アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射

本手順の目的は、成体ゼブラフィッシュの腹腔内に溶液を注入することです。本例では、当研究室でグルコースを注入します。この手順は、血糖恒常性の研究に使用されます。

まず、魚の体重を測定し、体重1gあたりに注入する溶液量を決定します。次に、冷水を用いて魚を麻酔させます。最後に、魚を顕微鏡ステージに移動させ、注入を行います。

手順の最終ステップは、回復させるために魚を水槽に戻すことです。最終的に、血糖値の測定を通じて、グルコース恒常性の変化を示す結果を得ることができます。こんにちは、シカゴ大学生物体生物学・解剖学部のVictoria Prince研究室のMary Kinkleです。

プリンス研究室のステファニー・エイムズです。本日は、成魚のゼブラフィッシュに対する腹腔内投与の手順について解説します。私たちの研究室では、血糖恒常性の調節を研究するためにこの手法を用いています。

それでは始めていきましょう。注射のための魚の準備として、まず魚を清潔な水槽に移し、絶食させます。腸球の内容物を空にするには24時間、血糖値をベースラインレベルまで下げるには72時間、魚を絶食させてください。

本プロトコルで使用する密度は、9Lのタンクあたり雌雄混合個体を10〜12匹とします。タンクには大理石を3層に敷き詰めます。大理石は卵を隔離し、捕食を防ぐ役割を果たします。サイフォンを用いてタンク内の卵と廃棄物を毎日除去してください。

次に、124.1 millimolar 塩化ナトリウム、5.1 millimolar 塩化カリウム、2.9 millimolar ピロリン酸ナトリウム、1.9 millimolar 七水和硫酸マグネシウム、1.4 millimolar 二水和塩化カルシウム、11.9 millimolar 重炭酸ナトリウム、4 g のポリビニルピロリドン、および 1000 USP units のヘパリンを用い、脱イオン水で最終容量を 100 milliliters に調整して Cortland 塩溶液を調製します。フィルターろ過および滅菌を行い、4 °C で保存します。続いて、5 g のグルコースを 10 milliliters の Cortland 塩溶液に溶解させます。0.5 mg/µL のグルコース溶液とするため、フィルターろ過および滅菌を行い、4 °C で保存します。

次に、ソフトスポンジの平面側を高さ約 20 millimeter にカットして手術台を準備します。注入時に魚を固定できるよう、深さ 10 to 15 millimeter の切り込みを入れます。スポンジを 60 millimeter のペトリ皿にセットし、スポンジを入れたペトリ皿を P 200 ピペットチップボックスの蓋にセットします。

次に、顕微鏡のベースをプラスチックラップとペーパータオルで覆って保護し、顕微鏡の準備をします。液漏れに備え、ペーパータオルの上に手術台を設置します。手術台を確認し、スポンジに焦点を合わせて、あらかじめフォーカスを調整しておきます。

スポンジの上に指を置き、そこにピントを合わせてください。これにより、魚を手術台に乗せた際のさらなる焦点調整を最小限に抑えることができます。その後、500 milliliterのビーカーに飼育水を約3分の1まで満たし、魚の重量を測定します。計量器の上で、余分な水をできるだけ除いた状態で魚をネットでビーカーに移し、重量を記録します。重量を測定した各個体は、明確にラベルを貼った水槽に移してください。

体重に基づいて注入量を算出します。この例では、Cortland塩溶液に溶解させたグルコース溶液を、体重1gあたり0.5mgの用量で注入します。溶液の濃度が0.5mg/µLであるため、計算式は「1 × 魚の体重(g) = 注入量(µL)」となります。シリンジおよび関連する注入器具を準備してください。

本プロトコルでは、グルコース注入に30Gのベベル付きスチール針、超マイクロポンプ、micro fourプロセッサ、および10 µLのナノフィルマイクロシリンジを使用します。Cortland塩溶液に溶解した0.5 mg/µLのグルコースをシリンジに充填してください。シリンジからすべての気泡を除去することが重要です。シリンジを超マイクロポンプに取り付け、micro fourプロセッサの数字キーパッドを使用して、1匹目の魚への注入量をナノリットル単位で入力し、プログラムします。最後に、魚類飼育施設の水で作った氷を十分に砕いて、氷麻酔薬を準備します。

アイスバケットを準備するには、手術台を2.4リットルのゴム製食品保存容器などの大きな容器に入れます。外容器と手術台に温めた施設用水を注ぎます。温めた施設用水の予備タンクを近くに用意しておいてください。

外容器に温度計を取り付けます。麻酔用の外容器と手術台を顕微鏡の隣に配置します。砕氷を入れたバケツを近くに準備しておきます。

水温が17 °Cになるまで、氷片を加え始めます。この工程では、17 °Cを下回らないようにしてください。ネットを使用して、魚を外容器に移します。

17 °Cまたはそれよりわずかに低い温度になると、魚は通常、胸鰭を水平に広げ、口をパクパクさせ、鰓蓋を速く動かします。容器に砕氷をゆっくりと加え、数分かけて温度を12 °Cまで下げます。温度が下がるにつれて、魚の泳ぎは緩やかになり、最終的に泳ぐのを止めます。

やがて口パクが止まり、鰓蓋の動きが緩やかになります。魚を扱っても反応しなくなれば、注射の準備が整ったことになります。規定の温度に達したら、スポンジを押して十分に浸らせてください。

魚に熱を伝え、麻酔から覚まさせないよう、指先を十分に冷水に浸しておきます。冷やした指で、魚を優しくスポンジの溝へ移動させます。魚の腹側を上にし、鰓が溝に位置するように配置します。

手術台を速やかに顕微鏡ステージへ移動させます。迅速に作業し、針の先端が頭側を向き、肛門よりも骨盤帯に近い位置に慎重に配置します。骨盤鰭の間の正中線に針を挿入します。

針が体壁まで深く到達したことを実感できるはずです。針を挿入すると、体壁を突き抜ける感覚があります。針が腹腔に入ったら、マイクロプロセッサを使用して適切な量を注入してください。

フットペダルを使用して、魚の体重1gあたり1µLを注入します。注入後、針を抜き、魚を速やかに回復用の温水タンクに戻します。スポンジからタンクの水中に魚を放し、顕微鏡で針を確認してください。時折、鱗が付着していることがあるため、次の注入前に取り除く必要があります。

適切な時間が経過した後、後続のアッセイに進みます。注射前に血糖値をベースラインレベルまで低下させるには、72時間の絶食が必要であることが分かりました。この図において、緑色で示されている非注射コントロールのデータは、赤色で示されている溶媒注射コントロールと有意な差がない血糖値を示しています。

一方で、青色の線はグルコースを注射した魚の血糖値を示しており、循環グルコースの上昇と下降を表しています。時間の経過に伴い、グルコース注射群と溶媒注射群の両方の個体は注射の手順中に外科的麻酔下にとどまっていましたが、非注射コントロール群は外科的麻酔下ではありませんでした。以上で、成ゼブラフィッシュへの腹腔内注射の実施方法について説明しました。

当研究室では、グルコース溶液を腹腔内（IP）投与した後、様々な時点における血糖濃度の変化を研究しています。しかし、今回ご紹介したこの手法は、目的の溶液を投与する場合にも利用可能です。この処置を行う際は、魚をゆっくりと麻酔し、慎重に取り扱うようにしてください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。