Name: アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶChIP-Seq法によるKDM5A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素のゲノム標的同定。クロスリンククロマチンをソニケーション処理し、抗体を用いて免疫沈降、PCR増幅とシーケンス解析を行う。エピジェネティック制御メカニズムの理解に有用です。

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この作品は、NIHから115347 - RSG - 08 - 271 - 01 - GMC ACSから、とCA138631からの助成金によって支えられている。

プロトコルは、もともとB.漣、2001年から適応されました。それは、オドムらによるプロトコルのわずかな修正を表します。で見つけることができる5 <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1。事前にブロックし、磁気ビーズへの抗体の結合は、（次のステップの前に夜を実行する必要があります） <ol><li>新鮮BSA / PBS溶液（50 mgを10 mLのBSA PBS -このソリューションは、一週間続く）。1mLにダイナビーズプロテインGを100μLを（IPごとに、複数のIPに対して結合）ウォッシュ</li><li>磁気スタンドを使用してビーズを収集し、洗浄操作をさらに2回繰り返す。 </li><li>次に、PBS / BSA溶液中でのビーズのスラリー（IP毎）の250μlのために抗体10μgを追加し、4℃で回転プラットフォーム上で一晩インキュベート℃の</li><li>完了すると、PBS / BSA溶液1mlにビーズを3回洗浄し、PBS / BSA溶液（IP毎）10μlに再懸濁します。 </li></ol> 2。細胞架橋<ol><li>この手順を開始するには、各免疫沈降、またはIPのために約10 8細胞を成長させる。ここでは、びまん性組織球性リンパ腫U937細胞を96時間のTPAによる単球分化のために使用され、誘導されています。 </li><li>細胞増殖に続いて、1％の最終濃度に直接メディアにホルムアルデヒド溶液を加える。その後、スワールフラスコの簡潔にし、それらを室温で10分間座ってすることができます。その後、培地を吸引除去し、氷冷PBS 15 mLで細胞をリンス。一度この洗浄を繰り返します。 </li><li>次に、それぞれに溶解バッファー1（プロテアーゼ阻害剤を含む50mM HEPES - KOH、pH7.5の、140mMのNaCl、1mMのEDTA、10％グリセロール、0.5％NP - 40、0.25％トリトンX - 100、）6 mLを加え氷の上にフラスコの。その後、4℃で20分間フラスコを揺らし℃に</li><li>最後に、セルスクレーパーを用いて細胞を収穫し、15 mLコニカルチューブに移す。この時点で、細胞は-80℃で保存することができます</li></ol> 3。細胞の超音波処理<ol><li>細胞が凍結されていた場合、それらを解凍。融解後、4℃で10分間、3,000 rpmで細胞をスピンダウンし、上清を捨てる。その後、溶解バッファー2（10mMトリス- HCl、pH8.0の、200 mMのNaCl、1mMのEDTA、0.5mMのEGTA、プロテアーゼ阻害剤を含む）の6 mLで細胞を懸濁します。室温で10分間穏やかにチューブを揺らし。 </li><li>遠心分離を繰り返して、溶解バッファー3（10mMトリス- HCl、pH8.0の、100mMのNaCl、1mMのEDTA、0.5mMのEGTA、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、0.5％N -ラウロイルサルコシン、プロテアーゼ阻害剤を含む）2.5 mLで細胞を再懸濁。 </li><li>次に、50〜60％の振幅の間に設定さブランソン450超音波処理のマイクロチップを氷水のビーカーに置くことで超音波処理のために懸濁液を調製。 </li><li> 1分間氷上で30秒間一定バーストと涼しいのためのソリューションを超音波処理してください。これらのパルスを10〜15回繰り返します。その後、上下チューブの内容物をピペットで新しいチューブに移す。さらに5回パルスソリューションを冷却し続ける。 </li><li>超音波処理後、溶液の体積のトリトンX - 100〜1 / 10 10％を追加。 1.5 mLの遠心チューブにライセートを移し、マイクロ遠心機でゴミをスピンアウト。次に、新しいチューブに細胞溶解液を移す。 </li></ol> 4。クロマチン免疫沈降<ol><li>前のクロマチン免疫沈降法、またはチップに、入力のサンプルとして、細胞溶解物50μLを保存します。その後、ダイナビーズ上述のように事前に準備されている抗体に事前にバインドされて清澄化細胞ライセートを組み合わせる。 4℃で一晩、50μLの入力サンプルに加えて、混合物を揺らし。 </li><li>洗浄緩衝液1 mL（50mMのHEPES - KOH、pHは7.6、0.5 M塩化リチウム、1mMのEDTA、0.7％デオキシコール酸ナトリウム、1％NP - 40）でビーズを洗浄する。その後、ビーズを収集し、上清を除去する磁気スタンドを使用してください。この洗浄を6〜8回を繰り返します。 </li><li> 1 mLのTE -プラス50mMのNaCl（10mMトリス- HCl、pH8.0の、50mMのNaCl、1mMのEDTA）で最終洗浄を行います。 4℃で2分間3000rpmで遠心でビーズをスピン℃に遠心分離に続いて、任意の残留TEバッファーを吸引除去する。 </li><li>その後、試料に溶出バッファーを100μL（50mMのTris - HCl、pH8.0の、10mMのEDTA、1％SDS）を追加します。直後に、65でサンプルをインキュベート℃で10分間から15分間。懸濁液中にビーズを保つために1.5 mlチューブをラックごとに2分に対して、チューブに傷を付けない。 </li><li>遠心分離と磁気スタンドを使用してビーズを収集し、そしてPCRチューブに上清を移す。その後、以前に保存した入力サンプルを取得し、溶出バッファーの3つのボリュームを追加します。 </li><li>最後に、65℃一晩サーマルサイクラーにIPと入力サンプルを配置° Cにクロスリンケージを逆。 </li><li>翌日、試料をTE緩衝液の1ボリュームを追加します。その後、0.2μg/μLの終濃度にRNase Aを追加。 37℃で1〜2時間サーマルサイクラーにサンプルをインキュベート℃に</li><li>インキュベーション後、0.2μg/μLの終濃度にプロテイナーゼKを追加します。その後、2時間55℃でサーマルサイクラーにサンプルをインキュベートする。 </li><li>次に、フェノールの一冊で一回のサンプルを抽出する。クロロホルム：イソアミルアルコール、フェノールの一冊でサンプルをもう一度抽出する。イソアミルアルコール：最後に、クロロホルムの一冊で一回より多くのサンプルを抽出する。 </li><li>その後、各サンプルにグリコーゲンの30μgのを追加。また、サンプルにエタノールの0.2モルと2つのボリュームの最終濃度にNaClを加える。 -80 30分のためにそれらをインキュベート℃にインキュベーション後、サンプルをスピンし、上清をデカントする。 75％エタノール500μLでペレットを洗浄してください。その後、ペレットを乾燥し、それらは水40μLで再懸濁する。 </li><li>超音波処理の手順によって生成されるDNA断片のサイズを確認するには、1.8％アガロースゲルで精製された入力サンプルの5μgをロードし、ゲルを実行します。超音波処理の手順は、150から350塩基対の範囲内でフラグメントを生成する必要があります。フラグメントがこの範囲に該当しない場合は、、超音波処理の手順は、バーストと振幅の数を変えることによって調整されるべきである。 </li><li> IPサンプルと入力サンプルの希釈系列の1μlと遺伝子特異的PCRを行うことにより、制御結合領域の濃縮は、チップの堅牢性と特異性を確認するには。 2〜3"バウンド"の領域と非連結コントロールの領域は、IPと入力サンプルの品質をテストするために選択する必要があります。 </li></ol> 5。ゲノムDNAの増幅<ol><li>ゲノムDNAサンプル調製キットを使用してDNA断片へのアダプターの'テールに加え、ライゲーション、最後の修復を実行、IPサンプル34μlまたは、入力サンプルの200 ngのを皮切りに<a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/をgenome_analyzer.ilmn</a> （イルミナ社、サンディエゴ、CA）。 </li><li>アプライPCR精製キットを用いてDNAを精製し、その後50℃にあらかじめ温めておいたれているバッファEB（10 mMトリスClを、pH8.5）にそれを溶出させる例えば、それぞれ、IPと入力のDNAサンプルの最終的な溶出に23μLと46μLを使用してください。 </li><li>アダプタを搭載したDNAの23μL、およびキットから25μLPhusion DNAポリメラーゼ、20μMのSol_PCR_1、および20μMSol_PCR_2の1μLの1μLを用いてPCR反応を行う。次のようにPCR反応実行：、2）10秒98℃、3）65 ° Cで30秒、℃、98℃1）30秒4）30秒、72℃で、繰り返しのステップステップ2-4 18最終的に4℃で保持して時間と72℃で5分° C、° C. </li><li> PCR増幅に続いて、QIAGENアプライPCR精製キットでDNAを精製。 50〜バッファのEBのプレ暖かい15μL℃、DNAを溶出する。サンプル1:4の0.5μLを希釈し、光度計の読み取りを行います。 </li></ol> 6。増幅産物のゲル精製<ol><li>増幅産物を精製するために、HPLCグレードの水を用いて50 mLの1.8％アガロースゲルを準備する。アガロースが溶解した後、TAEとエチジウムブロマイドを追加。その後、ゲルを注ぐ。入力とIPサンプルにローディングバッファーの4μLを追加した後ゲルをロードします。その後、45分間120ボルトで泳動する。 </li><li>それが実行された後のゲルを解析する。ゲルは、150および350塩基対の間の範囲のフラグメントが生成されていることを明らかにする必要があります。彼らは長さと、アダプタで50〜250塩基対の間のゲノムDNA断片を表しています。 </li><li>メスを持つ150 350塩基対の範囲内の物質を含むゲルの物品の領域。約120塩基対で動作するアダプタ - アダプタのバンドを、切り出すように注意してください。メーカーの指示ごとQIAクイックゲル抽出キットを用いてDNAを回収する。具体的には、400 mgまたは以下のゲルスライスのQIAクイックゲル抽出キットから1つの列を使用してください。抽出プロセスを開始するには、ゲルの1ボリュームにQGバッファの3つのボリュームを追加します。イソプロパノールの1ボリュームを追加し、カラムに混合物をロードする。キット取扱説明書に記載されている標準の手順に続いて、カラムを洗浄するQGを0.5 mlのを使用してください。 H 2 Oを使用して、予め温めておいた50℃DNAを溶出する。それをスピンダウンする前に37℃で5分間、H 2 O30μlの° Cでカラムをインキュベートします。 </li><li>熱のないSpeed​​vacでダウン正確に11μLのサンプルを乾燥させる。サンプルの1μLを削除し、光度計分光光度計を用いてDNA濃度を測定する。 </li><li>最後に、で説明したイルミナGenome AnalyzerIIe使用して濃縮された遺伝子産物を識別<a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/supplを</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6。 </li></ol> 7。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1は、次の実験の全体的な目標は、KDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素のゲノム標的を同定することです。 （P1）これは、適当な大きさのDNA断片を生成するために超音波処理され、クロスリンクされたクロマチンの調製により達成されます。 （P2）第2段階として、RBP2結合したDNA断片は、RBP2抗体で免疫沈降されています。 （P3）次に、回収したDNA断片は、両端に修復され、アダプタは、イルミナClusterの駅でフローセルに分析のためにゲノムDNAのライブラリーを準備するためにゲノムDNAの末端に連結されている。 DNAライブラリーは、サイクル数が少ないを使用してPCRにより増幅されています。 （P4）最後に、イルミナシーケンス短いが一意にヒトゲノムに整列されている読み取り、有意なピークがRBP2濃縮領域を識別するために、同定され、最も近い遺伝子にアノテートされています。 （P5）の結果はRBP2濃縮領域のゲノムワイドな同定に基づくRBP2標的遺伝子と関連分子の機能を示すことが得られる。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。超音波処理の手順によって生成されるDNA断片のサイズを確認するにはクロマチン超音波処理の結果をチェックし 、精製された入力サンプルの5μgの（1 / 10）1.8％アガロースゲルにロードされました。予想通り、私たちの超音波処理の手順は、150から350 bpの範囲内のフラグメントを作り出した。フラグメントがこの範囲に該当しない場合は、、超音波処理の手順は、バーストと振幅の数を変えることによって、それに応じて調整する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。増幅産物のゲル精製。PCR産物は、アダプタを削除し、クラスタ生成プラットフォーム用のテンプレートのサイズ範囲を選択するにはゲル上で実行されています。このゲルは、150および350塩基対の間の範囲内のフラグメントが作り出されたことを示しています。彼らは長さと、アダプタで50〜250塩基対の間のゲノムDNA断片を表しています。メスを用いてゲルの我々は、物品税、選択された地域。ケアは、約120塩基対で動作するアダプタ - アダプタのバンドを、避けるように注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。アイソフォーム特異的抗体は、RBP2の大小のアイソフォームを区別することができます。RBP2タンパク質の構造がドメインのビューで提供される。触媒ヒストン脱メチル化JmjCドメインと関連付けられているJmjNドメイン、配列特異的DNA結合、潜在的にDNAや他のタンパク質と相互作用する可能性C5HC2ジンクフィンガー、および複数のPHDドメインが可能な乾燥ドメイン：RBP2は、いくつかのドメインが含まれています。 RBP2アイソフォームを区別するための2つの抗RBP2抗体は太い線で示されるRBP2断片に対して誘導された。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="図5a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5a"> 図5a。 （全てのアイソフォームと大きなアイソフォーム）濃縮RBP2を識別結合領域の染色体とEnsemblの遺伝子と一緒にRBP2結合領域の概要。ゲノム座標は、染色体が賢明表示されます。 Ensemblの遺伝子のOccupances（バージョン54、HG18）染色体では（この写真では10番染色体）、黒いバー（上部パネル）として表示されます。各RBP2結合領域は、中央のパネルはすべてRBP2アイソフォームの10番染色体、および底部パネルの結合領域を示す垂直線として表されますRBP2大きなアイソフォームの結合領域を示しています。中央と下部のパネルは、10番染色体上の重複やRBP2アイソフォームの特異的占有の概要を示します。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="図5b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5b"> 図5b。 RBP2標的遺伝子の機能的な濃縮分析。ヒートマップFDRが大幅に修正を示す（p値≤0.05）濃縮はRBP2（すべてと大きなアイソフォーム）で（RBP2結合領域に最も近い遺伝子）バインドされた遺伝子の中で分子機能のカテゴリを移動します。赤色に向かって色が高い統計的有意性を示すため、黄色は低い統計的有意性を示し、灰色は統計的有意性がないことを示します。濃縮分析はRBP2標的遺伝子の重複とアイソフォーム特異的な分子の機能を示しています。

<ol><li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li>
<li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li>
<li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li>
<li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

RBP2アイソフォームの機能的な違いが決定されていない。我々はRBP2アイソフォームがバインドされているゲノム領域を特定し、これらの地域が表す​​機能的なカテゴリを定義する包括的なアプローチを使用している。これは、得られた配列を読み取るのバイオインフォマティクス解析に続いてのChIP - seqの分析によって達成されました。 RBP2はヒストンテール上のメチル化リジン残基を変更します。我々はRBP2大きなアイソフォームは、ヒトゲノムのさまざまな地域（図5A）に、このモジュールのバインドを欠いているメチル化ヒストンリジンとRBP2小さなアイソフォームの認識モジュールが含まれていることがわかった。重要なのは、アイソフォーム固有の領域と重複する領域が異なる分子の機能（図5B）を持つ遺伝子に属します。例えば、&quot;クロマチン結合&quot;と&quot;転写因子結合&quot;関数がRBP2小さなアイソフォームの遺伝子標的に帰することができますが、ないのRBP2大きなアイソフォーム（図5B）。実際の遺伝子を比較することによって、すべてのアイソフォームとRBP2大きなアイソフォーム（データは示さず）に対して生成されたセットに大きなアイソフォームは、特に、特定の遺伝子に募集されている場合、我々はまた、定義することができます。

オリゴヌクレオチド配列2006イルミナ株式会社すべての権利を保有。 <ul><li> Sol_PCR_1 配列5&#39; - AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T - 3&#39; </li><li> Sol_PCR_2 配列5&#39; - CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T - 3&#39; </li></ul>

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

彼らのターゲットへの転写やエピジェネティックな要因の採用は、彼らの調節に重要なステップです。目立つように特定のヒストン修飾に結合するタンパク質のドメインは、募集に掲載。そのようなドメインは、いくつかのクロマチン結合タンパク質に見られる植物のホメオドメイン（PHD）、です。エピジェネティックな因子RBP2が複数のPHDドメインがある、しかし、彼らはさまざまな機能（図4）がある。特に、ヒト白血病におけるRBP2発癌性の融合に見られるC末端PHDドメインは、ヒストンH3のトリメチル化リシン4（H3K4me3）1に結合する。 C末端PHDを含むRBP2のアイソフォームに対応する転写産物は、単球2にpromonocytic、リンパ腫由来、U937細胞の分化の間に蓄積されます。両方のデータセットと一致し、ゲノムワイドな解析は、分化したU937細胞では、RBP2タンパク質が非常にH3K4me3 3に富むゲノム領域に局在化されることを示した。そのターゲットにRBP2の局在はRBP2ヒストン脱メチル化酵素活性と転写活性の減少により、H3K4me3の減少と相関している。対照的に、RBP2の二つの博士号は、H3K4me3をバインドすることはできません。特に、RBP2のC末端ドメインPHDは小さなRBP2アイソフォーム4の不在である。それはH3K4me3との相互作用を欠いているRBP2、、の小さなアイソフォームは、ゲノムの位置に大きなアイソフォームとは異なることが考えられる。 RBP2アイソフォームの遺伝子位置の違いはRBP2機能で観測された多様性を占める可能性があります。具体的には、RBP2は、網膜芽細胞腫タンパク質（pR​​Bの）により媒介される細胞の分化において重要なプレーヤーです。これらのデータ、以前のゲノムワイドな解析と一致し、アイソフォームを区別することなく、RBP2標的遺伝子の2つのグループ識別：1）差別化とは独立した方法でRBP2に拘束される遺伝子;でRBP2に拘束される2）遺伝子の分化依存的。 アイソフォーム間で局在の違いを識別するために我々はChIP - seqでゲノムワイド位置解析を行った。我々はすべてのRBP2のターゲットの位置を確認したRBP2アイソフォームの両方を検出する抗体を使用する。さらに我々は唯一の大規模な、そして小さなはなくRBP2アイソフォーム（図4）に結合する抗体を持っている。大規模なアイソフォームのターゲットを特定した後、一つは、小さなアイソフォームのターゲットを明らかにするために、すべてのRBP2ターゲットからそれらを差し引くことができます。これらのデータは、ゲノム中のその結合部位へのタンパク質補充にクロマチンと相互作用するドメインの寄与を示しています。

ここでは、ヒストン結合ドメインが異なるタンパク質アイソフォームのゲノムワイド位置解析のためのクロマチン免疫沈降（ChIP）の手順を提示している。我々はKDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素の標的を同定するためのChIP - seqの分析に適用しています。

転写因子およびエピジェネティック因子の標的へのリクルートは、それらの調節における重要なステップである。リクルートにおいて特に重要な役割を果たすのが...

本実験の全体的な目的は、RBB2ヒストン脱メチル化酵素であるKDM5A（Jared1）のゲノム標的を特定することです。まず、架橋クロマチンを調製し、次にソニケーションを行うことで適切なサイズのDNA断片を生成します。その後、RBB2抗体を用いてRBB2結合DNA断片を免疫共沈殿させます。次に、回収したゲノムDNAをPCRで増幅し、シーケンシングを行います。最後に、Illuminaでシーケンシングしたショートリードをヒトゲノムに一意にマッピングし、有意なピークを特定して、最も近い遺伝子にアノテーションします。Rbbb twoの標的遺伝子を特定するために、ゲノムワイドなRbbb two濃縮領域の同定に基づき、Rrb B twoの標的遺伝子2つに関連する分子機能を示す結果を得ます。こんにちは、マイクです。私はイリノイ大学シカゴ校の生化学・分子遺伝学部のElizabeth Bencia博士の研究室に所属しています。そして私はアラで、バルセロナ生物医学研究パークのNGA博士率いる生物医学ゲノミクス研究室に所属しています。私はダニエル・ダルです。私はウィリアム・リヒターです。私たち both は、ベネボレンス・スキルラボに所属しています。本日は、クロマチン免疫沈降およびシーケンシングの手順をご紹介します。当研究室では、ヒストン脱アセチル化酵素の結合部位を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。本手順を開始するために、約10⁸個の細胞を培養します。これは、各免疫沈降（ip）において、びまん性骨溶解性リンパ腫を用いる場合です。U 9 37細胞を用い、細胞を増殖させた後、TPAで96時間誘導して単球分化させます。ホルムアルデヒド溶液を培地に直接添加し、最終濃度を1%にします。その後、フラスコを軽く回して撹拌し、室温で10分間静置します。次に、培地を吸引し、氷冷したPBS 15 millilitersで細胞を洗浄します。この洗浄工程をもう一度繰り返します。次に、氷上の各フラスコに6 mLのライシスバッファー1を加えてください。その後、4 °Cで20分間、フラスコを振盪させます。最後に、セルスクレイパーを用いて細胞を回収し、15 mLコニカルチューブに移します。この時点で、細胞を−80°Cで保存できます。細胞を凍結保存していた場合は、解凍してください。解凍後、細胞を遠心分離して回収し、上清を捨てます。次に、細胞を6 mLのライシスバッファー2に再懸濁し、室温で10分間チューブを緩やかに回転混和させます。再び遠心分離を行い、細胞を2.5 mLのライシスバッファー3に再懸濁します。続いて、懸濁液を氷水の入ったビーカーに入れ、Branson 450ソニケーターのマイクロチップを振幅50〜60%に設定し、超音波処理の準備をします。溶液を32秒間一定の間隔でソニケーションし、氷上で冷却します。このパルス処理を1分間につき10〜15回繰り返し、その後、チューブの内容物をピペッティングして新しいチューブに移します。引き続き、溶液のパルス処理と冷却を繰り返します。超音波処理をさらに5回繰り返した後、溶液量の10分の1に相当する量の10% Triton X 100を加えます。次に、溶解物を1.5 mL遠心チューブに移し、クロマチン免疫沈降（ChIP）を行う前にマイクロ遠心機でデブリを沈降させます。細胞溶解液のうち50 µLをインプットサンプルとして保存してください。次に、清澄化した細胞溶解液を、記載されたプロトコルに従ってあらかじめ調製した抗体結合dyna beadsと混合させます。この混合液に50 µLのインプットサンプルを加え、4 °Cで一晩ローキングします。その後、1 mLの洗浄バッファーでビーズを洗浄します。次に、マグネットスタンドを用いてビーズを回収し、上清を除去します。この洗浄操作を6〜8回繰り返します。最後に、1 mLのTEに50 mMの塩化ナトリウムを加えた溶液で最終洗浄を行います。遠心分離後、マイクロ遠心機でビーズをスピンさせ、残存しているTEバッファーを吸引して除去します。その後、直ちにサンプルに100 µLの溶出バッファーを加えます。サンプルを65 °Cで10〜15分間インキュベートします。ビーズを懸濁状態に保つため、2分ごとに1.5 mLチューブラックでチューブを軽く擦ってください。遠心分離とマグネットスタンドを用いてビーズを回収し、上清をPCRチューブに移します。次に、保存しておいたインプットサンプルを回収し、3容量分の溶出バッファーを加えます。最後に、IPサンプルとインプットサンプルをサーマルサイクラーに入れ、65 °Cで一晩処理します。翌日、架橋を解除するために、サンプルに1容量分のTEバッファーを加えます。次に、RNA Aを最終濃度0.2 µg/µLになるように加えます。サンプルをサーマルサイクラーで37 °Cで1〜2時間インキュベートします。インキュベート後、プロテイナーゼKを最終濃度0.2 µg/µLになるように加えます。次に、サンプルをサーマルサイクラーを用い 55 °C で2時間インキュベートします。続いて、1容量のフェノールでサンプルを1回抽出します。さらに、1容量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールでサンプルを2回目に抽出します。最後に、クロロホルム・イソアミルアルコール等量を用いて、サンプルをもう一度抽出します。次に、各サンプルに30 µgのグリコーゲンを添加します。さらに、塩化ナトリウムを最終濃度0.2 Mとなるように加え、サンプルに2容量のエタノールを添加します。これらを-80°Cで30分間インキュベートします。インキュベート後、サンプルを遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを500 µLの75% ethanolで洗浄し、その後ペレットを乾燥させ、40 µLの水に再懸濁します。超音波処理（SONICATION）によって生成されたDNA断片のサイズを確認するため、精製した入力サンプル5 µgを1.8%アガロースゲルにロードして電気泳動を行います。超音波処理により、断片サイズが150から350 bpの範囲に収まっている必要があります。もし断片がこの範囲にない場合は、ゲノムDNAの増幅前に、バースト回数と振幅を変更して超音波処理の条件を調整してください。書面プロトコルに従い、サンプルのサイズ、濃度、および濃縮度を確認します。ゲノムDNAの増幅を開始するために、IPサンプル34 µLとインプットサンプル200 ngを分取します。書面プロトコルに従い、IlluminaゲノムDNAサンプル調製キットを用いて、DNAフラグメントへのA-tail付加およびアダプターのライゲーションを行い、修復します。ミニPCR浄化キットを用いてDNAを精製し、50 °Cに予熱したバッファーEBで溶出します。IP用DNAサンプルには23 µL、インプット用DNAサンプルには46 µLを使用してください。アダプター付きDNA 23 µLと、キットに含まれる融合DNAポリメラーゼ 25 µLを用いてPCR反応を行います。20 µMのsole PCR oneを1 µLと、20 µMのsole PCR twoを1 µL加え、記載のプロトコルに従ってPCR反応を行います。PCR増幅後、Qiagen mini loop PCR purification kitを用いてDNAを精製します。15 µLのバッファーEBを50 °Cに予熱し、サンプルの0.5 µLを1対4で希釈し、NanoDropで測定して増幅産物を精製します。HPLCグレードの水を用いて50 mLの1.8% AGROSゲルを調製し、AGROSが溶解した後にTAEと臭化物を添加します。その後、ゲルを流し込み、サンプルをロードします。インプットサンプルおよびIPサンプルに4 µLのローディングバッファーを加え、120 Vで45分間ゲル電気泳動を行います。泳動後、ゲルを解析します。これにより、150 bpから350 bpの範囲の断片が生成されていることが確認されるはずです。これらは50から250塩基対の長さのゲノムDNA断片に相当します。次に、メスを用いて、150から350塩基対の範囲に物質が含まれるゲル領域を切り出します。この際、約120塩基対に位置するアダプターバンドを切り出さないように注意してください。メーカーの指示に従い、Kaye Quick Gel Extraction Kitを用いてDNAを回収します。サンプルをSpeedVacを用いて加熱せずに正確に11 µLまで乾燥させます。サンプルの1 µLを分取し、NanoDrop分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。最後に、Illuminaゲノムアナライザーを用いて濃縮された遺伝子産物を同定し、記述プロトコルに従って結合部位および標的遺伝子を解析します。同定された濃縮RB結合タンパク質2またはRBP2結合領域のゲノム座標は、染色体ごとの形式で提示されます。染色体におけるアンサンブル遺伝子の占有状態は、黒色のVARとして可視化できます。ここでは第10染色体の占有状態が示されており、RBP2の結合領域が垂直線として表示されています。中央のパネルは、第10染色体におけるすべてのRBP2アイソフォームの結合領域を示し、下段のパネルは、RBP2のラージアイソフォームの結合領域を示しています。これらの情報は、第10染色体におけるRBP2アイソフォームの重複および特異的な占有の概要を提供するものです。ここでは、RBPに結合した遺伝子における、偽発見率（FDR）で補正した有意に濃縮されたジーンオントロジー（GO）分子機能カテゴリーのヒートマップを示しています。赤に近い2つの色は統計的有意性が高いことを示しています。黄色は統計的有意性が低く、灰色は統計的有意性がないことを示しています。濃縮分析により、R BP 2標的遺伝子の重複およびアイソフォーム特異的な分子機能が示されています。この手順において、転写因子の結合部位を特定する方法を説明しました。適切なサイズ範囲と収量のDNA断片を作製することが重要です。これは、SONICATION（超音波処理）ステップにおいて当社のガイドラインに従うことで達成できます。以上となります。皆様の実験がうまくいくことを願っております。ご視聴ありがとうございました。

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当社ベイジアン変化点（BCP）のアルゴリズムは変化点隠れマルコフモデルを経由してモデリングの最先端の進歩に基づいて構築され、クロマチン免疫沈降シーケンス（ChIPseq）データ解析に適用します。...

多様ChIPseqデータ型のゲノムワイドな解析のための新規ベイジアン変化点アルゴリズム

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ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

プロトコルは、大規模な遺伝子型決定を行うためにイルミナインフィニウムアッセイを使用することが記載されている。これらのアッセイは、確実に3日間で、個々のDNAサンプルの数百人を越えSNPの何百万人の遺伝子型を決定することができます。一度生成された、これらの遺伝子型は異なる疾患または表現型の様々な関連性をチェックするために使用することができる。...

大規模なSNPジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ

このビデオの記事は、遺伝子標的と2成分系の応答調節因子の結合部位を決定するためのin vitroのマイクロアレイベースの方法を説明します。...

細菌のための2つの成分​​規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法

特定のゲノム領域に関連する分子の同定は、これらの領域の機能の制御メカニズムを理解するために必要です。このプロトコルは、特定のゲノム領域に関連するタンパク質およびRNAの同定のために、遺伝子操作されたDNA結合分子媒介クロマチンimunoprecipitation(enChIP)を実行する手順を説明しています。...

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna...

マイクロ Rna と受ける DNA の組換えをクラス スイッチしてプラズマ細胞の分化誘導された B 細胞における Mrna のゲノム解析の HDAC 阻害剤を介した変調

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

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我々は、三次元クロマチン相互作用を用いてゲノム全体の関連研究(GWAS)によって同定される非コード変異体の機能的影響を同定するプロトコルを提示する。...

クロマチン構成の計算解析を用いたアルツハイマー病変異体の標的遺伝子へのマッピング

本論文では、ChIP液体ハンドラプラットフォームを用いた特定のヒストン修飾(H3K27ac)に関連するDNA領域の半自動マイクロスケールのChIP-Seqプロトコルについて説明し、続いてタグメンテーションを用いたライブラリ調製について述べている。この手順には、品質と量の目的に対する制御評価が含まれており、他のヒストン修飾または転写因子に採用することができます。...

大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

学ぶChIP-Seq法によるKDM5A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素のゲノム標的同定。クロスリンククロマチンをソニケーション処理し、抗体を用いて免疫沈降、PCR増幅とシーケンス解析を行う。エピジェネティック制御メカニズムの理解に有用です。

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

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