アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射
August 30th, 2010
我々は、成体ゼブラフィッシュに腹腔内注射を示しています。我々はMicro4コントローラとUltraMicroPump IIIによって制御される10μlのNanoFilマイクロシリンジを使用してください。このデモでは、麻酔薬として冷たい水の使用が含まれています。
この手順の全体的な目標は、成体のゼブラフィッシュの腹腔に溶液を注入することです。この例では、研究室でブドウ糖を注入します。この手順を使用して、血糖値うっ滞を研究します。
これは、最初に魚の体重を量り、体重1グラムあたりに注入する溶液の量を決定することによって達成されます。手順の2番目のステップは、冷水で魚を麻酔することです。手順の3番目のステップは、魚を顕微鏡ステージに移して注入することです。
手順の最後のステップは、魚を回復のために水槽に戻すことです。最終的には、血糖値の測定を通じて、グルコース恒常性の変化を示す結果を得ることができます。こんにちは、シカゴ大学生物生物学・解剖学部のビクトリア・プリンス研究室のメアリー・キンクルです。
私もプリンスラボのステファニー・エイムズです。今日は、成魚のゼブラフィッシュへの腹腔内注射の手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて血糖値の恒常性制御を研究しています。
それでは始めましょう。魚を注射する準備をするには、まず魚をきれいな水槽に移し、食べ物を断食しないようにします。魚は腸球の内容物を空にするために24時間、血糖値をベースラインレベルまで下げるために72時間。
このプロトコルで使用される密度は、10 から 12 の男女混合人口です。ビー玉の3つの層が付いている9リットルのタンクごとの魚は、大理石がそれらが食べられないように卵を隔離します。タンクを吸い上げて、毎日卵と廃棄物を取り除きます。
次に、124.1ミリモル塩化ナトリウム5.1ミリモル塩化カリウム2.9ミリモルピロリン酸ナトリウム、1.9ミリモルマグネシウム硫酸塩ヘプト水和物、1.4ミリモル塩化カルシウム二水和物11.9ミリモル重炭酸ナトリウム、4グラムのポリビニルルーン、および1000 USP単位のヘパリンを使用して、脱イオン水フィルターで最終容量100ミリリットルまでコートランド塩溶液を調製します。 滅菌し、摂氏4度で保管します。次に、5グラムのグルコースを10ミリリットルのコッチン塩溶液に溶かします。1マイクロリットルあたり0.5ミリグラムのグルコース溶液を作るには、ろ過し、滅菌し、摂氏4度で保存します。
次に、平らな面に柔らかいスポンジを約20ミリメートルの高さにカットして、手術台を準備します。魚を注射するために10〜15ミリメートルの深さのカットを作ります。スポンジを60mmのシャーレにセットし、スポンジ付きのシャーレをP200ピペットチップボックスの蓋にセットします。
次に、顕微鏡のベースをラップとペーパータオルで覆って顕微鏡を準備します。こぼれた場合は、ペーパータオルの上に手術台を置きます。手術台を見てスポンジに焦点を合わせることにより、焦点を事前に調整します。
スポンジの上に指を置き、魚が手術台にあるときの焦点調整を最小限に抑えるために、スポンジに焦点を合わせます。魚の施設の水と涙で約3分の1を満たした500ミリリットルのビーカーで魚の重量を量ります。スケールでは、ビーカーにできるだけ余分な水を入れずに魚を網で移し、重量を記録し、計量した各魚を透明なラベル付きタンクに移します。
重量に基づいて射出量を計算します。この例では、コートランド塩溶液に溶けたブドウ糖の体重1グラムあたり0.5ミリグラムの溶液を注入します。私たちの解決策はマイクロリットルあたり0.5ミリグラムであるため、計算は魚の重み付けグラムの1倍であり、マイクロリットルで注入する容量に等しく、注射器および関連する注射装置を準備します。
このプロトコルは、30 5G斜めのスチールニードル、ウルトラマイクロポンプ、マイクロ4プロセッサ、およびグルコース注射用の10マイクロリットルナノフィルマイクロシリンジを使用し、コートランド塩溶液に溶解したマイクロリットルグルコースあたり0.5ミリグラムをシリンジに充填します。シリンジからすべての気泡を取り除き、シリンジをウルトラマイクロポンプに取り付け、マイクロ4プロセッサの番号付きキーパッドを使用してナノリットル単位で容量を入力して最初の魚の注入量をプログラムすることが重要です。最後に、魚施設の水から作られた角氷を十分に砕いて、氷の麻酔薬を準備します。
アイスバケツをいっぱいにするには、手術台を2.4リットルのゴム製の食品保存容器などの大きな容器に入れます。温かい施設の水を外側の容器と手術台に注ぎます。施設の温水の予備タンクを近くに置いてください。
外側の容器に温度計を取り付けます。麻酔薬の外部容器と手術台を顕微鏡に隣接して置きます。氷の入ったバケツを近くに置いておきます。
水温が摂氏17度になるまで氷片を追加し始めます。このステップでは、摂氏17度を下回らないでください。網を使って魚を外側の容器に移します。
17度またはそれより少し低い温度では、魚は通常、胸鰭を水平に広げ、息を切らし、耳介の動きが速くなります。容器にアイスチップをゆっくりと加え、数分かけて温度を摂氏12度まで下げます。気温が下がると、魚はよりゆっくりと泳ぎ、最終的には泳ぐのをやめます。
最終的にはあえぎ声が止まり、耳介の動きが遅くなります。魚は、取り扱いに反応しないときに注射の準備ができています。必要な温度に達したら、スポンジを押して飽和させます。
指を冷水に十分に入れて、魚を温めて麻酔から出さないようにします。冷たい指で取り扱っている間は、魚をスポンジのトラフにそっと移します。腹部を上にして、えらをトラフに置き、魚を置きます。
手術台を顕微鏡ステージに素早く移します。すばやく作業し、先端がクランを指し、肛門よりも骨盤ガードルに近づくように針を慎重に配置します。骨盤ヒレの間の正中線に針を挿入します。
針が体壁に深く当たっているときに感じることができるはずです。針を差し込むと、体壁が与えるのを感じることができます。針が腹腔に入ったら、マイクロ フォー プロセッサーを使用して適切な量を注入します。
フットペダルを使用して、注射後、魚の体重1グラムあたり1マイクロリットルを注入し、針を取り外し、すぐに魚を温水タンクに戻して回復させます。スポンジから魚を水槽の水の上に放出することにより、顕微鏡で針を確認します。時折、スケールが取り付けられ、次の注射の前に取り外す必要があります。
適切な時間が経過したら、ダウンストリームアッセイに進みます。注射前に血糖値をベースラインレベルまで下げるには、72時間の絶食が必要であることがわかりました。この図では、緑色で示されている非注射制御データは、ここに赤色で示されている車両注入制御と有意差のない血糖値を示しています。
ただし、青い線はブドウ糖を注入した魚の血糖値を示し、循環するブドウ糖の上昇と下降を示しています。時間の経過とともに、注入されたグルコースとビヒクル注射された動物の両方が注射手順中に外科的麻酔下に置かれましたが、注射されていない対照群は外科的麻酔下にありませんでした。今回は、成魚のゼブラフィッシュに腹腔内注射を行う方法をお見せしました。
当研究室では、IPグルコース溶液注入後の様々な時点における血糖値の変化について研究しています。ただし、先ほど示したこの手法は、目的の溶液を注入するために使用できます。この手順を行うときは、魚をゆっくりと麻酔し、優しく扱うことを忘れないでください。
というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この記事では、NanoFilマイクロシリンジと冷水麻酔を使用して、成体のゼブラフィッシュに腹腔内注射を行う手順を示します。この方法は、正確な注射を通じて血糖恒常性の研究を目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 生理学
背景
- 腹腔内注射は、物質を腹腔内に直接送達するために不可欠です。
- ゼブラフィッシュは、代謝プロセスを研究するための価値あるモデル生物です。
- 血糖調節の理解は、代謝障害への洞察に重要です。
- 手順中のストレスを最小限に抑えるために麻酔の使用が必要です。
研究の目的
- ゼブラフィッシュにおける腹腔内注射の信頼できる方法を示す。
- グルコース恒常性とその調節に関する研究を促進する。
- 他の研究所で再現できるプロトコルを提供する。
使用された方法
- 注射量を決定するために、空腹と体重測定によって魚を準備する。
- 注射中の動きを最小限に抑えるため、冷水を使用して魚を麻酔する。
- 正確なマイクロシリンジを使用して、腹腔内にグルコース溶液を注射する。
- 注射後の魚の回復をモニタリングして、手順の影響を評価する。
主な結果
- この手順により、成体のゼブラフィッシュに物質を注射することができます。
- 注射後に血糖レベルを測定して、代謝の変化を研究することができます。
- 魚は手順後によく回復し、使用された麻酔の有効性を示しています。
- 結果は、ゼブラフィッシュにおけるグルコース恒常性の理解を深めることに貢献します。
結論
- この方法は、ゼブラフィッシュの代謝プロセスを研究する研究者にとって価値あるツールを提供します。
- 腹腔内注射は、溶液を送達するための実行可能で効果的な技術です。
- 将来の研究は、このプロトコルを基にして様々な代謝状態を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precise compound delivery in zebrafish enables mechanistic de-risking of metabolic targets by establishing dose-response relationships in a vertebrate system. This approach supports target validation through controlled perturbation of glucose homeostasis, reducing ambiguity in pathway interrogation. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible phenotypic readouts relevant to metabolic disease modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by delivering defined doses to assess target engagement in glucose regulation pathways.
- Operational Value: Provides reproducible compound administration to minimize variability in metabolic phenotype assessment.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through direct measurement of blood glucose changes as a functional readout of metabolic target modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (blood glucose levels) enabling dose-response analysis for lead identification.
- Operational Value: Standardizes injection volume based on fish weight, improving assay reproducibility across experimental batches.
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream metabolic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling glucose homeostasis disruption relevant to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures procedural consistency through standardized fasting, anesthesia, and injection protocols, supporting cross-lab reproducibility.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by isolating the effect of injected compounds from stress-induced glucose elevation via vehicle controls.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing a reliable route for compound administration in zebrafish metabolic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in glucose regulation by enabling precise compound delivery to adult zebrafish.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, weight-based injection volumes that ensure consistent compound exposure.
- Analytics: Generates quantitative blood glucose measurements that allow comparison of metabolic responses across treatment groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of a vertebrate model with conserved glucose homeostatic mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for metabolic phenotype screening across multiple compound series and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in metabolic pathway analysis.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined injection volumes and controlled anesthesia procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clear dose-response data on glucose homeostasis modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated metabolic effects in a whole-organism system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, anesthesia, and microsyringe injection techniques.
- Dependent on access to ultra-micro pumps, NanoFil syringes, and temperature-controlled anesthesia setups.
- Necessitates cross-team standardization of fasting duration, weight measurement, and injection volume calculation.
- Involves adaptation considerations for different compound solubilities and injection volumes in Cortland salt solution vehicle.
- Limited by the technical skill required to maintain gill aeration and avoid injection-site trauma during procedure execution.
