真核生物のポリリボソームプロファイル解析

この手順の全体的な目標は、細胞溶解物からモノゾーン画分とポリリボソーム画分を分離し、比較することです。これは、最初に目的の細胞を培養することによって達成されます。手順の2番目のステップは、細胞ライセートを調製することです。

手順の3番目のステップは、ショ糖勾配を介してライセートを遠心分離することです。手順の最後のステップは、グラジエントを分画し、UVトレースを通じてさまざまなリボソーム集団を視覚化することです。最終的には、ポリリボソームプロファイル分析を通じて、さまざまな実験条件下での翻訳の変化を示す結果を得ることができます。

こんにちは、私はUMDおよびJロバートウッドジョンソン医科大学の分子遺伝学、微生物学および免疫学部門のテリー・ゴス・キンゼイ博士の研究室のアンソニー・エスポジトです。そして、私はマーカス・ルイスです。また、マッキンゼーのラボ(R-W-J-M-S)からもお送りします。

ポリリボソーム分析の手順をお見せします。私たちの研究室では、この手順を使用して、突然変異や環境要因から生じる変化やタンパク質合成を研究しています。それでは始めましょう。蔗糖。

グラデーションは、グラデーションが連続的になるように、使用の1日前に準備する必要があります。適切な量の7%および47%スクロースストック溶液を混合して、次の各スクロース濃度、7%17%27%37%および47%の各スクロース溶液に1モルDTTを追加し、最終濃度を1ミリモルにします。グラジエントを注ぐためには、20ミリリットルのシリンジにパスタピペットをパラフィルムで固定して密封します。

7ミリリットルの7%スクロースを1インチ×3.5インチのポリアーマー超遠心分離管の底に加えます。次に、パスタピペットの先端をチューブピペットの底近くにゆっくりと置き、7%溶液の下に7ミリリットルのスクロース溶液を追加します。各層を注ぐのに20秒以上かかるはずです。

勾配が退屈しているときに、27%37%と47%のショ糖溶液をそれぞれ7ミリリットルで繰り返します。レイヤー間の明確な線は、最小限の混合が発生していることを示しています。摂氏4度のすべての勾配を、サンプルの採取に使用するローター、ボトル、チューブとともに一晩保管します。

酵母細胞から抽出物を調製するには、まず25ミリリットルの酵母培養物を100個増殖させてOD 600を0.8対1にします。シクロハイデを最終濃度100マイクログラム/ミリリットルまで培養物に加え、摂氏30度で15分間振とう続けます。15分後、培養物を250ミリリットルの遠心分離瓶に注ぎ、氷で満たします。

この時点から先は、摂氏 4 度で 5 分間、重力 8 、 000 倍の遠心分離機ですべてを氷上に保ちます。Resusは、ペレットを10ミリリットルの氷に懸濁し、冷冷溶解し、緩衝液を15ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。5、900倍の重力で摂氏4度の3分間遠心分離します。

ペレットを0.5ミリリットルの溶解緩衝液に懸濁します。懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、次に0.5ミリリットルの冷やした焼き酸洗浄ガラスビーズを追加します。細胞を32回目のインターバルで4回ボルテックスし、各インターバルの間に30秒間氷上のチューブを呼び出します。

次に、さらに0.5ミリリットルの溶解緩衝液を1.5ミリリットルのチューブ遠心分離機に5, 000回加えます。摂氏4度で5分間重力。上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度で最高速度10分間遠心分離します。

最後に、すり酸を新しい1.5ミリリットルのマイクロセントリチューブに移します。抽出物はマイナス80°Cで保存して、ライセートをショ糖勾配に移すことができます。ピペットの先端をグラジエントの表面近くのチューブの壁に当て、グラジエントの上にライセートを穏やかに重ねます。

35ミリリットルのグラジエントの場合、通常、500マイクロリットルのライセートがロードされます。鉗子を使用して、スイングバケットローターのバケットに勾配を慎重に下げます。重力の100、000倍で勾配を4°Cで4時間遠心分離します。

4時間のスピン終了の約30分前。針をチューブピアサーに取り付け、ペンをオンライン吸光度蛍光モニターに取り付けます。吸光度モニターの電源をオンにして、サンプルを分析する前に安定したベースラインに到達できるようにします。

PolyZoneプロファイルの電子取得は、DI 1 48 Uデータ収集ユニットを取り付けることで、リアルタイムで簡単に取得できます。チャートレコーダーに、逆流ラピッド設定を使用して、シリンジポンプに50ミリリットルのフローリンナッツを入れます。気泡が存在しないことを確認してください。

シリンジからのホースをチューブピアサーに接続します。そして、毎分6ミリリットルで前方にFlo不活性の流れを短時間オンにします。ホースから気泡を取り除くには、フローセルの端にあるホースの下に一連のチューブを配置して、サンプルの流出を収集します。

ショ糖勾配を含む遠心分離管を保持するための予備形成ウェルを備えたアイスバケツを準備します。4時間の遠心分離が完了したら、遠心分離機のローターから遠心分離管を慎重に取り外し、氷の上に置きます。勾配を乱さないように注意してください。

細胞抽出物を解析するには、グラジエントチューブをチューブピアサーに置き、チューブの上部を出口に接続して固定します。下部ステージを遠心分離管まで上げて、針がチューブの底を突き刺すようにします。フローリンアラートの流れを毎分6ミリリットルで前進方向に開始します。

フルートがチューブに流れ始めたら、オンラインUV吸光度モニターで針の動きを監視します。針が動き始めたら、チャートの動きを速度設定60にオンにします。ポリリボソームプロファイルの終わりに達したら、遠心分離管へのFlo不活性の流れを止め、吸光度蛍光モニターでチャートの動きを停止します。.

Flo不活性を遠心分離管からシリンジに引き込むには、逆方向の流れを急速に開始し、チューブからシリンジにスクロースを引き込まないようにします。遠心分離管をチューブピアサーから緩め、針を下げてチューブを取り外します。ここには、シクロハイデの存在下で酵母から調製したリボソーム抽出物の代表的な痕跡が示されています。

ポリリボソームとA TS 60 sおよび40 sリボソームを含むUV吸光度ピークが示されています。この手順を実行するときにポリリボソーム分析を実行する方法を示しました。サンプルを冷たく保ち、RNAを含まないように、迅速に作業することを忘れないことが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。