アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

次の実験の全体的な目標は、KDM 5 a Jared one、RBB 2 ヒストンデメチラーゼのゲノム標的を特定することです。これは、第2のステップとして適切なサイズのDNA断片を生成するために超音波処理される架橋クロマチンの調製によって達成されます。RBB 2結合DNA断片は、RBB 2抗体で免疫沈降します。

次に、回収されたゲノムDNAをPCRで増幅し、シーケンシングを行います。最後に、Illuminaのシーケンシングされたショートリードは、ヒトゲノムに一意にアラインメントされ、重要なピークが同定され、最も近い遺伝子にアノテーションが付けられます。rbbb 2つの標的遺伝子を同定するためには、Rbbb 2つの濃縮領域のゲノムワイドな同定に基づいて、Rrb B 2つの標的遺伝子に関連する分子機能を示す結果が得られます。

こんにちは、マイクです。彼女は、シカゴのイリノイ大学の生化学および分子遺伝学部のエリザベス・ベンチア博士の研究室から来ました。そして、私はBARCEL Biomedical Research Park University PO P feaのNGA博士が率いる生物医学ゲノミクス研究室の出身です。

そして、私はダニエル・ダルです。そして、私はウィリアム・リヒターです。私たち二人もベネボレンススキルラボに所属しています。

今日は、クロマチン、免疫沈降、シーケンシングの手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、彼の皮膚科医の結合部位を研究しています。それでは始めましょう。

この手順を開始するには、約10〜8番目のセルを成長させます。各免疫沈降または ip.ここでは、びまん性骨溶解性リンパ腫です。

U 9 37細胞は、ホルムアルデヒド溶液で直接培地に細胞増殖後96時間TPAによる単球分化のために使用され、誘導され、最終濃度が1%になり、その後、フラスコを短時間渦巻かせ、室温で10分間座らせます。次に、培地を吸引し、15ミリリットルの氷冷PBSで細胞をすすぎます。この洗浄を一度繰り返します。

次に、氷上の各フラスコに6ミリリットルの溶解バッファーを1つずつ加えます。次に、フラスコを摂氏4度で20分間揺らします。最後に、セルスクレーパーを使用して細胞を採取し、15ミリリットルの円錐管に移します。

この時点で、セルは摂氏マイナス80度で保存できます。細胞が凍結している場合は、それらをホーアウトします。解凍したら、細胞をスピンダウンしてスナットを廃棄します。

次に、細胞を6ミリリットルの溶解緩衝液2に再懸濁し、チューブを室温で10分間穏やかに振とうします。遠心分離を繰り返し、細胞を2.5ミリリットルの溶解緩衝液3に再懸濁します。次に、Branson 450 sonierのマイクロチップを50〜60%の振幅に設定して、氷水のビーカーに懸濁液を入れて、懸濁液を超音波処理用に準備します。

溶液を32回目のコンスタントバーストのために超音波処理し、氷上で冷却します。1分間、これらのパルスを10〜15回繰り返してから、チューブの内容物を上下にピペットで動かし、新しいチューブに移します。溶液をパルスして冷却し続けます。

超音波処理後さらに5回、溶液量の10分の1に10%Triton X 100を加えます。次に、ライセートを1.5ミリリットルの遠心チューブに移し、クロマチン、免疫沈降、またはチップの前にマイクロ遠心分離機で破片をスピンアウトします。インプットサンプルとして50マイクロリットルの細胞ライセートを保存します。

次いで、透明化した細胞溶解物を、書面のプロトコールに記載されたように予め調製した抗体に結合したダイナビーズと組み合わせた。50マイクロリットルの入力サンプルに加えて、混合物を摂氏4度で一晩揺さぶります。ビーズを1ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄します。

次に、磁気スタンドを使用してビーズを収集し、上清を取り除きます。この洗浄を6〜8回繰り返します。1 ミリリットルの TE と 50 ミリモル塩化ナトリウムで最終洗浄を行います。

遠心分離後、マイクロ遠心分離機でビーズを回転させ、残留TEバッファーを吸引します。次に、100マイクロリットルのeluバッファーをサンプルに加えます。直後。

サンプルを摂氏65度で10〜15分間インキュベートします。2分ごとに1.5ミリリットルのチューブブラックに対してチューブを引っ掻き、ビーズを懸濁状態に保ちます。遠心分離と磁気スタンドを使用してビーズを採取し、SNATをA PCRチューブに移します。

次に、以前に保存したインプットサンプルを取り出し、溶出バッファーを3容量追加します。最後に、IPを配置し、サンプルを温度65°Cで一晩サーマルサイクラーにインプットします。翌日に架橋を逆転させるには、サンプルに 1 容量の TE バッファーを追加します。

次に、RNA Aを最終濃度の0.2マイクログラム/マイクロリットルまで追加します。サンプルをサーマルサイクラーで摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。インキュベーション後、プロテイナーゼKを最終濃度0.2マイクログラム/マイクロリットルまで添加します。

次に、サーマルサイクラーでサンプルを摂氏55度で2時間インキュベートします。次に、1容量のフェノールでサンプルを一度抽出します。1容量のフェニルクロロホルムイソアミルアルコールでサンプルを2回目に抽出します。

最後に、1容量のクロロホルムイソアミルアルコールでサンプルをもう一度抽出します。次に、各サンプルに30マイクログラムのグリコーゲンを加えます。また、最終濃度0.2モルの塩化ナトリウムと2容量のエタノールをサンプルに加えます。

マイナス80°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを回転させ、スナットをデカントします。ペレットを500マイクロリットルの75%エタノールで洗浄し、次にペレットを乾燥させて40マイクロリットルの水に再懸濁します。

SONICATION手順によって生成されたDNA断片のサイズを確認するには、精製したインプットサンプルの5マイクログラムを1.8%アグロゲルにロードし、ゲルを泳動します。超音波処理手順は、150〜350塩基対の範囲の断片を生成する必要があります。しかしながら、フラグメントがこの範囲に入らない場合、超音波処理手順は、ゲノムDNAの増幅前にバースト数および振幅を変化させることによって調整されるべきである。

書面によるプロトコルに記載されているサンプルのサイズ、濃度、および濃縮度を確認してください。ゲノムDNAの増幅を開始するには、34マイクロリットルのIPサンプルと200ナノグラムの入力サンプルを取得します。DNA断片へのアダプターの付加およびライゲーションを、書面によるプロトコルに記載されているように、IlluminaゲノムDNAサンプル調製キットを用いて

mini lut PCR 精製キットを使用して DNA を精製し、摂氏 50 度に予温したバッファー EB で溶出します。IPとインプットDNAサンプルにそれぞれ23マイクロリットルと46マイクロリットルを使用します。23マイクロリットルのDNAと25マイクロリットルの融合、キットのDNAポリメラーゼのアダプターを使用してPCR反応を行います。

20マイクロモルのソールPCRの1マイクロリットルと20マイクロモルの1マイクロリットル。したがって、PCR 2は、PCR増幅後に書かれたプロトコルに記載されているようにPCR反応を実行します。Qiagen mini loop PCR精製キットでDNAを精製します。

15マイクロリットルのバッファーEBを摂氏50度に予温し、DNAを0.5マイクロリットルのサンプルの1〜4に希釈し、NanoDrop読み取りを実行して増幅された製品を精製します。HPLCグレードの水を使用して50ミリリットルの1.8%AGROSゲルを調製し、TAEを添加し、アグロスが溶けた後に臭化物を添加します。次に、ゲルを注ぎ、ゲルをロードします。

インプットサンプルとIPサンプルに4マイクロリットルのローディングバッファーを追加した後、ゲルを120ボルトで45分間泳動します。分析後のゲルを分析します。は、150から350塩基対の範囲のフラグメントが生成されることを明らかにするはずです。

それらは、長さが50〜250塩基対のゲノムDNA断片を表しています。そしてアダプターはメスで150から350の塩基対の範囲の材料を含んでいるゲルの領域を切り取ります。約 120 塩基対で動作するアダプター・アダプター・バンドを切除しないように注意してください。

製造元の指示に従って、カヤッククイックゲル抽出キットを使用してDNAを回収します。サンプルを11マイクロリットルまで正確に乾燥させ、熱を加えずにスピードバックします。サンプルを1マイクロリットル取り出し、NanoDrop分光光度計を使用してDNA濃度を測定します。

最後に、Illuminaゲノムアナライザーを使用して濃縮された遺伝子産物を同定し、書かれたプロトコルに記載されているように結合部位と標的遺伝子を分析します。同定された濃縮RB結合タンパク質2またはRBP 2結合領域のゲノム座標は、染色体ワイズ形式で提示されます。染色体内のアンサンブル遺伝子の占有は、黒色のVARとして視覚化できます。

ここでは、染色体10の占有率がrbpで示され、2つの結合領域が垂直線で示されています。中央のパネルは、10番染色体上のすべてのrbp 2つのアイソフォーム結合領域を示し、下部のパネルはrbpの2つの大きなアイソフォーム結合領域を示しています。この情報は、10番染色体上のRBP 2アイソフォームの重複する占有率と特定の占有率の概要を示しています。

ここでは、ヒートマップが偽の発見率またはFDR補正された大幅に濃縮された遺伝子オントロジーで示されているか、rbpによって結合された遺伝子のうち分子機能カテゴリが進んでいます。赤方向の2色は、統計的有意性が高いことを示します。黄色は統計的有意性が低いことを示し、灰色は統計的有意性がないことを示します。

エンリッチメント解析は、R BPの2つの標的遺伝子の重複するアイソフォーム特異的な分子機能を示しています。この手順で転写因子の結合部位を特定する方法を示しました。適切なサイズ範囲と収量のDNA断片を作製することが重要です。

これは、SONICATIONステップ中にガイドラインに従うことで達成できます。というわけで、これだけです。あなたの実験に頑張ってください、そして見てくれてありがとう。