Name: ソフト筋骨格組織から幹細胞を単離する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぼう、骨格筋などの軟部組織から成体幹細胞を単離する方法。生検、酵素処理、繰り返し前培養の工程により細胞を分離し、再生医療研究への応用可能性を示します。

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著者は、現在のフィルムとスライドの編集上の彼らの助けのための氏カイルホールデン氏とジョナサンルーカスのための細胞分離に与える技術的なヘルプのために氏鷹パンとイアンBellayrの大きく感謝しています。博士：過​​去数年にわたって修正されたpreplate技術の開発に関わってきた人の、以下の一覧に感謝。 Burhan Gharaibeh、宝洪曹、Deasyブリジット、トーマスR.ペイン、愛平陸、海融鵬、秀樹大島、ボー曽、暁東ムー、Kimimasa飛田、ロンJankowski、Makato池澤。我々は、James H.カミンズ、ライアンPruchnic、ジョセフFeduska、レベッカC. Schugar、海鷹パンとジェシカTebbetsからの技術支援に感謝しています。著者はまた、筋ジストロフィー協会（MDA）、国立衛生研究所（NIH）、国防総省（DOD）、UPMCのピッツバーグの小児病院、科からこの仕事のための財政支援に感謝整形外科、およびピッツバーグ大学。

一般的には、完全な修正preplateの手順は、準備の1〜2日、技術的な手順を実行するの1週間、免疫細胞と細胞の同定の2〜3日、および幹細胞集団の拡大のさらに2〜3週間を必要とします。幹細胞培養に必要な機器は、ベンチトップ遠心機、CO 2インキュベーター、層流の組織培養フードと蛍光とデジタルカメラを搭載した倒立顕微鏡を含む他の細胞培養システムのそれに似ています。分離された幹細胞は、クローニングすることができると、現在または将来の研究の1,2のための液体窒素中で長期的に保存することができます。この手順で使用されるすべての試薬および材料は滅菌と無菌的に処理する必要があります。 ステップ1：準備<ol><li>コラーゲンコートの組織培養ディッシュやフラスコ：子牛の皮（1リットルで0.1グラム、Sigma - Aldrich社）から派生したI型コラーゲン。コー​​トへのプラスチック容器は、次のとおりとして1,2の前に説明したT​​ - 25フラスコ、6または12ウェルプレート、皿を（60、100ミリメートル、BDファルコン）。ゆっくりと4時間のコラーゲンにもコーティングを確保するために、プラスチック容器を30分おきに振る。コラーゲン溶液は、その後削除されます。とコーティングされたプラスチック製品は、無菌性を確保するために、UV光とフードとの両方の組織培養フード内で乾燥させる、そして最終的にrecappedまたは後で使用するためにカバー。 </li><li> 、、50mLの熱不活性化ウシ胎児血清（FBS、インビトロジェン社）、50mLのウマ血清（HS、Invitrogen社）、及び5mLのニワトリ胚抽出物（CEE、正確な化学株式会社400ML DMEM（Invitrogen社DMEM、高グルコース）：細胞培養​​の培地を準備）使い捨て0.22μmの500mlの滅菌フィルターシステム（コーニング）を使用してフィルタ処理された真空になります。無菌ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（Invitrogen）を最終的に100単位/ mLを追加されます。調製された溶液は、少なくとも一ヶ月に4℃で保存することができます。このソリューションは、ときに文化を分割または移植用細胞を調製フラスコから細胞を剥離するために使用されます。 </li><li>細胞分離のためのソリューションをウォームアップ：下記の試薬を37にウォームアップする必要があります° C細胞分離のためのその使用前に：ハンクのバッファ塩溶液（HBSS、Invitrogen社）、0.2％（wt / vol）のコラゲナーゼタイプXI（シグマmLのHBSS 3,200コラーゲン消化単位の平均で- Aldrich社）、;ディスパーゼ2.4 units/1mL（Invitrogen社製）、0.5％（wt / vol）のトリプシン（インビトロジェン）。 </li><li>準備のために外科手術機器の滅菌：異なるサイズの鉗子、マイクロはさみ、アイリスはさみおよび/または外科用メス刃：手術の手順は、含む滅菌手術器具が必要です。また、15および50 mLのポリプロピレン遠心チューブ（BDファルコン）、セルストレーナー（孔径70メートル）（BDファルコン）、18 - 、23 - および27ゲージの針（BD PrecisionGlide）、及び10 - または20 - mlの滅菌シリンジ（BD）。 </li></ol>ステップ2：組織生検、単離および機械的解離1月4日 組織生検は無菌培養のボンネットの下に行われ、新鮮な収穫腱や骨格筋を含む、野生型マウスの後肢（女性C57BL/6J、4-5週齢または若い、ジャクソンの脛骨またはヒラメ筋から得られる研究所）。目に見える結合組織、血管、脂肪組織は、生検サンプルから削除されます。腱と筋肉の組織は、慎重に皮膚と骨の残骸を除去する外科解剖顕微鏡下で同定し、含有する冷（4℃）HBSS（FBSの5％を追加で補充）。を皿に置かれている分離された組織は、その後別々に冷HBSSを含むコラーゲンコートディッシュ上に配置されており、マイクロシザー構造および/ ​​またはメス刃を用いて粗いスラリーに（&lt;1x1のmm 3の ）ミンチされます。 ステップ3：組織の酵素消化： みじん切りの組織は、手順2,4,5の一連の後、酵素的に解離している<ol><li>別の15 mlチューブと4時〜3500rpmで遠心° Cで5分にミンチ組織のスラリーを転送する。 </li><li>上清を除去、HBSSで洗浄し、再度遠心操作を繰り返します。 </li><li>上清を除き、あらかじめ温めておいた0.2パーセントコラゲナーゼタイプXI（シグマ）10 mlを加えることによってこれらのスラリーを消化。継続的に穏やかにチューブを揺らしながら、37℃で60分間インキュベートする。また、手で10分ごとに振る。 </li><li> 10ミリリットルディスパーゼ（2.4単位/ mL、Gibco社）溶液中でこれらのスラリーを遠心し、懸濁します。手で振ったり、軽く10分ごとに揺らし、37℃で45分間インキュベートする。 </li><li>遠心分離し、これらのスラリーは、0.2％トリプシンHBSS溶液10mlに再懸濁する。インキュベーションは、単一の細胞を顕微鏡下でサスペンションを観察することによって実行できる組織から放出される範囲に基づいて変化します。それは、反転管で37℃で30分を超えないようにCを推奨したり、静かに10分ごとに揺動されていません。 </li><li>得られた細胞を遠心sと再サスペンド増殖培地（PM）の10mlに細胞ペレットを。 </li><li>針の一連の抽出液を渡すことによって、細胞懸濁液を取り除きます。細胞は、その後、18Gを通して23Gを2回通過し、最終的に27G針されています。 </li><li> 70μmのセルストレーナーを介して細胞抽出液を渡します。 </li></ol>ステップ4：細胞接着率1-3に基づいて異なる細胞集団を分離するPreplating <ol><li>遠心分離し増殖培地で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>コラーゲンコートT - 25フラスコ（または60 mmディッシュ）上にプレート細胞の混合物とPP1としてマークします。細胞懸濁液を顕微鏡で屈折原子核と他の破片の多数を所有していると観察する必要があります。 </li><li> 37℃で2時間加湿、5％CO 2インキュベーターでC。 </li><li> T - 25フラスコ（または60 mmディッシュ）とマークがPP2となる新しいコラーゲン被覆に非接着細胞を移す。 PP1というラベルの付いたプレートにPMを5mlを追加。フラスコに付着初期の付着した細胞は、主に筋線維芽細胞3です。 </li><li>別の24時間インキュベーターにフラスコを返す、新しいコラーゲンをコートしたT - 25フラスコ（または皿）とPP3としてそれをマークするために非接着細胞を移す。 PP2ラベルの付いたプレートに増殖培地5mlを追加。このフラスコに付着これらの接着した細胞は、主に線維芽細胞2,3です。 </li><li>インキュベーターにフラスコを返し、人口PP6が作成されるまで、別の24時間以内に手順を繰り返します。浮遊細胞の各グループを維持し、それらが増殖し、倒立顕微鏡を使用して定期的にそれらを検査することができます。 PP3 - PP4筋衛星細胞がしばしばPP5 2で主に見ている間にほとんどが筋芽細胞です。 </li><li>徐々に接着した細胞のほとんどは、通常、PP6で取り付けます。この段階で、細胞は小さく、円形、光屈折率を表示され、数は非常に疎であり、幹細胞集団の1,2と見なされます。 </li></ol>ステップ5：隔離された幹細胞の同定と拡大<ol><li>孤立PP6細胞の数が非常に少ないですし、毎日変更されるFBS豊富な増殖培地（DMEM 20％FBS）で維持する必要があります。細胞のほとんどは、培養の次の1-2週間の間にPP6文化のダイに存在しているが、大規模な、健康なPP6人口は、通常、拡張の追加の1-2週間後に作成されます。マウスから単離した幹細胞を高発現幹細胞抗原1（SCA1）、CD34、胎児肝キナーゼ1（Flk1）、および免疫細胞化学染色を介して可視化できる他の幹マーカー1,2,6,7。これらの幹細胞はまた、複数の分化能力3,6,8を示 ​​す。 </li><li>単離された細胞は、分化の1,2を避けるために、培養中の低細胞密度（50〜100細胞/ウェルまたはフラスコやディッシュの&lt;20-30％コンフルエントで12ウェルディッシュ）に維持して展開されます。非常に少数の細胞が膨張中にクローンを形成し、これらのクローンES細胞は、他の能力の研究のための長い時間の増殖（LTP）を受けることができる。クローンES細胞はまた、10％DMSOとPMの培地を、例えば一般的な細胞の保管手順を使用して液体窒素中で保管す​​ることができます。他のバックアップ研究のための幹細胞の低継代株の数を作る。 </li></ol>

<ol><li>Gharaibeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu-Petersen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+population+of+muscle+stem+cells+in+mice%3A+potential+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.</a> J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).</li>
<li>Li, Y. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+muscle-derived+cells+into+myofibroblasts+in+injured+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle.</a> Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).</li>
<li>Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &amp, Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+donor+muscle+precursor+cells+into+an+area+of+muscle+regeneration+in+the+host+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse.</a> J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).</li>
<li>Lu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+progenitor+populations+from+Pax7-deficient+skeletal+muscle+based+on+adhesion+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics.</a> Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+muscle-derived+cells+capable+of+enhancing+muscle+regeneration+and+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing.</a> J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptors+in+the+maturation-dependent+adenoviral+transduction+of+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers.</a> Gene Ther. 8, 627-637 (2001).</li>
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<li>Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+based+on+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine based on muscle stem cells.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).</li>
<li>Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+for+the+musculoskeletal+system+based+on+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells.</a> J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

それはいくつかの成人組織では、複数の幹細胞が含まれていることが認識されている。研究の過去数年間、幹細胞は骨格筋と腱を含む柔らかい筋骨格系組織で検出されている。成功した腱や骨格筋から成体幹細胞を分離するために我々の研究室で使用されている修正preplateのテクニックとして知られているこの現在のプロトコルは、詳細手順を、。細胞上記の変更preplateのテクニックを使用することをコラーゲンコートしたフラスコ（図1）への接着特性に基づいていくつかの集団に分けることができます。組織内に存在する線維芽細胞および筋線維芽細胞はすぐに24時間から48時間以内にコラーゲンコートしたフラスコに付着し、最初はPP1 - PP2で他の細胞から分離されています。筋原性または内皮細胞は、48〜96時間内でより長い期間、（PP3 - PP5）の後にコラーゲンコートしたフラスコに付着し、収穫し、それらの細胞表面マーカーによって識別することができます。後でpreplated細胞、96時間以降（PP6）は、成体幹細胞（図2）とみなされます。後半preplate細胞は、小さな丸い、およびそれらの分離の初めに半透明表示され、さらに幹細胞の抗原1（SCA1）、CD34、胎児...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11995-073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化馬血清</td><td>Invitrogen</td><td>#26050-088</td><td></td></tr><tr><td>ニワトリ胚抽出液</td><td>Accurate Chemical</td><td>#CE650T-10</td><td></td></tr><tr><td>100U ml ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Invitrogen</td><td>#14190-250</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液</td><td>Invitrogen</td><td>#24020-117</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ type XI 0.2%(wt/vol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C7657</td><td></td></tr><tr><td>Dispase 2.4U ml</td><td>Invitrogen</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.5%(wt/vol) (10x; 5g liter トリプシン (1:250)</td><td>Invitrogen</td><td>#15400-054</td><td></td></tr><tr><td>フラスココーティング用コラーゲン：子牛皮膚由来 Type I コラーゲン 0.1 g liter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C-9791</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>#D-2650</td><td></td></tr></tbody></table>

ソフト筋骨格組織から幹細胞を単離する

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

成体幹細胞は、長い再生医療への応用に関して議論されている。成体幹細胞は、多系統の細胞の分化と自己複製能を受けることにより、その印象的な機能に負傷し、病変組織を治療するための興奮を大いに生成している。最も重要なことは、これらの資質は、自家細胞移植療法での使用に有利にしている。現在のプロトコルは、1である筋骨格系の軟部組織、例えば、腱や筋肉、修正されたpreplateのテクニックを読者に紹介する<sup&gt; ST</sup&gt;酵素的に解離し、培地でコラーゲンコーティングしたフラスコ内に配置。培地と、残りの浮遊細胞で構成されている上清を、順次新しいフラスコに毎日転送されます。幹細胞は通常、（シリアル転送またはpreplates）5-7日間かかるているフラスコに付着する最も遅いです。このテクニックを使用することにより、これらの組織中に存在する成体幹細胞は、簡単にかなりの非侵襲的な手続きを経て収穫することができる。

フラスコに細胞の付着の速度に基づいて、筋骨格系の軟部組織から成体幹細胞を単離する。

成体幹細胞は、再生医療への応用に関して長らく議論されてきました。成体幹細胞は多くの...

この手順の全体的な目的は、骨格筋などの筋骨格系軟組織から成人幹細胞を単離することです。まず、軟組織の生検を行い、デブリードマンを施して細かく刻むことでこれを達成します。次に、組織を酵素的に消化します。手順の第3ステップは、プリプレーティング工程を繰り返すことで幹細胞を単離することです。手順の最終ステップは、単離した幹細胞の同定です。最終的に、免疫蛍光染色、顕微鏡観察、および/またはフローサイトメトリーを用いて、細胞の形態学的および細胞学的挙動を示す結果を得ることができます。こんにちは。ピッツバーグ大学整形外科、分子病理学研究室のy Leeです。本日は、骨格筋などの musculoskeletal system の軟組織から成体幹細胞を単離する方法を解説します。こんにちは、Johnny Ward博士です。私はピッツバーグ大学医学部整形外科の教授です。これまでYoung Lee博士と密接に協力し、骨格筋や、標準的な組織などの異なる種類の幹細胞を単離する手順に取り組んできました。私たちの研究室では、主にトランスレーショナルリサーチへの応用を目的とした研究のために、これらの手順を用いて幹細胞を単離しています。それでは、研究に取り組みましょう。幹細胞を単離可能な組織として、野生型マウスの後肢の脛骨またはヒラメ筋から採取した腱および骨格筋を用います。皮膚と骨の残渣を取り除いた後、組織を5% FBSを添加した冷たいHBSSを含むディッシュに入れます。次に、組織を冷えたHBSSを含むコラーゲンコートディッシュにそれぞれ配置します。ここでは、組織の解離および消化の基本手順を説明するために、骨格筋組織を使用します。マイクロシザースまたはメスを用いて、骨格筋組織を粗いスラリー状に刻み、組織の酵素消化を行います。まず、MIT組織スラリーを個別の15 mLチューブに移し、4°C、約3,500 RPMで5分間遠心分離します。HBSSで再懸濁してSANE洗浄液を除去し、遠心分離を繰り返します。上清を除去した後、あらかじめ温めておいた0.2% collagenaseを10 mL加えてスラリーを消化します。タイプ11を37°Cで60分間インキュベートし、その間10分ごとにチューブを手で振盪します。60分間のインキュベーション終了後、遠心分離を行い、スラリーを10 mLのDYS space solutionに再懸濁します。37°Cで45分間インキュベートし、その間10分ごとに手で振盪します。45分間のインキュベーション後、遠心分離を行い、スラリーを10 mLの0.2% trips in HBSS solutionに再懸濁します。通常、チューブを10分ごとに転倒混和しながら、37 °Cで15〜20分間インキュベートし、インキュベーションを完了させます。ここに示すように、組織から十分な数の単一細胞

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生物学

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