ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

このプロトコルは、ヒト皮質組織におけるベータモルターの検出を可能にします。最初に均質化された組織をプローブ超音波処理し、低速遠心分離によって清澄化します。次に、還元サンプルをSDSバッファーで煮沸し、ポリアクリルアミドにロードしました。

ゲルタンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写し、メンブレンをリン酸緩衝生理食塩水で水蒸気加熱します。最後に、オービタルシェーカー上で、メンブレンを一次抗体HRP標識二次抗体で一晩インキュベートし、次に管腔過酸化物試薬をX線フィルムに曝露します。こんにちは、エモリー大学のヤーキス国立霊長類研究センター神経科学科のラリー・ウォーカー研究室のレベッカ・ローゼンです。

本日は、SDSゲル電気泳動と熱誘起抗原賦活化による免疫ブロッティングを使用して、Abetaマルチマーと皮質均質性を検出する方法をご紹介します。この手順を私たちの研究室で使用して、アルツハイマー病のヒトおよび老化したヒト霊長類の未固定皮質組織における異なるAβマルチマーのレベルと分布を研究しています。それでは始めましょう。

約100ミリグラムの未固定皮質組織から始めて、約400マイクロリットルの氷冷バッファーで約30回の均一な乳棒ストロークで均質化します。体積あたりの重量が20%の場合、組織の重量とバッファーの体積比は1ミリグラムから4マイクロリットルである必要があります。均質化後、ホモジネートを4ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、プローブは5倍で5秒間3回超音波処理します。

超音波処理後、ホモジネートを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、5分間回転させます3000 Gで、清澄化された上清を慎重に除去し、これらの抽出物の50マイクロリットルのアリコートをマイナス80°Cで保存します。次に、製造元の指示に従って、バイオ酸またはBCAアッセイを使用して、清澄化されたホモジネートの新たに解凍されたアリコートの総タンパク質濃度を決定します 20%皮質ホモジネートは、マイクロリットルあたり5マイクログラムを超えるタンパク質濃度を持つ必要があるため、プレートリーダーの範囲内にあるように1〜10に希釈できます。BCAアッセイでは、清澄化ホモジネートと同じアリコートで変性サンプル反応を調製します。

約50〜60マイクログラムの総タンパク質を使用し、それに応じて皮質ホモジネートの量を調整し、それぞれが同じ総タンパク質を含むようにします。分析する10〜20%のトリスゲルごとに、合計25マイクロリットルまでサンプルを準備します。各ゲルについて、10〜100ナノグラムの合成β40またはβ42ペプチドを10マイクロリットルに希釈し、12.5マイクロリットルの2つのXSDSサンプルバッファーと2.5マイクロリットルの10倍還元剤を

ベータコントロールボルテックスを5〜10秒間、100°Cのドライバスで5分間加熱するなど、すべてのサンプルを調製した後、すべてのチューブをすばやく回転させてキャップ内の結露を取り除きます。ゲルボックス内のtrice SDSランニングバッファーに浸したゲルにサンプルをロードし、少なくとも1つのウェルに10マイクロリットルの未希釈分子量マーカーをロードします。125ボルトの定電圧で約90分間、または4キロのダルトンマーカーがゲルの底から約1cmになるまで、ゲルを泳動させます。

プラスチックケースからジェルを慎重に取り出し、メーカーの指示に従ってトランスファーサンドイッチを組み立てます。ブロッティングパッドをあらかじめ湿らせ、トリスグリシンでマイクロメートルのニトロセルロースメンブレンを指差します。バッファーを移し、吸い取りパッドまたは濾紙メンブレンサンドイッチから気泡を取り除きます。

移送装置の内部チャンバーに移送バッファーを充填し、外部チャンバーに蒸留水を満たします。25 ミリアンペアの一定のアンペア数で 2 時間から 3 時間転送を実行します。移し替えが完了したら、サンドイッチを分解し、ゲルを蒸留水で満たされた皿に入れ、メンブレンを1つのXPBSで満たされた皿に入れます。

乾燥を防ぐために、ゲルとメンブレンは液体で完全に覆われていることを確認してください。タンパク質転写染色剤の効率を可視化するには、希釈されていないシンプルな青色の安全な染色剤をゲル化して約1時間のインキュベーション時間で、メンブレンを1 x PON Sの赤色染色剤で約5分間使用しています。インキュベーション時間はメーカーの指示に従っており、この染色は免疫ブロッティングを妨げません。

染色により非効率的なタンパク質導入が明らかになった場合は、抗原賦活化のためにステップ3の転写時間を変更します。スチーマーでは、室温で約50ミリリットルのXPBSを充填した頑丈なCapExプラスチックポーチでメンブレンをヒートシールします。ポーチが膨張し始めたら、100°Cに予熱した蒸し器にポーチを平らに置き、さらに15分間インキュベートしてから蒸し器から取り出します。

メンブレンをポーチから取り外す前に、メンブレンをゆっくりと冷まして、室温での過度のしわを防ぎます。ポーチからメンブレンを慎重に取り出し、メンブレンをオービタルシェーカーで5分間すすぎ、XPBSを1つ使用した後、オービタルシェーカーでTBSTを5分間すすぎます。次に、メンブレンをブロッキング溶液中で1時間、すすぎずにオービタルシェーカー上でインキュベートし、メンブレンをAベータおよび末端領域に特異的な一次抗体6 E 10を含有する皿に移し、ブロッキング溶液中で1〜1000〜1〜5,000に希釈した。

オービタルシェーカーで室温で1時間インキュベートし、その後4°Cで振とうしながら24〜48時間インキュベートします。さっと1回すすいだ後、メンブレンを30分間洗います。TBSTでは、オービタルシェーカーで10分間のすすぎを3回行います。

メンブレンを、ブロッキング溶液中で1〜10,000で希釈したHRP標識二次抗体にインキュベートし、室温でシェーカー上で90分間。このプロトコルでは、ヒツジの抗米国抗体を使用します。再び、TBSTでは、1回のクイックすすぎから始めて、オービタルシェーカーで3回の10分間のすすぎでメンブレンを30分間すすぎます。

最後のすすぎ後、メンブレンを新たに調製した希釈されていないスーパーシグナルWest Pico ECL試薬で5分間インキュベートします。高回転のシェーカーで、メンブレンを取り外し、余分な試薬をブロスで取り除きます。糸くずの出ない濾紙またはキンワイプを使用して、プラスチックシートプロテクターの間のフィルムカセットにメンブレンを置き、ダストフリーのキムワイプで追加のスーパーシグナル試薬を拭き取ります。

必要に応じて、Kodak Biomax MRに曝露します。30秒の間隔、最大30分の間隔でフィルムを作成し、フィルム現像液で現像します。5分後、この実験では、Aベータモノマーバンドはおそらく飽和します。7人のヒト被験者からの総タンパク質50マイクログラムを含む清澄化されたホモジネートについて、多量体ベータアミロイドまたはベータおよびアミロイド前駆体タンパク質またはPP(Aベータペプチドが切断される膜貫通タンパク質)の存在について分析しました。

ここでは、30分と5分の露光におけるAベータPPウェスタンブロット実験の代表的な画像を示します。30分間の露光では、Abetaのはるかに軽い二量体、トライア、四量体、および高分子量または靭帯のバンドを視覚化できますが、5分間の露光時間で他のレーンを過剰に露光します。同じ四量体バンドが存在しますが、かすかに存在し、他のレーンをはっきりと視覚化できます。

アルツハイマー病またはADの被験者の皮質ホモジネートはレーン1から3で見られ、元気な体型またはDLBでアルツハイマー病と診断された人間の被験者はレーンで見られ、レビー小体型の認知症の4例がレーン5と6で見られ、高齢の非認知症の人間の対照例が見られます。レーン7では、抗体6 C 10による免疫開花により、すべてのアルツハイマー病症例でベータモノマー、二量体、トリマー、四量体、PPが認められ、高分子量も豊富に認められました。ベータは、合成された人間の被験者間のベータ化の不均一性を示す2つの広告ケースでmaltersです。

右車線のベータ40は、低分子量バンドの同一性を確認します。神経変性疾患を持つヒトの脳から未固定組織ホモジネート中のβマルチマーを特定するためのSDSページの西洋体実験をお見せしました。この手順を実行するときは、ゲル電気泳動による分離のために高濃度の皮質均質を調製して、存在量の少ないAβマルターを明らかにすることが重要です。

また、Aβペプチドに対する抗体を用いて免疫ブロッティングを行う前に、熱誘起抗原エピトープ賦活化を行うことも重要です。抗原賦活化は、免疫ブロッティング中の最適な抗体結合のために、不明瞭なAβエピトープを明らかにするのに役立ちます。摂氏100度を維持するスチーマー、電子レンジ、またはウォーターバスで十分です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。