Name: 細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学ぼう、細胞収縮を定量化するための柔軟な細胞外マトリックス基板の作製法。ポリアクリルアミドゲルとトラクション力顕微鏡法を用いて、ECM剛性が細胞挙動に与える影響を解析する手法です。

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我々は、細胞牽引力の定量化（Sabass ら 、2008）で使用されている計算ソフトウェアを追跡するためのウルリッヒシュワルツの研究室に感謝。この作業は、SPの冬にMLガルデルとメディカルサイエンティストナショナルリサーチサービス賞（5 T32 GM07281）にバローズウェルカムのキャリア賞とNIH Directorのパイオニア賞（DP10D00354）によってサポートされていました。

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

手順は、計算追跡ルーチン（Sabass ら 、2008）の実装と共に、トラクション力顕微鏡（TFM）の実験のセットアップのためにここで説明する、ミクロンスケールの空間分解能での細胞の力の定量化が可能になります。実験的なプロトコルを最適化するために、それはECMの配位子の均一なコーティングで、純粋で均一なゲル基材を形成することが重要です。我々は、以下の潜在的な落とし穴について説明します。 不均一なゲルの表面や涙。 我々の経験では、素敵な均一なゲルを形成するために重要現れるいくつかの手順があります。あなたのゲルの表面がそれに暗い穴があるように見える場合、それは反対重合するためにあなたのゲルの不均一な疎水性表面を形成し、過剰な雨- Xの液滴が完全にガラスのスライドから削除されていなかった可能性があります。また、我々は非常に柔らかいゲルに（&lt;100 Pa）を、ゲルの表面に起因する制約カバーの表面に付着したPAAゲルの膨潤に非常に不均一になることを発見した、この影響を最小化する一つの方法は、適当な緩衝液に水を交換するこ...

<table><tbody><tr><td>3-アミノプロピルトリメトキシシラン</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>40% アクリルアミド</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% ビス-アクリルアミド</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>40nm 蛍光マイクロクロスフィア</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>共焦点イメージングチャンバー (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラススピナー</td><td>自作</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>紫外線ランプ CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製ラック</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>ヒドラジン水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>メタ periodate ナトリウム</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス (#1.5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

細胞外マトリックス（ECM）に対する細胞接着の調節は、細胞遊走およびECMリモデリングに不可欠です。接着斑は、そのECMに結合収縮F -アクチンの細胞骨格の高分子アセンブリです。この接続は、基礎となる基板に細胞膜を通過する細胞内の機械的な力の伝達が可能になります。最近の研究は、ECMの機械的性質は、接着斑とF -アクチンの形態だけでなく、細胞の分化、分裂、増殖と移動を含む多くの生理学的プロセスを調節示している。従って、細胞培養基板の使用は、正確に制御し、ECMの機械的特性を調節することがますます普及している方法となっている。 接着細胞の接着斑での牽引力を定量化するために、準拠した基板は、高分解能イメージングと法と呼ばれるトラクション力顕微鏡（TFM）の計算手法と組み合わせて使用​​されています。この手法は、細胞の収縮によって誘発される基板の変形の局所大きさと方向の測定値に依存しています。蛍光標識タンパク質の高分解能蛍光顕微鏡と組み合わせることで、それは牽引力と細胞骨格の組織とリモデリングを相関させることが可能です。 ここでは、細胞収縮を測定するのに適している十分に特徴付け、調整可能な機械的剛性、ある細胞培養基板を作成する目的のための二次元、準拠したマトリックスの調製のための詳細な実験プロトコルを提示する。これらのプロトコルは、ポリアクリルアミドハイドロゲルの製造、そのようなゲル上にECMタンパク質のコーティング、ゲル上のめっきセル、および灌流チャンバーを用いた高分解能共焦点顕微鏡などがあります。さらに、我々は引用TFMプロトコルを使用して、細胞の力の位置と大きさを示すデータの代表的なサンプルを提供しています。

このビデオでは、我々は細胞培養に適した準拠、細胞外マトリックス（ECM）コーティングされた基材を作製するために使用される実験技術を実証し、牽引力顕微鏡に適していると、細胞の挙動にECMの剛性の影響を観察している。

細胞外マトリックス（ECM）への細胞接着の調節は、細胞遊走およびECMリモデリングに不可欠である。焦点接着は...

この手順の全体的な目的は、細胞収縮の調節および定量化のためのコンプライアントなマトリックスを作成することです。まず、カバースリップを活性化してマトリックスを固定できるようにします。次に、活性化したカバースリップ上にポリアクリルアミドゲルを重合させます。手順の第3ステップは、細胞をゲル上に播種し、接着させることです。手順の最終ステップは、トラクションフォースマイクロスコピー（牽引力顕微鏡法）のプロトコルで解析するためのデータを生成するために、ゲルのイメージングを行うことです。最終的に、トラクションフォースマイクロスコピーを通じて、細胞がマトリックスに牽引力を及ぼしていることを示す結果を得ることができます。こんにちは。シカゴ大学物理学部および生物物理ダイナミクス研究所のMargaret ELL研究室のYvonne Eonsです。同じくGuard研究室のSteven Winterです。本日は、細胞収縮を測定するためのコンプライアントマトリックスの作製手順についてご紹介します。当研究室では、収縮性アクチン・ミオシンネットワークを研究するためにこれらの手順を用いています。それでは始めましょう。カバーガラスの活性化を行う前に、あらかじめ22 × 40 mmのNo.1.5カバーガラスを数枚用意します。カバースリップが互いに間隔を空け、接触しないようにステンレス製ラックに並べ、70% ethanolで洗浄します。化学薬品用ドラフトチャンバー内で、正方形のガラス皿にisopropanolで調製した2% three or minor profile trimeth溶液を用意します。ガラス製パステールピペットを使用して、three or minoro profileを添加します。プラスチックとの反応性があるため、カバーガラスをこのトリメトキシ溶液に完全に浸し、ドラフト内のスターラープレートで攪拌しながら10分間インキュベートします。浸漬後、二回蒸留水に浸してカバーガラスを洗浄します。水を4回交換し、最後の交換後の水を使用します。攪拌しながら10分間浸漬させます。その後、約37 °Cのインキュベーターでカバーガラスを10分間乾燥させます。乾燥後、室温まで冷却させてください。カバーガラスを、二回蒸留水で調製した1% Glutaraldehyde溶液に浸します。撹拌機上のガラス製正方形ディッシュを用い、30分間浸漬させてください。その際、必ず清潔なディッシュを使用してください。そうしないと、その後で溶液が濁る場合があります。カバーガラスを、攪拌しながら二回蒸留水で3回、1回につき10分間洗浄します。次に、ホコリが付着するのを防ぐためにカバーガラスをアルミホイルで覆い、室温で乾燥させます。乾燥後、カバーガラスはホコリのない乾燥した場所に最大2か月間保存します。ポリアクリルアミド（PAA）

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々はinvadopodia媒介マトリックス分解を可視化するための蛍光ゼラチンでコーティングされた顕微鏡のカバーガラスを製造するためのプロトタイプ的な方法を説明します。利用可能なソフトウェアを使用した計算手法は混合集団内および全体の顕微鏡視野を取り囲む多のグループに、単一細胞によるマトリックス分解の結果のレベルを定量化するために表示されている。...

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

このビデオでは、ECIS(Electrical Cell-Substrate Impedance...

In VitroでのSMC収縮の測定:電気細胞-基板インピーダンスセンシングを使用して平滑筋細胞の収縮を評価するための非侵襲的方法

このプロトコルは、 インビトロで筋細胞の収縮性を測定するための柔軟な培養表面としてマイクロスケールのシリコンカンチレバーの使用を記載している。細胞収縮を測定記録し、 インビトロで収縮機能を測定するための非侵襲的かつスケーラブルなシステムを提供し、力の読み取り値に変換することができるカンチレバー屈曲を引き起こす。...

携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用体外

ここでは、上皮間葉転換を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するためのゲル収縮アッセイの開発と応用について説明します。...

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

細胞分化は、マトリックス組成物と基板材料の特性の両方を含む微小環境因子の宿主によって調節されます。ここでは細胞分化および微小環境のコンテキストの関数としての生体力学的な細胞 - 基質相互作用の両方を評価するための牽引力顕微鏡と組み合わせて、細胞マイクロアレイを利用した技術が記載されています。...

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

ウサギ心筋細胞におけるGtACR1活性化の電気機械効果を評価するプロトコルを提示する。細胞分離、培養、アデノウイルス伝達、パッチクランプ、炭素繊維技術による機能実験に関する詳細な情報を提供します。...

光遺伝学的変調型心筋細胞活性の電気機械評価

本稿では、初代患者特異的なヒト大動脈平滑筋細胞および皮膚線維芽細胞を単離および培養するための外植培養ベースの方法について説明する。さらに、細胞収縮の測定およびその後の分析のための新規な方法が提示され、これはこれらの細胞における患者特異的な差異を研究するために使用することができる。...

原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

この研究は、蛍光タンパク質マイクロパターンの可視化された変位に基づいて単一細胞収縮力の単純化されたハンズオフ定量化のために、マイクロウェルフォーマットで蛍光標識エラストマー収縮性表面(FLECS)技術を利用するための柔軟なプロトコルを提示する。...

マイクロパターンエラストマーを使用したシングルセル収縮性の簡素化されたハイスループット分析

ヒトiPS細胞由来心筋細胞の収縮機能や細胞完全性の変化の解析は、非臨床医薬品開発にとって非常に重要です。ハイブリッド96ウェル細胞解析システムは、両方のパラメータをリアルタイムかつ生理学的な方法で処理し、臨床段階への安全な移行に必要な信頼性の高いヒト関連の結果を実現します。...

前臨床心臓リスク評価のためのヒトiPS細胞由来心筋細胞の構造・収縮変化評価のためのハイブリッド細胞解析システム

このプロトコルはMyoBLAZERシステム、前臨床開発の間にcontractilityの薬物誘発性の変更を評価するための信頼できるプラットホームのドナーの中心からの大人の人間の原発性心筋細胞のcontractilityを測定する方法を記述する。...

単離された成人ヒト一次心筋細胞における心臓収縮性の測定

学ぼう、細胞収縮を定量化するための柔軟な細胞外マトリックス基板の作製法。ポリアクリルアミドゲルとトラクション力顕微鏡法を用いて、ECM剛性が細胞挙動に与える影響を解析する手法です。

細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

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