースからゲルを注意深く取り出し、メーカーの指示に従って転写サンドイッチを組み立てます。ブロッティングパッドとマイクロメートル硝化セルロース膜をTris-glycine転写バッファーで十分に湿らせます。ブロッティングパッドまたはフィルターペーパー膜のサンドイッチから気泡を取り除きます。転写装置の内槽に転写バッファーを、外槽に蒸留水を満たします。電流を25 milliampsの一定値に設定し、2〜3時間転写を行います。転写完了後、サンドイッチ構造を分解し、ゲルを蒸留水を入れたディッシュに、メンブレンを1×PBSを入れたディッシュにそれぞれ移します。乾燥を防ぐため、ゲルとメンブレンが完全に液体に浸っていることを確認してください。タンパク質転写の効率を可視化するには、ゲルを希釈していないSimplyBlue Safe Stainで約1時間、メンブレンを1x PON S red stainで約5分間染色します。インキュベーション時間は製造元の指示に従ってください。この染色はイムノブロッティングを妨げません。染色によってタンパク質の転写効率が低いことが判明した場合は、ステップ3の転写時間を変更し、抗原賦活化を行ってください。室温の1×PBSを約50 mL満たした丈夫なCapExプラスチックポーチにメンブレンを入れ、熱シールします。100 °Cに予熱したスチーマーの中にポーチを平らに置き、ポーチが膨張し始めたら、さらに15分間インキュベートしてからスチーマーから取り出します。室温で過度にしわができるのを防ぐため、膜をポーチから取り出す前にゆっくりと冷却させます。ポーチから慎重に膜を取り出し、オービタルシェーカーを用いて1 XPBSで5分間洗浄し、続いてTBSTで5分間洗浄します。次に、洗浄せずにブロッキング液中で1時間オービタルシェーカーを用いてインキュベートし、その後、ブロッキング液で1:1,000から1:5,000に希釈したA betaのC末端領域に特異的な一次抗体6 E 10を含むディッシュに膜を移します。室温のオービタルシェーカーで1時間インキュベートし、その後、4°Cで振盪しながら24〜48時間インキュベートします。素早く1回すすいだ後、メンブレンを30分間洗浄します。続いて、オービタルシェーカーを用いてTBSTで10分間のすすぎを3回行います。ブロッキング溶液で1:10,000に希釈したHRP標識二次抗体中で、メンブレンをシェーカーを用い室温で90分間インキュベートします。本プロトコルでは、羊抗US抗体を使用します。その後、オービタルシェーカーを用い、まず短時間の洗浄を1回行い、続いて10分間の洗浄を3回、計30分間TBSTでメンブレンを洗浄します。最後の洗浄後、調製したばかりの希釈していないSuperSignal West Pico ECL試薬中でメンブレンを5分間インキュベートします。高回転のシェーカーからメンブレンを取り出し、余分な試薬を振り落とします。糸くずの出ないフィルターペーパーまたはキムワイプスを用い、プラスチック製のシートプロテクターで挟んでメンブレンをフィルムカセットに入れ、さらに余分なSuperSignal試薬をダストフリーのキムワイプスで吸い取ります。必要に応じて、Kodak Biomax MR.Filmに30秒から最大30分まで露光し、現像液で現像します。本実験では、5分後にはA betaモノマーのバンドがおそらく飽和します。7人の被験者から得た総タンパク質50 µgを含む清澄化ホモジネートを用いて、マルチマー化したbetaアミロイド（A beta）、およびA betaペプチドが切断される膜貫通タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（APP）の存在を解析しました。ここでは、A beta および APP のウェスタンブロット実験における、30 分間および 5 分間露光の代表的な画像を示します。30 分間の露光では、はるかに薄い A beta のダイマー、トリマー、テトラマー、およびそれ以上の高分子量または凝集バンドを可視化できますが、5 分間の露光時間では他のレーンが露出過剰になります。同様のテトラマーバンドが存在しますが、5 分間の露光では淡くなり、他のレーンを明確に可視化することが可能になります。レーン1から3にはアルツハイマー病（AD）患者の皮質ホモジネートが、レーン4にはレビー小体型認知症（DLB）およびアルツハイマー病と診断されたヒト被験者が、レーン5および6にはレビー小体型認知症の症例が、そしてレーン7には高齢の非認知症ヒト対照群が示されています。抗体6C10を用いた免疫ブロットにより、すべてのアルツハイマー病症例においてAβモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびオリゴマーが検出されたほか、2例のAD症例では高分子量のAβマルチマーが豊富に認められました。これは、ヒト被験者間におけるAβ凝集の不均一性を示しています。右レーンのAβ40により、低分子量バンドの正体が確認されました。以上が、神経変性疾患患者の脳から得た非固定組織ホモジネート中のAβマルチマーを同定するための、SDS-PAGEウェスタンブロット実験の手順です。この手順を行う際は、低含有量のAβマルチマーを検出するために、ゲル電気泳動で分離可能な高濃度の皮質ホモジネートを調製することが重要です。Abetaペプチドに対する抗体を用いてイムノブロッティングを行う前に、熱誘起抗原エピトープ検索を実施することも重要です。抗原検索を行うことで、隠蔽されたAbetaエピトープを露出し、イムノブロッティング中の抗体結合を最適化することができます。100 °Cを維持できるスチーマー、電子レンジ、またはウォーターバスであればどのようなものでも十分です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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ここでは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-シヌクレイン（α-syn）を単離するためのプロトコルを提示します。界面活性剤強度が増大するバッファーと高速超遠心分離技術の利用により、疾患組織および非疾患組織におけるα-syn凝集の変動特性を調べることができます。...

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ここでは、著者らは、精製されたモノクローナル抗体とドットブロットハイブリダイゼーションによるペプチドスキャンを使用して、線状抗原エピトープを定義するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示します。同定されたエピトープは、その後、治療および診断アプリケーションに使用できます。...

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。...

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β...

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

本研究では、サリドマイド類似体の標的であるE3ユビキチン・リゲス・セレブロン(CRBN)のユビキチン化および分解を誘導する新規アプローチとして、ポマリドマイドベースの二機能ホモ-PROTACの合成と特徴付けについて述べている。...

ポマリドマイドベースのホモ・プロタクによるE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化

タンパク質間相互作用は、標的タンパク質の機能解明に重要であり、共免疫沈降(co-IP)によりPPIを容易に確認することができます。エピトープタグ付きタンパク質をコードするプラスミドをHEK-293細胞に一過性にトランスフェクションし、2つの標的タンパク質の結合を簡便に確認できる免疫沈降法を開発しました。...

タンパク質間相互作用を研究するための抗エピトープタグアフィニティーゲルによる免疫沈降(英語)

ここでは、ヒトγ-セクレターゼを再構成する酵母系について述べる。このシステムにより、活性に影響を与える突然変異の同定と研究、およびγ-セクレターゼ阻害剤(GSI)のスクリーニングが可能になります。家族性アルツハイマー病変異体の機能喪失特性を利用して、γ-セクレターゼモジュレーター(GSM)のスクリーニングが可能です。...

出芽酵母 γ-セクレターゼによるアミロイドベーターゼ産生に影響を与える遺伝子、突然変異、および化学物質をスクリーニングするためのアルツハイマー病のモデル

学ぶSDS-PAGEと免疫ブロッティングによるヒト皮質組織中のAβ多量体検出法。抗原エピトープ検索を用いたホモジネート調製と熱誘導抗原回収により、アルツハイマー病研究における信頼性の高いタンパク質解析が可能です。

ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

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