ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

このプロトコルでは、ヒト皮質組織におけるbeta maltersの検出を可能にします。まず、ホモジナイズした組織をプローブソニケーションし、低速遠心分離によって清澄化します。次に、SDSバッファー中で煮沸し還元したサンプルをポリアクリルアミドゲルにロードします。

ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、リン酸緩衝生理食塩水中で膜を蒸気加熱します。最後に、オービタルシェーカーを用いて、一次抗体、HRP標識二次抗体、そしてルミノール発光試薬の順に膜を一夜浸漬し、X線フィルムで露光します。こんにちは、エモリー大学ヤーキーズ国立霊長類研究センター神経科学部のラリー・ウォーカー研究室のレベッカ・ローゼンです。

本日は、熱誘起抗原賦活化を伴うSDSゲル電気泳動およびイムノブロッティングを用いて、Abetaマルチマーと皮質ホモジェネートを検出する方法をご紹介します。当研究室ではこの手順を用いて、アルツハイマー病患者および高齢の非ヒト霊長類から得られた非固定皮質組織における、異なるAbetaマルチマーのレベルと分布を研究しています。それでは始めていきましょう。

固定していない皮質組織約100 mgから開始し、氷冷したバッファー約400 µL中で、ペッスルを用いて約30回均一にホモジナイズします。重量対容量比20%の場合、組織重量とバッファー容量の比率は1 mg：4 µLとなります。ホモジナイズ後、ホモジネートを4 mLポリプロピレンチューブに移し、出力5で5秒間のプローブ超音波処理を3回行います。

超音波処理後、ホモジネートを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、3000 Gで5分間遠心分離します。清澄化した上清を慎重に取り除き、これらの抽出液を50 µLずつ分注して、使用時まで-80 °Cで保存します。次に、解凍したばかりの清澄化ホモジネート分注液について、製造元の指示に従い、bio acidまたはBCAアッセイを用いて総タンパク質濃度を測定します。清澄化した20%皮質ホモジネートのタンパク質濃度は5 µg/µL以上であるはずであるため、プレートリーダーの測定範囲内に収まるよう10倍に希釈することが可能です。BCAアッセイでは、同じ清澄化ホモジネート分注液を用いて変性サンプル反応液を調製します。

総タンパク質を概ね 50 〜 60 µg 使用し、各サンプルの総タンパク質量が同一になるように皮質ホモジネートの量を調整します。流す 10 〜 20% trice ゲルの1つにつき、総量 25 µL になるようにサンプルを調製します。各ゲルについて、10 〜 100 ng の合成 a beta 40 または a beta 42 ペプチドを 1X PBS で 10 µL に希釈し、これに 12.5 µL の 2X SDS サンプルバッファーと 2.5 µL の 10x 還元剤を加えた陽性対照を調製します。

ベータコントロールを含むすべてのサンプルの調製後、ボルテックスミキサーで5〜10秒間撹拌し、ドライバスを用いて100 °Cで5分間加熱します。その後、すべてのチューブを迅速に遠心し、キャップ内部の結露を除去します。トリスSDS電気泳動バッファーに浸したゲルボックス内のゲルにサンプルをロードし、少なくとも1つのウェルに未希釈の分子量マーカーを10 µLロードします。125 Vの定電圧で約90分間、または4 kDaのマーカーがゲルの下端から約1 cmの位置に達するまで電気泳動を行います。

プラスチックケースからゲルを注意深く取り出し、メーカーの指示に従って転写サンドイッチを組み立てます。ブロッティングパッドとマイクロメートル硝化セルロース膜をTris-glycine転写バッファーで十分に湿らせます。ブロッティングパッドまたはフィルターペーパー膜のサンドイッチから気泡を取り除きます。

転写装置の内槽に転写バッファーを、外槽に蒸留水を満たします。電流を25 milliampsの一定値に設定し、2〜3時間転写を行います。転写完了後、サンドイッチ構造を分解し、ゲルを蒸留水を入れたディッシュに、メンブレンを1×PBSを入れたディッシュにそれぞれ移します。

乾燥を防ぐため、ゲルとメンブレンが完全に液体に浸っていることを確認してください。タンパク質転写の効率を可視化するには、ゲルを希釈していないSimplyBlue Safe Stainで約1時間、メンブレンを1x PON S red stainで約5分間染色します。インキュベーション時間は製造元の指示に従ってください。この染色はイムノブロッティングを妨げません。

染色によってタンパク質の転写効率が低いことが判明した場合は、ステップ3の転写時間を変更し、抗原賦活化を行ってください。室温の1×PBSを約50 mL満たした丈夫なCapExプラスチックポーチにメンブレンを入れ、熱シールします。100 °Cに予熱したスチーマーの中にポーチを平らに置き、ポーチが膨張し始めたら、さらに15分間インキュベートしてからスチーマーから取り出します。

室温で過度にしわができるのを防ぐため、膜をポーチから取り出す前にゆっくりと冷却させます。ポーチから慎重に膜を取り出し、オービタルシェーカーを用いて1 XPBSで5分間洗浄し、続いてTBSTで5分間洗浄します。次に、洗浄せずにブロッキング液中で1時間オービタルシェーカーを用いてインキュベートし、その後、ブロッキング液で1:1,000から1:5,000に希釈したA betaのC末端領域に特異的な一次抗体6 E 10を含むディッシュに膜を移します。

室温のオービタルシェーカーで1時間インキュベートし、その後、4°Cで振盪しながら24〜48時間インキュベートします。素早く1回すすいだ後、メンブレンを30分間洗浄します。続いて、オービタルシェーカーを用いてTBSTで10分間のすすぎを3回行います。

ブロッキング溶液で1:10,000に希釈したHRP標識二次抗体中で、メンブレンをシェーカーを用い室温で90分間インキュベートします。本プロトコルでは、羊抗US抗体を使用します。その後、オービタルシェーカーを用い、まず短時間の洗浄を1回行い、続いて10分間の洗浄を3回、計30分間TBSTでメンブレンを洗浄します。

最後の洗浄後、調製したばかりの希釈していないSuperSignal West Pico ECL試薬中でメンブレンを5分間インキュベートします。高回転のシェーカーからメンブレンを取り出し、余分な試薬を振り落とします。糸くずの出ないフィルターペーパーまたはキムワイプスを用い、プラスチック製のシートプロテクターで挟んでメンブレンをフィルムカセットに入れ、さらに余分なSuperSignal試薬をダストフリーのキムワイプスで吸い取ります。

必要に応じて、Kodak Biomax MR.Filmに30秒から最大30分まで露光し、現像液で現像します。本実験では、5分後にはA betaモノマーのバンドがおそらく飽和します。7人の被験者から得た総タンパク質50 µgを含む清澄化ホモジネートを用いて、マルチマー化したbetaアミロイド（A beta）、およびA betaペプチドが切断される膜貫通タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（APP）の存在を解析しました。

ここでは、A beta および APP のウェスタンブロット実験における、30 分間および 5 分間露光の代表的な画像を示します。30 分間の露光では、はるかに薄い A beta のダイマー、トリマー、テトラマー、およびそれ以上の高分子量または凝集バンドを可視化できますが、5 分間の露光時間では他のレーンが露出過剰になります。同様のテトラマーバンドが存在しますが、5 分間の露光では淡くなり、他のレーンを明確に可視化することが可能になります。

レーン1から3にはアルツハイマー病（AD）患者の皮質ホモジネートが、レーン4にはレビー小体型認知症（DLB）およびアルツハイマー病と診断されたヒト被験者が、レーン5および6にはレビー小体型認知症の症例が、そしてレーン7には高齢の非認知症ヒト対照群が示されています。抗体6C10を用いた免疫ブロットにより、すべてのアルツハイマー病症例においてAβモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびオリゴマーが検出されたほか、2例のAD症例では高分子量のAβマルチマーが豊富に認められました。これは、ヒト被験者間におけるAβ凝集の不均一性を示しています。

右レーンのAβ40により、低分子量バンドの正体が確認されました。以上が、神経変性疾患患者の脳から得た非固定組織ホモジネート中のAβマルチマーを同定するための、SDS-PAGEウェスタンブロット実験の手順です。この手順を行う際は、低含有量のAβマルチマーを検出するために、ゲル電気泳動で分離可能な高濃度の皮質ホモジネートを調製することが重要です。

Abetaペプチドに対する抗体を用いてイムノブロッティングを行う前に、熱誘起抗原エピトープ検索を実施することも重要です。抗原検索を行うことで、隠蔽されたAbetaエピトープを露出し、イムノブロッティング中の抗体結合を最適化することができます。100 °Cを維持できるスチーマー、電子レンジ、またはウォーターバスであればどのようなものでも十分です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。