ソフト筋骨格組織から幹細胞を単離する
2010年7月5日
フラスコに細胞の付着の速度に基づいて、筋骨格系の軟部組織から成体幹細胞を単離する。
この手順の全体的な目標は、骨格筋などの筋骨格系軟組織から成体幹細胞を分離することです。これは、最初に軟部組織の生検を行い、それをデブライドし、細かく刻むことによって達成されます。手順の2番目のステップは、組織を酵素的に消化することです。
手順の3番目のステップは、プレプレーティングステップを繰り返して幹細胞を分離することです。手順の最後のステップは、単離された幹細胞の同定です。最終的には、免疫蛍光法、顕微鏡法、またはフローサイトメトリーを使用して、細胞の形態学的および細胞の挙動を示す結果を得ることができます。
こんにちは、ピッツバーグ大学整形外科の分子病理学研究室のy Leeです。今日は、骨格筋などのMus骨格系の軟組織から成体幹細胞を分離する方法を紹介します。こんにちは、Dr.Johnny Wardです。
私はピッツバーグ大学医学部整形外科の教授です。私は、ヤング・リー博士と密接に協力し、骨格筋から異なる種類の幹細胞を絶縁し、標準的な組織などの組織を変化させるためのこの手順に取り組んできました。私たちの研究室では、基本的にトランスレーショナルメディシンの応用に関する調査研究のために、幹細胞を単離する手順を使用しています。
では、勉強しましょう。幹細胞を単離できる組織には、野生型マウスの後肢の脛骨またはヒラメ筋から採取した腱と骨格筋を含めるとします。皮膚と骨の残りを取り除いた後、5%FBSを添加した冷たいHBSSが入った皿にティッシュを置きます。
次に、冷たいHBSSを含むコラーゲンコーティングされた皿にティッシュを別々に置きます。骨格筋組織を使用して、組織の解離と消化の基本的な手順を示します。マイクロハサミやメスの刃を使用して、骨格組織を細かく刻み、組織の粗いスラリーpH酵素消化にします。
MIT組織スラリーを遠心分離機で4°C、摂氏4度で5分間、別々の15ミリリットルチューブに移すことから始めます。ResusがHBSSを懸濁してSANE洗浄液を取り出し、遠心分離を繰り返します。スーパーネイトを除去した後、10ミリリットルのプレウォーム.0.2%コラゲナーゼを加えてスラリーを消化します。
タイプ11は摂氏37度で60分間インキュベートし、60分のインキュベーションが完了したら10分ごとにチューブを手で振とうします。遠心分離機にかけ、スラリーを10ミリリットルのDYSスペース溶液に再懸濁します。摂氏37度で45分間インキュベートし、45分間のインキュベーション遠心分離機の後、10分ごとに手で振とうし、HBSS溶液中の0.2%トリップの10ミリリットルでスラリーを懸濁します。
通常、摂氏37度で15〜20分間インキュベートし、10分ごとにチューブを反転させながらインキュベーションを完了する。ここに示すように、組織から十分な単一細胞が放出されたら、得られた細胞を遠心分離し、細胞ペレットを5ミリリットルの増殖で懸濁します。Medium PMは、抽出物を18ゲージの針に2回、次に23ゲージの針に1回、最後に27ゲージの針に1回、一連の針に通すことにより、細胞懸濁液を解離します。
最後に、細胞抽出物を70ミクロンの細胞ストレーナーに通して、prepl技術を開始します。調製したばかりの細胞抽出物を遠心分離し、増殖中のペレットを再懸濁します。コラーゲンでコーティングされたT25フラスコに5ミリリットルの細胞混合物を中皿に盛り付け、加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で2時間インキュベートしたPP1として販売しました。
2時間後。非接着性細胞を新しいコラーゲンコーティングされたT25フラスコに移し、PP2として販売します。PPとラベル付けされた前のT 25フラスコに5ミリリットルのPMを追加します。
両方のフラスコをインキュベーターに24時間戻します。24時間後、非接着性細胞をPP 2から新しいコラーゲンENCコーティングT25フラスコに移し、PP3としてマークします。5ミリリットルの増殖培地をPP 2とラベル付けしたフラスコに加えます。
フラスコをインキュベーターに戻します。人口PPが6になるまで、24時間ごとに手順を繰り返します。幹細胞集団が作成されます。
単離されたPP6細胞は数が非常に少なく、FBSに富む増殖培地で維持する必要があります。しかし、それは日々変化しています。PP 6培養液中の細胞の大部分は、その後の1〜2週間の培養で死滅しますが。
大規模な健康なPP6の人口は、通常、さらに1〜2週間の拡張後に作成されます。浮遊細胞の他のすべてのグループも維持し、増殖させ、倒立顕微鏡を使用して定期的に検査できるようにします。PP OneフラスコとPP 2フラスコに付着する初期接着細胞は、ほとんどが線維性細胞です。
コラーゲンでコーティングされたフラスコに付着する細胞は、48〜96時間以内の長い時間後に付着します。PP3とPP4はほとんどが筋芽細胞です。筋サテライト細胞は主にPP 5によく見られますが、96時間後のPP 6後のprepl細胞は成体幹細胞と見なされ、小さく、丸く、半透明に見えます。
単離の開始時には、幹細胞、抗原1、CDC 34などの幹細胞マーカーの発現について、免疫組織化学によってさらに特徴付けることができます。マウスの2番目の塊から幹細胞を分離する方法を示しました。この手順を行うときは、すべての手順でステロイドを維持することを覚えておくことが重要です。
幹細胞を単離したら、その細胞を低密度で培養し、幹細胞の特性を維持してください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの経験に幸運を祈りますそして、これをあなたの実験に使用してみて頑張ってください。
ありがとうございます。
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概要
この記事では、筋骨格系の軟組織、特に骨格筋から成体幹細胞を分離する手順を概説します。このプロセスには、生検、酵素消化、および幹細胞の成功的な分離を達成するための繰り返しの事前プレーティングなど、いくつかのステップが含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 幹細胞生物学
- 筋骨格組織研究
- 細胞分離技術
背景
- 成体幹細胞は再生医療に大きな可能性を秘めています。
- 筋骨格系の軟組織は、これらの幹細胞の豊富な供給源です。
- 分離技術は幹細胞の特性を研究するために重要です。
- 細胞挙動の理解は治療応用に役立ちます。
研究の目的
- 成体幹細胞を分離するための信頼できる方法を開発すること。
- 幹細胞の特性の理解を深めること。
- 再生医療のさらなる研究を促進すること。
使用された方法
- 骨格筋組織の生検。
- 組織のデブリードマンと細かい刻み。
- 幹細胞を放出するための酵素消化。
- 細胞分離のための繰り返しの事前プレーティング手順。
主要な結果
- 筋骨格組織からの成体幹細胞の成功的な分離。
- 免疫蛍光を用いた分離細胞の特徴付け。
- 顕微鏡およびフローサイトメトリーによる細胞挙動の分析。
- 結果は研究におけるさらなる応用の可能性を示しています。
結論
- 記述された方法は成体幹細胞の分離に効果的です。
- 分離された細胞は様々な科学的調査に使用できます。
- さらなる研究は再生医療の進歩につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating adult stem cells from musculoskeletal soft tissues enables early-stage target validation in regenerative medicine by providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking. This protocol supports predictive confidence in stem cell-based therapies through reproducible isolation of multipotent cells. The method facilitates translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating scalable, autologous cell sources.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell multipotency and self-renewal for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate stem cells from tendon and muscle tissues.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by confirming stem cell identity via marker expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified stem cell populations for compound screening in differentiation assays.
- Operational Value: Yields reproducible adherent and non-adherent fractions for assay standardization.
- Scientific Value: Enables quantitative readouts via flow cytometry and immunofluorescence for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Produces disease-relevant stem cells for preclinical modeling of musculoskeletal repair.
- Operational Value: Supports expansion of PP6 cells for longitudinal preclinical studies.
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment through characterization of stem cell antigen expression.
Pipeline & Workflow Integration
The preplating technique integrates into the discovery workflow by enabling stem cell isolation prior to functional validation and screening applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stem cell function in tissue regeneration pathways.
- Screening: Delivers standardized stem cell preparations for compound library screening.
- Analytics: Provides qualitative and quantitative outputs for assessing stem cell purity and behavior.
- Translational Research: Connects isolation to preclinical continuity through expandable PP6 populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for multiple musculoskeletal tissue sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell therapeutics by reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility through serial preplating and collagen-coated flask standardization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of stem cell quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic digestion, and sterile cell culture techniques.
- Depends on collagen-coated flasks, centrifugation equipment, and inverted microscopes for monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of preplating timing and medium formulations.
- Involves adaptation considerations for different soft tissue sources such as tendon versus muscle.
- Limited by low stem cell yield and requirement for extended culture to obtain sufficient PP6 populations.
