Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出

本実験の全体的な目的は、特異的受容体へのリガンド結合に応答した細胞内new one sase活性の誘導を評価することである。まず、24ウェル組織培養プレート内の12 mm円形ガラススライド上で細胞を24時間培養する。次に、ガラススライドに接着した生細胞を、あらかじめ調製したsase基質と受容体リガンドの混合液（特異的阻害剤の有無を条件とする）に、顕微鏡スライド上で直接接触させる。

蛍光画像を可視化しデジタル的にキャプチャするため、顕微鏡スライドを直ちに蛍光顕微鏡下に配置します。時間の経過とともに結果が得られます。これにより、エピ蛍光顕微鏡下で細胞周囲の青色蛍光強度に基づいた、リガンド処理した生細胞における細胞表面のニューロナシン活性の変化が示されます。

分光光度分析などの既存の手法と比較して、本手法を用いる主な利点は、使用する試薬量を削減できることです。また、生細胞内でのsase活性を観察し、画像をキャプチャすることも可能です。この手法は、潜在的に新規であるリガンド・受容体相互作用の検討や、特定の酵素またはタンパク質阻害剤が受容体活性化に及ぼす影響の検討など、免疫学分野における重要な課題の解明に利用できます。

本手順の実演は、私の研究室の元博士課程学生であり、研究において本アッセイを用いているRay Amit博士とPT Gath博士が担当します。凍結保存されたマクロファージ細胞を復元する前に、滅菌ろ過済みのDulbecco's Modified Eagle's Mediumに10% fetal bovine serumと5 µg/mLの抗生物質penicillin-streptomycinを添加し、培地を調製します。次に、凍結細胞1バイアルにつき4 mLの培地を25 cm²の細胞培養フラスコに加えます。凍結細胞のバイアルを-80 °Cのフリーザーから取り出し、滅菌バイオハザード containment hood内で手温により速やかに融解させます。

この操作には約2〜3分かかります。細胞が解凍され次第、1 mL滅菌ピペットを使用して、条件化培地を含む細胞培養フラスコに速やかに移します。細胞が入ったフラスコを、倒立顕微鏡を用いて37 °C、5% carbon dioxideの組織培養インキュベーター内に配置します。

SASEアッセイのための細胞播種を行う数日前まで、細胞の増殖と接着状態を毎日確認し、コンフルエンシーが75%から90%になるまで待ちます。細胞を播種するための直径12 mmの円形ガラススライドを、バイオハザード対策キャビネット内で準備します。

スライドを大きなガラス製ペトリ皿に入れ、100% ethanolに1時間浸漬して滅菌します。アルコールを除去し、濡れたガラススライドをキャビネット内のUV照射下で、滅菌フィルタを通した気流にさらして24時間、またはプレート作成に適した状態まで乾燥させます。まず、4インチの湾曲した鋸歯付きステンレス製ピンセットを火炎滅菌します。

次に、ピンセットを使用して、滅菌済みの円形ガラススライドを24ウェル平底組織培養処理ポリスチレンプレートの各ウェルに1枚ずつ慎重に配置します。5 mLの滅菌ピペットを用いて、接着性マクロファージ細胞が入ったフラスコからDMEM条件付き培地を除去します。1x 滅菌 Tris 緩衝生理食塩水 (pH 7.4) で細胞を1回洗浄し、血清を含む培地を取り除きます。

次に、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水（カルシウム含有、リン酸不含）を1 mL加えます。細胞を37 °Cのインキュベーターに約10分間、または細胞がフラスコから剥離し始めるまで置きます。細胞が剥離したら、懸濁した細胞にDMEM調整培地を3 mL加えます。

次に、約0.5 million個の細胞を含む懸濁液0.5 millilitersを、24ウェルプレート内の各12 millimeter円形ガラススライドに分注します。マクロファージ細胞を含む組織培養プレートを37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートし、細胞を円形ガラススライドに接着させます。sase活性のアッセイは、3枚の個別の顕微鏡スライドを用いて、3つの異なる条件下で実施します。陰性対照として用いる1枚目のスライドでは、

コントロール細胞を封入剤、ANA用ニューラミニダーゼ基質、およびトリス緩衝生理食塩水にさらしますが、 Toll様受容体リガンドであるLPSは添加しません。2枚目のスライドでは、細胞を封入剤、ANA、Toll様受容体リガンドであるLPS、およびトリス緩衝生理食塩水にさらします。

3枚目のスライドでは、細胞をANA、LPS Tris、緩衝生理食塩水、およびニューラミニダーゼ阻害剤のTamifluを含む封入剤にさらします。3つのアッセイは顕微鏡スライド上の化合物の混合内容のみが異なるため、ここでは2番目のアッセイの手順のみを説明します。顕微鏡スライドをラボベンチに置き、以下の化合物を順番に添加してください。

封入剤を1 µL、続いてForm（固定液）を1 µL、次にLPSを2 µL、最後にpH 7.4のTris緩衝生理食塩水を3 µL加えます。次に、細胞が入った24ウェルプレートの1ウェルから培地を除去します。次のステップは、4インチのピンセットを用いて、組織培養プレートのウェルから円形のガラスカバースリップを割らずに回収する必要があるため、本手順の中で最も困難な工程となります。

円形のガラススライドをウェルの端までそっと持ち上げ、慎重に取り出して、細胞面を下にして溶液混合物の中に配置します。顕微鏡スライドを、UVフィルターに設定され、蛍光画像撮影用のデジタルカメラを備えたエピ蛍光顕微鏡へすぐに運びます。位相差顕微鏡下で細胞が見えるまで焦点を合わせ、その後、蛍光モードに切り替えます。

蛍光モードにて、1分後、2分後、および3分後の細胞画像を撮影します。さらに、位相差像で細胞の画像を1枚撮影します。ここでは、saseアッセイ実験の結果を示します。

まず、ネガティブコントロールとして、ガラススライドに接着させた生細胞を、封入剤とフォーム基質（IP sase活性が存在する場合）のスポット混合液に直接接触させました。基質が加水分解されると遊離のエチルルミノンが生成され、365 nanometersで励起後、450 nanometersで蛍光放出を示します。基質の添加から2分後に測定を行いました。

この蛍光画像では、細胞周囲にSASE活性は認められません。次の画像は、ガラススライドに接着させた生細胞を、封入剤、基質、およびTLR4リガンドであるLPSのスポット混合物に直接接触させた、SASEアッセイの陽性試験の結果を示しています。基質がSASE酵素によって加水分解されて遊離のエチルルミブオンが生成され、基質とLPSを添加して2分後に撮影した蛍光画像は、細胞周囲に高いレベルのSASE活性があることを示しています。

しかし、生細胞を、ナノ基板、TLR4リガンドであるLPS、およびニューラミニダーゼ阻害剤であるタミフルを含む封入剤のスポット混合物と直接接触させたところ、阻害剤の濃度に応じて、sase活性が大幅に低下したか、あるいは検出されなくなりました。最後に、このグラフは、薬剤濃度の対数に対してsase活性の低下をプロットして決定した、タミフルおよびオセルタミビルカルボキシレートの50%阻害濃度を示しています。各群の細胞周囲の平均蛍光強度は、Image Jソフトウェアを用いて測定されました。この手順を行う際は、Sadeアッセイを開始する24時間前に、24ウェル組織培養プレート内の円形ガラスカバースリップ上で細胞を培養しておくことが重要です。

さらに、本アッセイで使用するすべての試薬は、アッセイを開始する前に調製しておく必要があります。