Name: 組織サンプルのγH2AX病巣の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶγH2AX免疫蛍光法によるマウス組織のDNA二重鎖切断検出と定量。放射線応答や疾患モデルでのDNA損傷評価に適した高感度プロトコルを解説します。

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オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。 MMTは、国立衛生研究所から博士オルガSedelnikovaから専門家の援助とアドバイスに感謝しています。

組織<ol><li>最適な切削温度（OCT）コンパウンド4583で金型に組み込まれた肺組織は、、CMライカ1950クライオスタットを用いて、ポリ- L -リジンスライド上にマウントされている（5μm）を切片であった。 </li></ol>凍結サンプルは、マードック児童研究所で博士サイモンロールスロイスから得られた。肺組織は、未処理のBalb / cマウス由来とヒトの喘息6の病理学的特徴の多くを示す慢性アレルギー性気道疾患のマウスモデルから得られた。動物実験は科学的な目的のために実験動物の管理と利用の実践のためのオーストラリアのコードに準拠しているマードック児童研究所の動物倫理委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。 <ol start="2"><li>セクションは、1時間室温で風乾させた。 </li></ol>免疫蛍光染色<ol><li>セクションは、2％（w / v）のリン酸のパラホルムアルデヒドで20分間緩衝生理食塩水（PBS）で固定した。 </li><li>のセクションでは、15分ごとにPBSで2回洗浄と平衡化した。 </li><li>セクションは10分ごとに、PBSで3回洗浄した20分間70％エタノール（-20℃に冷却）で処理した。 </li></ol>この時点で、スライドは最大2週間まで4℃で密閉容器で保存することができる。 <ol start="4"><li>セクションは10分ごとに、PBSで3回洗浄し、次いで新鮮PBS含む0.5％のTween - 20及び0.1％トリトンX - 100室温で1時間（PBS - TT）の8％BSAを含むPBSで調製された100μLでブロックされた。 すべてのインキュベーションは加湿染色トラフで実施した。 </li><li>セクションは、5分間PBS - TTで洗浄し、疎水性の境界は、パパニコロウペンを持つ組織の周囲にマークされました。 </li><li>過剰なバッファがオフチップを渡したされ、一次ウサギポリクローナル抗γH2AX抗体（PBS中の1％BSAで、1:500に希釈し、ミリポア）100μlのは、室温で2時間のインキュベーションのために各セクションに追加されました。 一次抗体とのインキュベーションを4℃で一晩実施されることがあります さらなる証拠を、γH2AX病巣がDSBのを表していること、DSBの修復のタンパク質を認識する一次抗体を使用してもよい。例えば、γH2AXとリン酸化ATMの共局在は、一般的に使用される組み合わせです。 </li><li>暗所で室温で1時間、セクションが各5分間PBS - TTで2回洗浄し、二次抗体液100μl（Invitrogen社のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgGを1％BSAで、1:500に希釈）とともにインキュベートした。 （希釈した抗体は、プロシージャ全体で暗所で保管された）。 </li><li>セクションは、各5分間PBS - TTで3回洗浄し、37℃で30分のため0.5mg/mL RNアーゼA℃でインキュベートした。 </li><li>対比と取り付けの核はヨウ化プロピジウムを含むVectashieldの培地で行った。 </li><li>スライドはマニキュアで密封し、℃の暗所での分析の前に4℃で一晩保存した。 </li></ol>顕微鏡/分析<ol><li> （ - のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgGγH2AXのため）とPI（543 nm）のレーザーツァイスLSM510のメタ共焦点顕微鏡は、標準的なGFPを使用して画像を取得するために使用されていました。 </li></ol>画像は、0.5μmのステップサイズとZシリーズのパターンで獲得されました。分析中に、個々の面は、デコンボリューションと巣の重複を最小限に抑えるために最大限の投影画像を生成するために積層した。 前の粒子数の最大値投影画像を作成する方法は、薄切片（例えば、5μm以下）を使用し、バックグラウンド染色はわずかですどこにされる状況でのみ使用する必要があります。ここで、重要なバックグラウンドを持つ厚いセクションがBolteとCordelieresで説明されているように、このような3Dオブジェクトカウンタなど、より複雑な分析を分析する必要があります（2006年）7を使用する必要があります。 <ol start="2"><li> Metamorph（Molecular Devices社、米国）は、病巣の数を定量するためにマージ（赤と緑）の画像を作成するために使用されました。 </li></ol> Metamorphが巣の数を定量化するために使用できますが、組織切片を使用して、通常、時病巣は、より高い精度のために（目で）手動でカウントされます。 興味の特定の細胞型は、インスタンスの肺上皮細胞のために、定量用に選択することができます。これは、組織学上及びヘマトキシリン​​及びエオシン染色連続切片への参照を持つ基づいて行われることがあります。

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このデモンストレーションの目的のために我々は、未処理のBalb / cマウスからと慢性アレルギー性​​気道疾患のマウスモデルからマウスの肺組織を使用する。我々は、未処理のセクションに比べて損傷した肺で観察されたわずかに高い平均で細胞あたりの巣の数の違いを定量。特に、定量はそれぞれ、未処理組織と慢性アレルギー性​​気道疾患の組織で、/セルあたり6.5巣および/セルあたり9.4巣（セクションあたり20細胞の手動カウント）を示した。しかし、DSB誘発剤の使用は、マウスの肺モデルにおいてDSBのを誘導することが知られている例のナフタレン、のために、より高い病巣の番号を生み出しています。確かに、このプロトコルは、ほとんどの組織での電離放射線の影響の調査に適しています;γH2AX巣数と解像度の点でより顕著な結果は、電離放射線が使用されているときに得られる。これはよくX線への暴露は、急速にγH2AX巣の形と病巣の番号は30〜60分2との間で最大に達することが知られている。したがって、1時間の時点（照射後）は、初期のDSBの形成とDNA修復を監視するために使用することができる長い時間（通常は最大48時間）の評価に最適です。 </p...

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>非特異的な抗体結合をブロックするために、BSA (1%) を使用します。一次抗体および二次抗体はBSAで希釈します。</td></tr><tr><td>PBS（Ca不含）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; およびMg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>OCT（最適凍結切片用）コンパウンド 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>ポリリシンコートスライド</td><td>メンゼル-グレーザー</td><td>SF41296SP</td><td>凍結組織切片を静電的に吸引し、追加のコーティング剤や接着剤の必要性を低減します。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>試薬</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (0.5%)は、細胞を透過させるための界面活性剤である。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>細胞を透過させるため、Triton X-100 (0.1%) を使用した。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化-&amp;#947;H2AX（ウサギポリクローナル抗体）</td><td>一次抗体</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>一次抗体の希釈（1:500）、1% BSA中。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>二次抗体の希釈（1:500）、1% BSA含有溶液にて。</td></tr><tr><td>エタノール (70%)</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>試薬</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield PI</td><td>試薬</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>プロピジウムヨード（赤色核染色剤）を含むグリセロールベースの封入剤。この封入剤は、屈折率が一致するオイル浸漬レンズと共に使用する必要がある。&lt;br/&gt;&lt;組織
OCT（最適切断温度）化合物 4583のモールドに包埋した肺組織を、CM Leica 1950クライオスタットを用いて切断（5 μm）し、ポリL-リシン処理スライドに貼付した。凍結サンプルは、Murdoch Children's Research InstituteのSimon Royce博士より提供を受けた。肺組織は、未処理のBalb/cマウス、およびヒト喘息の多くの病理学的特徴を示す慢性アレルギー性気道疾患マウスモデルから採取した。動物実験は、科学的目的のための実験動物のケアおよび使用に関するオーストラリア行動規範を遵守するMurdoch Children's Research Instituteの動物倫理委員会のガイドラインおよび規定に従って実施した。切片を室温で1時間自然乾燥させた。

免疫蛍光染色
切片を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の2% (w/v) パラホルムアルデヒドで20分間固定した。PBSで15分間の洗浄を2回行い、切片を平衡化した。切片を-20°Cに冷却した70%エタノールで20分間処理し、続いてPBSで10分間の洗浄を3回行った。この時点で、スライドを密封容器に入れ、4°Cで最大2週間保存することが可能である。切片をPBSで10分間の洗浄を3回行い、その後、0.5% Tween-20および0.1% Triton X-100を含むPBS（PBS-TT）に調製した8% BSAを含むPBS 100μLを用いて、室温で1時間ブロッキングした。すべてのインキュベーションは、加湿された染色槽内で行った。切片をPBS-TTで5分間洗浄し、Pap penを用いて組織の周囲に疎水性の外周をマークした。過剰なバッファーを捨て、一次抗体であるウサギ抗γH2AXポリクローナル抗体（1% BSA含有PBSで1:500に希釈；Millipore）100μLを各切片に加え、室温で2時間インキュベートした。一次抗体によるインキュベーションは、4°Cで一晩行うことも可能である。γH2AXフォーカスが二本鎖切断（DSB）であることをさらに証明するために、DSB修復タンパク質を認識する一次抗体を使用してもよい。例えば、γH2AXとリン酸化ATMの共局在化は一般的に用いられる組み合わせである。切片をPBS-TTで5分間の洗浄を2回行い、二次抗体（Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGを1% BSAで1:500に希釈；Invitrogen）100μLとともに、室温・暗所にて1時間インキュベートした（希釈した抗体は、手順全体を通して暗所で保管した）。切片をPBS-TTで5分間の洗浄を3回行い、0.5mg/mL RNAse Aで37°C、30分間インキュベートした。核の対比染色および封入は、プロピジウムヨードを含むVectashield mediumを用いて行った。スライドをマニキュアで密封し、解析前に4°Cの暗所で一晩保存した。

顕微鏡観察／解析
Zeiss LSM510 Meta共焦点顕微鏡を用い、標準的なGFP（γH2AX - Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG用）およびPI（543 nm）レーザーを用いて画像を取得した。画像は、ステップサイズ0.5 μmのZシリーズパターンで取得した。解析では、個々の平面をデコンボリューションしてスタックし、フォーカスの重なりを最小限に抑えるために最大投影画像（maximum projected image）を作成した。粒子カウント前に最大投影画像を作成する方法は、薄い切片（例：5μm）を使用し、かつ背景染色の影響が無視できる場合にのみ使用すべきである。背景が顕著な厚い切片を解析する必要がある場合は、BolteおよびCordelieres（2006）によって記述されている3D Object Counterなどのより複雑な解析法を用いるべきである。フォーカス数の定量化のためのマージ画像（赤および緑）の作成には、Metamorph (Molecular Devices, USA) を使用した。Metamorphを用いてフォーカス数を定量化できるが、通常、組織切片を用いる場合は、より高い精度を得るために目視でフォーカス数をカウントする。肺上皮細胞など、目的とする特定の細胞型を選択して定量化することも可能である。これは、組織学的特徴に基づき、ヘマトキシリン・エオジン染色した連続切片を参照して行うことができる。&gt;注：一般的に使用されるDNA染色剤：4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド（DAPI）。適切な励起レーザーを備えた顕微鏡でのみ使用可能。</td></tr><tr><td>ミニPAPペン</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス (22x50mm)</td><td></td><td>メンゼル・グレイザー</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>コプリンジャー、ガラス製</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>染色槽</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta 共焦点顕微鏡</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM Leica 1950クライオスタット</td><td></td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>画像解析用ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

組織サンプルのγh2ax病巣の定量

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA二本鎖切断（DSB）は、内因性（生理学的または病理学的）プロセスによって、または外因性の因子、特に電離放射線と放射線作用の化合物のいずれかによって発生する可能性、特に致命的と遺伝毒性病変、です。セリン- 139残基が、高度に保存されたC末端SQEYのモチーフで、γH2AXを形成し、DNA二本鎖切断に早い応答であるにH2Aヒストンバリアント、H2AXのリン酸化<sup&gt; 1</sup&gt;。このリン酸化のイベントは、ホスファチジル - inosito 3 - キナーゼ（PI3K）タンパク質のファミリー、毛細血管拡張性運動失調変異（ATM）、DNA -プロテインキナーゼ触媒サブユニットとATMとRAD3関連によって媒介される（ATR）<sup&gt; 2</sup&gt;。全体的に、離散的な核γH2AX巣の形成におけるDSBの誘導の結果は容易に検出し、免疫蛍光顕微鏡法で定量することができる<sup&gt; 2</sup&gt;。このマーカーのユニークな特異性と感度を考えると、γH2AX巣の分析は、特に、放射線生物学、核医学では、生物医学研究の幅広い用途につながっている。 γH2AX病巣の定量は、最も広く電離放射線誘発DSBがコンテキスト内で細胞培養系で検討されている。離れて細胞放射線感受性から、免疫蛍光ベースのアッセイはまた、放射線改質化合物の有効性を評価するために使用されています。さらに、γH2AXは様々なDSBを誘発する化合物の有効性を検討するための分子マーカーとして使用されており、最近では老化や病気の重要なマーカー、特にがんとして歓迎されている<sup&gt; 3</sup&gt;。さらに、免疫蛍光ベースの方法はγH2AX巣の検出および定量に合うように適応されている<em&gt;生体外で</em&gt;と<em&gt; in vivoで</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;。ここで、我々はマウス組織におけるγH2AX巣の検出および定量するための典型的な蛍光抗体法を示しています。

γH2AX巣に基づいてDNA二本鎖切断の定量は、組織の放射線感受性と放射線修正する化合物の作用の評価に、特に放射線の生物学では、非常に貴重なツールとなっています。ここでは、組織サンプルにおけるγH2AX病巣の定量のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

DNA二本鎖切断（DSB）は、特に致死的な遺伝毒性病変であり、内因性（生理的または病理的）の要因、あるいは……によって生じる可能性があります。

こんにちは。エピゲノム医学およびヒトエピジェネティクス研究室のミシェル・タンです。当研究室は、ベイカーIDI心臓糖尿病研究所の准教授であるTom Carianne博士によって率いられています。本日は、疾患組織におけるDNA損傷量を測定するための、in vivoでのγ-H2AX免疫蛍光アッセイについて実演します。H2AXはヒストンバリアントであり、全ヒストンH2Aの約2～10%を占め、哺乳類細胞においてser139が迅速にリン酸化されます。DNA損傷に応答してリン酸化されたH2AXはγ-H2AXとしても知られており、二本鎖切断の数とγ-H2AXの間には直接的な相関があることが確立されています。γ-H2AXは感度の高い分子マーカーであり、二本鎖切断の早期指標となることが示されています。したがって、これはDNA損傷を検出するための有用な手法です。Gamma H2AXは、蛍光顕微鏡下でDNA損傷部位における核内フォーカスとして可視化できます。本実験では、Murdoch Children's Research InstituteのSimon Royce博士より提供されたマウス肺組織を使用します。気道過敏症、気道リモデリング、気道炎症など、ヒト喘息の多くの病理学的特徴を示す慢性アレルギー性気道疾患のマウスモデルを用い、肺組織におけるDNA損傷を調査します。それでは、実験を開始しましょう。まず、サンプルをクライオスタットに約 20 分間入れることで、-20 °C まで冷却します。最適な切削温度を維持し、組織切片がスライドから剥がれないようにするため、顕微鏡スライドを使用します。免疫蛍光染色の際、OCTを用いてサンプルをチャックに固定し、チャックを切断ブロックに設置して、しっかりと固定されていることを確認します。クライオスタットを5 µmの組織切片を切り出すように設定し、絵筆でサンプルを手前に引きながら慎重に切削を開始します。切片の上に顕微鏡スライドを配置し、切片がガラス表面に付着するようにします。次へ進む前に、すべての水分が除去されるよう、室温で1時間切片を乾燥させてください。まず、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで調製した2%パラアルデヒドを用い、組織切片を20分間固定します。余分なパラアルデヒドを捨て、スライドをコパランドジャーに入れ、PBSで15分間の洗浄を2回行い、透過処理を行います。透過処理の後、細胞膜サンプルを-20°Cの70%エタノールで20分間処理します。その後、サンプルをPBSで10分間ずつ3回洗浄します。組織切片の乾燥を防ぐため、各部位を個別に除去します。スライド上の余分なPBSを取り除き、0.5%のTriton X 100を含むPBS（P-B-S-T-Tとしても知られる）に8%BSAを溶解した溶液で切片をブロッキングします。これらのスライドを室温で1時間インキュベートした後、サンプルをP-B-S-T-Tで5分間洗浄します。抗体の核内への浸透を促進するために、PBS TTを使用します。その後、スライドを軽く拭き取り、乾燥させて過剰なP-B-S-T-Tを除去します。使用する試薬の量を抑えるため、パップペンを用いて切片の周囲に円を描きます。一次抗体には、anti phospho gamma H tox ラピッドポリクローナル抗体を使用した。これを1%BSA含有P-B-S-T-Tで500倍に希釈して調製した。これらの切片を加湿チャンバーに入れ、室温で2時間インキュベートした。過剰な一次抗体を取り除くため、P-B-S-T-Tで5分間の洗浄を2回行う前に、一次抗体を傾けて除いてください。スライドを取り出し、余分なP-B-S-T-Tを吸い取ります。floor 4 88 goat anti Reid IJJ抗体を使用しました。P-B-S-T-T中の1%BSAで調製した500倍希釈の二次抗体をサンプルに添加した。その後、切片を加湿チャンバー内で1時間インキュベートし、二次抗体を吸い取ってから、過剰な二次抗体を除去するためにN-P-B-S-T-Tで5分間の洗浄を3回行った。各洗浄ステップの間、光への曝露を防ぐため、Copelandジャーをアルミホイルで覆います。スライドを取り出し、余分なP-B-S-T-Tを吸い取ります。細胞質染色の抑制には、PBSに溶解した0.5 mg/mLのRNase Aを添加しました。その後、サンプルを37°C、5% CO2条件下で30分間インキュベートします。インキュベーション後、RNA Aを吸い出し、切片の乾燥を防ぐためにPBSTで短時間洗浄します。封入剤を加えるまで、サンプルはアルミホイルで包んだまま保持してください。スライドを1枚ずつ取り出し、余分なP-B-S-T-Tを吸い取ります。各切片の上に、赤色核染色剤であるプロピジウムヨードを含むVector Shield封入剤を滴下します。次に、気泡が入らないように注意しながらカバーガラスをゆっくりと被せ、余分なVector Shieldを吸水紙で吸い取ります。次に、サンプルが乾燥するのを防ぎ密閉するために、カバーガラスの端を研磨します。最後に、顕微鏡観察が必要になるまで、サンプルを4 °Cの暗所で保存します。デジタル画像の取得には、63倍のオイル浸漬対物レンズを備えたZEISS LSM 510 Meta共焦点顕微鏡を使用し、レーザー光源としてAlexa Fluor 488には波長488 nmのアルゴンレーザーを、プロピジウムヨード（PI）染色には543 nmのヘリウムネオンレーザーを使用しました。各視野は、ステップサイズ 0.5 µm、ズーム 1 回の 8 ～ 15 枚の光学 Z シリーズスライスで構成されました。画像は個別の TIF ファイルとして書き出し、metamorph Images を用いて解析しました。ZEISS LSM 510 メタフォーカル顕微鏡で取得した画像は、画像解析および一次的な目視計数のために metamorph プログラムで開かれました。Z シリーズとして取得した蛍光画像は、デコンボリューション処理を施した後、最大強度投影フィルタを用いてスタックし、2D 画像を作成しました。これは、強度の低いフォーカスの消失を最小限に抑えるために行われました。最大投影画像は二値画像に変換され、背景を低減させ、フォーカス検出の感度を向上させるために、トップハットなどの形態学的フィルタが適用されます。対応するプロピジウムヨード画像が読み込まれ、核領域が特定されます。核の周囲に手動で領域を描画し、1視野あたりのフォーカス数をカウントすることで、これらの領域を強調します。これらの領域をトップハット画像に転送し、ライトしきい値フィルターを適用します。しきい値は、フォーカスとの整合性を保ち、かつ各視野内で背景が含まれないように、視覚的な比較によって慎重に選択しました。病巣のカウントには、IMAの統合形態解析（Integrated morpho analysis）を用いました。あるいは、結果の信頼性を確保するために手動でカウントを行うことも可能です。以上で、疾患組織におけるDNA損傷量を測定するためのin vivo免疫蛍光染色プロトコルを終了します。この手法は、さまざまな刺激によって引き起こされるDNA損傷の検出に適しています。特に、電離放射線に対する反応や放射線感受性の評価に最適です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

分子マーカーとしてγH2AX形成を用いてDNA二本鎖縞の定量化は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、放射線に対する細胞の曝露後のγH2AX病巣の定量化のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。...

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

DNA二本鎖切断に対する応答のSer -...

電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

このビデオでは、ヒト単核細胞のDNA二本鎖切断部位に局在する特定のDNA損傷応答タンパク質を検出する免疫蛍光顕微鏡法について説明します。タンパク質は特定の一次抗体によって認識され、その抗体は蛍光色素でタグ付けされた二次抗体に結合し、顕微鏡での可視化中に蛍光を発するため、タンパク質を細胞核内の明確な蛍光病巣として可視化することができます。...

DNA二本鎖切断の分析のための免疫蛍光顕微鏡

細胞老化、細胞周期停止の不可逆的な状態は、様々な細胞ストレスによって誘導することができます。ここでは、老化のマーカーを評価するために、細胞の老化や方法を誘導するためにプロトコルを記述します。...

誘導および定量化細胞老化するテクニック

この原稿は、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DNA...

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

提示された方法は、DNA二本鎖切断(DSB)、細胞周期分布およびアポトーシスの定量分析を組み合わせて、DSB誘導および修復の細胞周期特異的評価と修復失敗の結果を可能にする。...

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DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。...

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このプロトコルは、末梢血リンパ球に対するγ-H2AX病巣アッセイのスライド調製および自動スコアリングを提示する。アッセイの方法および感度を例示するために、単離リンパ球を インビトロで照射した。DNA...

ヒト末梢血リンパ球におけるγ-H2AX Fociアッセイの自動微視的スコアリング法

このプロトコルは、ブレオマイシン処理されたヒト末梢リンパ球の間期核におけるγH2AXおよび53BP1病巣の同時検出を通じて、DNA二本鎖切断の形成および修復を評価する方法を提示する。...

ヒト末梢リンパ球におけるγH2AXと53BP1の二重免疫蛍光法

ここでは、DNA損傷部位でのタンパク質相互作用を検出するためのシンプルで迅速なプロトコールを紹介します。...

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

学ぶγH2AX免疫蛍光法によるマウス組織のDNA二重鎖切断検出と定量。放射線応答や疾患モデルでのDNA損傷評価に適した高感度プロトコルを解説します。

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

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