Name: Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶNeu1シアリダーゼ活性検出法で、マクロファージ細胞表面におけるToll様受容体のリガンド結合応答を可視化する。この手法は炎症性疾患の免疫応答メカニズム解明に有用である。

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MRSへの補助金によって部分的なサポートはカナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）、神経科学研究のためのハリーBotterell財団、ARC、およびガーフィールドケリー循環器の研究開発基金からのものです。 SRAは、クイーンズ大学の研究賞とロバートJ.ウィルソンフェローシップの受賞者です。 PJは、女王の大学院賞、ロバートJ.ウィルソンフェローシップの受賞者です。 AGとSAは、女王の大学院賞の受賞者です。 SFは科学技術（OGSST）のオンタリオ大学院奨学金の受け手だった。 AGは、女王のフランクリンブラッケン大学院奨学金の受取人です。 SAは、女王のRS McLaughlinは大学院奨学金の受取人です。

1。復活冷凍マクロファージ細胞<ol><li> -80℃冷凍庫から凍結細胞を復活させる前に、人は10％ウシ胎児血清（FBS）とplasmocin 5μg/ mLのを補充した滅菌濾過したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いて培養液を準備する必要があります。 Plasmocinは、細胞培養のマイコプラズマ汚染を排除し、防止するために私たちの研究で使用される抗生物質溶液です。 </li><li>凍結細胞の1バイアルの場合、一つの4mL、無菌のバイオハザード封じ込めフードで25cm 2の細胞培養フラスコに培養液1 mLを追加します。 </li><li>凍結細胞のバイアルは-80℃の冷凍庫から取られている場合、それらはすぐに約2〜3分かかる滅菌フード、で手で温めることによって解凍されています。 </li><li>とすぐに細胞が融解しているとして、彼らはすぐに1mLの滅菌ピペットを用いて馴化培地を含むフラスコに転送されます。 </li><li>細胞を含むフラスコを37℃、5％CO 2で組織培養インキュベーター内に配置されています。 </li><li>彼らは倒立顕微鏡を用いて75〜90％コンフルエントになるまで細胞が日常的に成長し、遵守をチェック。 </li><li>細胞培養のインキュベーションの間に、12 mm径の円形のガラスのスライドがバイオハザード封じ込めのキャビネットで1時間に大きなガラスのペトリ皿に70％エタノールでそれらをカバーすることによって滅菌され、アルコールが、後で削除しreusageのために保管し、ウェットガラスの両側れで24時間またはそれらが乾燥しているまで、UV下キャビネットの滅菌濾過空気の流れにさらさ残されています。 </li></ol> 2。シアリダーゼのアッセイのためのめっきセル<ol><li>細胞を播種する前に、一つの滅菌円形ガラススライドは慎重にBDファルコンの1つのウェルで24ウェル平底滅菌炎完全な曲線を使って蓋組織培養処理されたポリスチレンプレート、4&quot;、鋸歯状、ステンレス鋼forcepで配置され。75％コンフルエントの細胞の1つのフラスコでは、通常、培養プレートの12ウェルを使用してください。 </li><li>接着マクロファージ細胞の場合は、DMEM条件培地を滅菌封じ込めのキャビネットに5 mLの滅菌ピペットを用いてフラスコから削除されます。任意の血清含有培地を除去し、カルシウム培地フリー（CMF）リン酸1 mLを追加するには、生理食塩水pH7.4をバッファ1X滅菌トリスで一度付着細胞を洗浄し、細胞をカバーするのに十分なpH7.4の緩衝食塩水。細胞がフラスコで離陸を開始するまで、細胞は約10分間または37℃のインキュベータ内に配置されています。フラスコを軽く揺り動かしたり、残りの接着細胞を緩めるために振とうすることができます。 </li><li>フラスコ内の細胞懸濁液を1 mLに、DMEMの条件培地3 mLを加える。細胞懸濁液0.5 mLをとり、滅菌12ミリメートルの円形のガラスのスライドを含む組織培養プレートにそれらを転送する。約、0.5 × 10 6細胞は円形のガラスのスライドに転送されます。 </li><li>細胞を含む組織培養プレートは、細胞が円形のスライドガラスに付着することができるようにするために、37℃で24時間、5％CO 2のCでインキュベートする。 </li></ol> 3。シアリダーゼアッセイ 1。コントロールの作成<ol><li>最後に、4 MUNANAの1μLDAKO + 1μLと+：顕微鏡スライド（つや消し：1終了、1slide、25 × 75 × 1mm）の置いて封じ込め、キャビネットまたはラボのベンチでをと順番に混合することにより、以下の化合物を追加します。トリスの3μLは、生理食塩水pH7.4の（TBS）をバッファ。 </li><li>よく細胞を含むいずれかからメディアを削除した後、優しくものコーナー〜4&quot;forcepの円形ガラススライドを持ち上げます。慎重forcepでガラススライドを削除し、上の混合溶液に直面している細胞をスライドに配置顕微鏡のスライド。 </li><li>すぐに、UVフィルタに設定されていると蛍光画像をキャプチャするためのデジタルカメラを持っている落射蛍光顕微鏡にmicrocopeのスライドを取る。 </li><li>もし蛍光灯モードに切り替えてセルを参照してできるようになるまで位相コントラストの下顕微鏡フォーカス。 1分、2分、3分で蛍光灯の下での細胞の写真を撮る。位相コントラスト下で細胞の単一の写真を撮る。 </li></ol> 2。正のテストを行って<ol><li> LPSの4 MUNANA + 2μL+ TBSの1μLの1μLDAKO + 1μL：別の顕微鏡スライド上に順番に以下の化合物を見つける。 </li><li>上記の手順3.1.2に3.1.4を繰り返します。 </li></ol> 3。ノイラミニダーゼ阻害剤タミフルと一緒に正のテストを作る<ol><li> 1μLDAKO +1μLLPSの4 MUNANA + 2μL+タミフルの1μLの：別の顕微鏡スライド上で、次の順番で以下の化合物を見つける。 </li><li>円形のガラススライド上に生きている細胞と接触する化合物の最終濃度が5の希釈係数を持つ、タミフルの濃度は、生理食塩水pH7.4をバッファ1Xトリスにあらかじめ用意されています。 </li><li>上記の手順3.1.2に3.1.4を繰り返します。 </li></ol> 4。シアリダーゼ活性を50％抑制するのに必要な阻害剤の濃度の決定（IC 50） <ol><li>細胞を取り巻く蛍光を定量するために、画像がRBGを測定するための分析プラグインでImageJを1.38xを使用して分析している。細胞を取り巻く蛍光の50ランダムスポット測定値を取ると、総蛍光の平均値を計算する。 </li><li> IC 50は、非線形回帰を用いてy軸上の平均の蛍光に対してx軸上（例えば、ログng / mL）の対数単位として変換阻害剤の濃度のプロットから生成されます。 </li></ol> 5。成功の秘訣<ol><li>培養中の細胞がマイコプラズマのコンタミであることを確認してください。我々は日常的にこれを制御するための培養液中でPlasmocinを使用してください。 </li><li>人工的なノイラミニダーゼ基質、4 MUNANAは、作りたての使用する必要があります。調製した基質は、シアリダーゼのアッセイのための週間以内に使用することができます。 </li><li>細胞株は、細胞表面上の低受容体の発現がある場合、人は刺激のための配位子の高用量を使用することができます。 </li><li>我々はまた、6回以上にわたって継代細胞はその受容体の表現型が失われる可能性があることを経験している。たての、復活の細胞を培養する必要があります。 </li></ol> 6。代表的な結果添付の代表的な結果とシアリダーゼアッセイのアニメーションプロトコルを参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">PowerPointファイルを</a> 。

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

SRAとPJは第一著者として平等に貢献した。

ライブマクロファージ細胞2でシアリダーゼ活性を検出するために新しく開発されたアッセイを使用して、我々としても、ライブDC - 2.4樹状細胞の用量依存的にライブBMC - 2マクロファージ細胞におけるリガンド誘発性シアリダーゼ活性のシアリダーゼ活性を検出するためにこの技術を使用し、HEK-TLR4/MD2、HEK293、SP1乳腺腺癌細胞、ヒトWTおよび1140F01とWG0544 I型sialidosis線維芽細胞。タミフルなどのノイラミニダーゼ阻害剤（リン酸オセルタミビル）は、ノイラミニダーゼ阻害剤DANA（2 -デオキシ-2,3 -デヒドロ-のための19.17μMのIC 50と比較して0.0194μMのIC 50でライブBMC - 2細胞におけるthymoquinone誘発性シアリダーゼ活性を阻害したDN -アセチルノイラミン酸）5。我々はまた、特定の抗Neu1、-2および3抗体などの他のアプリケーションが実稼働中BMC - 2と人間のTQ -誘導シアリダーゼ活性の阻害THP - 1マクロファージ細胞を持たないことが報告されているが、抗Neu4...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation 蛍光封入剤</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>タミフル (オセルタミビルリン酸塩)</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

toll様受容体の活性化を調節するのneu1シアリダーゼ活性の検出

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

哺乳類のToll様受容体（TLR）は病原体関連分子パターンを認識する受容体ファミリーです。だけでなく、TLRは微生物の重要なセンサー（例えば、ウイルス、細菌および寄生虫）感染症である、彼らはまた、おそらく自己免疫疾患で感染症、炎症性疾患、との病態生理に重要な役割を果たす。このように、感染症に対するTLR応答の強度と持続時間は厳密に管理する必要があります。それはセンサーの受容体の構造的完全性を理解すること、次の、そのリガンドの相互作用とシグナル伝達成分は、その後の免疫学的防御のために不可欠です。また、センサーの操作による疾患修飾のための重要な機会を提供するであろう。 TLRのセンサーのシグナル伝達経路はよく特徴付けされていますが、センサーとそのリガンドとの相互作用を制御するパラメータは、まだ明らかにされないままである。我々は最近、以前に1,2を観察されていない、その天然のリガンドによるTLRの活性化の新たなメカニズムを同定した。それは、リガンド誘導TLRの活性化が密接にNeu1シアリダーゼの活性化によって制御されていることを示唆している。我々はまたNeu1がしっかりNeu1とマトリックスメタロプロテイナーゼ-9（MMP - 9）受容体4との複合体におけるクロストークを含むであるTrkAとTrkB 3などのニューロトロフィン受容体に、調節していることを報告している。シアリダーゼのアッセイは、最初はGPCRGαiタンパク質およびMMP - 9の5を介してマクロファージ、樹状細胞と線維芽細胞の細胞表面上Neu4シアリダーゼの活性化で、小説リガンド、thymoquinoneを見つけるために使用されています。 TLR受容体のために、我々のデータはNeu1シアリダーゼはTLR - 2、-3および-4受容体との複合体に既に存在し、いずれかの受容体へのリガンドの結合によって誘導されることを示している。 TLR - 4量体化、MyD88/TLR4複​​雑な募集、NFkBの活性化​​および炎症誘発性細胞応答に立体障害を除去するために結合するリガンドから遠いNeu1シアリダーゼ加水分解シアリルα- 2、3 - リンクされているβ-ガラクトシル残基を活性化。共同報告書では、Neu1シアリダーゼはマクロファージの細胞6食作用を調節することが示されている。一緒になって、シアリダーゼのアッセイは、リガンド誘導性受容体の活性化の分子メカニズムへの強力な洞察を提供してくれました。 Neu1シアリダーゼとTLRの活性化との間の正確な関係は、TRK受容体がまだ完全に解明されているものの、それは細胞調節経路に新しいまたは先駆的なアプローチを表すことになります。

シアリダーゼのアッセイは、微生物感染と生マクロファージの細胞表面の受容体レベルでの炎症性疾患への関与のTLRセンサの新しい分子機構（s）を解明する簡単な技術的なアプローチです。

Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出

哺乳類のToll様受容体（TLR）は、病原体関連分子パターンを認識する受容体ファミリーである。TLRは……の極めて重要なセンサーであるだけでなく、

本実験の全体的な目的は、特異的受容体へのリガンド結合に応答した細胞内new one sase活性の誘導を評価することである。まず、24ウェル組織培養プレート内の12 mm円形ガラススライド上で細胞を24時間培養する。次に、ガラススライドに接着した生細胞を、あらかじめ調製したsase基質と受容体リガンドの混合液（特異的阻害剤の有無を条件とする）に、顕微鏡スライド上で直接接触させる。蛍光画像を可視化しデジタル的にキャプチャするため、顕微鏡スライドを直ちに蛍光顕微鏡下に配置します。時間の経過とともに結果が得られます。これにより、エピ蛍光顕微鏡下で細胞周囲の青色蛍光強度に基づいた、リガンド処理した生細胞における細胞表面のニューロナシン活性の変化が示されます。分光光度分析などの既存の手法と比較して、本手法を用いる主な利点は、使用する試薬量を削減できることです。また、生細胞内でのsase活性を観察し、画像をキャプチャすることも可能です。この手法は、潜在的に新規であるリガンド・受容体相互作用の検討や、特定の酵素またはタンパク質阻害剤が受容体活性化に及ぼす影響の検討など、免疫学分野における重要な課題の解明に利用できます。本手順の実演は、私の研究室の元博士課程学生であり、研究において本アッセイを用いているRay Amit博士とPT Gath博士が担当します。凍結保存されたマクロファージ細胞を復元する前に、滅菌ろ過済みのDulbecco's Modified Eagle's Mediumに10% fetal bovine serumと5 µg/mLの抗生物質penicillin-streptomycinを添加し、培地を調製します。次に、凍結細胞1バイアルにつき4 mLの培地を25 cm²の細胞培養フラスコに加えます。凍結細胞のバイアルを-80 °Cのフリーザーから取り出し、滅菌バイオハザード containment hood内で手温により速やかに融解させます。この操作には約2〜3分かかります。細胞が解凍され次第、1 mL滅菌ピペットを使用して、条件化培地を含む細胞培養フラスコに速やかに移します。細胞が入ったフラスコを、倒立顕微鏡を用いて37 °C、5% carbon dioxideの組織培養インキュベーター内に配置します。SASEアッセイのための細胞播種を行う数日前まで、細胞の増殖と接着状態を毎日確認し、コンフルエンシーが75%から90%になるまで待ちます。細胞を播種するための直径12 mmの円形ガラススライドを、バイオハザード対策キャビネット内で準備します。スライドを大きなガラス製ペトリ皿に入れ、100% ethanolに1時間浸漬して滅菌します。アルコールを除去し、濡れたガラススライドをキャビネット内のUV照射下で、滅菌フィルタを通した気流にさらして24時間、またはプレート

detection-neu1-sialidase-activity-regulating-toll-like-receptor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、マクロファージにおける転写因子核因子-κ-B(NF-κB)および活性化因子タンパク質-1(AP-1)のToll様受容体(TLR)依存性活性を調べるアッセイを示しています。TLRは、損傷関連分子パターン(DAMP)を認識すると炎症誘発性シグナル伝達カスケードをトリガーし、NF-κBおよびAP-1を活性化します。遺伝子操作されたレポーターマクロファージは、NF-κBおよびAP-1の活性化により分泌された胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)酵素を産生し、これは発色反応によって検出されます。...

マクロファージにおけるTLR依存性NF-&kcy;B/AP-1転写因子シグナル伝達のアッセイ

このビデオは、Toll様受容体(TLR)シグナル伝達を阻害する可能性のある生理活性ナノ粒子をスクリーニングするためのレポーター細胞ベースのアッセイを示しています。このアッセイでは、ペプチド-金ナノ粒子ハイブリッドと混合したリポ多糖(LPS)を、レポータータンパク質(分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)およびルシフェラーゼ)を発現するレポーターマクロファージに導入します。ハイブリッドによって媒介されるLPS誘導TLR信号の減少は、レポーター信号を測定することによって決定されます。...

Toll様受容体シグナル伝達阻害のための生理活性ナノ粒子のスクリーニングアッセイ

樹状細胞（DC）は、ニゲリシンとNLRP3ソーム活性化に続いて、合成プリン、R848のTLR8認識に応答してIL-1βを分泌し、したがって、IL-1βはNLRP3ソーム活性を測定するために使用することができる。細胞内サイトカイン染色、イムノブロッティング、およびELISAを正確にIL-1βの発現を介してNLRP3ソームプライミングおよび活性化を測定するために使用される。...

ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

我々は、マウス肝臓および牛乳中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルウラミン酸の定量のためのHPLCベースの方法を記載する。...

野生型および肝臓の肝臓試料および牛乳試料中のシアル酸の定量<em&gt; CMAH</em&gt;ノックアウトマウス。

Toll様受容体（TLR）シグナル伝達は、多くのヒト炎症性疾患の病態生理学において重要な役割を果たし、生物活性ナノ粒子によるTLR応答の調節は、多くの炎症状態において有益であると予想される。 THP-1細胞ベースのレポーター細胞は、TLRシグナル伝達の新規インヒビターを同定するための多目的で堅牢なスクリーニングプラットフォームを提供する。...

トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング

MALT1 免疫を調節するが、不明確のままどのようにこれが発生します。MALT1 の生得的なシグナリング Toll 様や C 型レクチン様受容体、MALT1 が骨髄性サイトカインの生産を調節することを示すの下流と下流への貢献を解明する選択的 MALT1 paracaspase 阻害剤 MLT 827 を使いました。C...

MALT1 Paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御

このプロトコルは、生体材料インプラント微小環境をモデル化する様々なポリマー表面および吸着タンパク質層に応答して、マウスマクロファージ細胞株におけるTLR依存性NF-аb/AP-1転写因子活性を測定する迅速かつ間接的な方法を研究者に提供する。...

高分子表面上の吸着タンパク質層におけるトール様受容体媒介NF-kB/AP-1シグナル伝達を調べるマクロファージレポーター細胞アッセイ

このプロトコルは異なったシグナリング細道からの機能をカバーするスクリーニング方法として使用されるべき一組の好中球の機能試金を特色にする。プロトコルは好中球の細胞外トラップの細胞生存率、純度、活性酸素種の生産、実時間移動、食作用および予備の提案の初期および簡単な評価を含んでいる。...

好中球機能の概要を把握するための一連のスクリーニング技術

シアリダーゼ処理を使用して、単離された末梢血単核細胞(PBMC)から脱シアル化ヒト単球由来樹状細胞(mo-DC)を生成するための独自の包括的なプロトコルが提示されます。さらに、mo-DCの表現型および機能特性を評価し、シアリダーゼ処理がmo-DCの成熟レベルをどのように改善するかを評価する方法が記載されている。...

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

ここでは、代謝オリゴ糖工学、クリックケミストリー、および増殖顕微鏡法を組み合わせたシンプルなプロトコールを提案し、日常的な顕微鏡装置を使用して細胞内シアル化...

Click Chemistry and Expansion Microscopyによる細胞内シアル化の可視化

学ぶNeu1シアリダーゼ活性検出法で、マクロファージ細胞表面におけるToll様受容体のリガンド結合応答を可視化する。この手法は炎症性疾患の免疫応答メカニズム解明に有用である。

Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出

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