細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

この手順の全体的な目的は、細胞収縮の調節および定量化のためのコンプライアントなマトリックスを作成することです。まず、カバースリップを活性化してマトリックスを固定できるようにします。次に、活性化したカバースリップ上にポリアクリルアミドゲルを重合させます。

手順の第3ステップは、細胞をゲル上に播種し、接着させることです。手順の最終ステップは、トラクションフォースマイクロスコピー（牽引力顕微鏡法）のプロトコルで解析するためのデータを生成するために、ゲルのイメージングを行うことです。最終的に、トラクションフォースマイクロスコピーを通じて、細胞がマトリックスに牽引力を及ぼしていることを示す結果を得ることができます。

こんにちは。シカゴ大学物理学部および生物物理ダイナミクス研究所のMargaret ELL研究室のYvonne Eonsです。同じくGuard研究室のSteven Winterです。本日は、細胞収縮を測定するためのコンプライアントマトリックスの作製手順についてご紹介します。

当研究室では、収縮性アクチン・ミオシンネットワークを研究するためにこれらの手順を用いています。それでは始めましょう。カバーガラスの活性化を行う前に、あらかじめ22 × 40 mmのNo.1.5カバーガラスを数枚用意します。

カバースリップが互いに間隔を空け、接触しないようにステンレス製ラックに並べ、70% ethanolで洗浄します。化学薬品用ドラフトチャンバー内で、正方形のガラス皿にisopropanolで調製した2% three or minor profile trimeth溶液を用意します。ガラス製パステールピペットを使用して、three or minoro profileを添加します。

プラスチックとの反応性があるため、カバーガラスをこのトリメトキシ溶液に完全に浸し、ドラフト内のスターラープレートで攪拌しながら10分間インキュベートします。浸漬後、二回蒸留水に浸してカバーガラスを洗浄します。水を4回交換し、最後の交換後の水を使用します。

攪拌しながら10分間浸漬させます。その後、約37 °Cのインキュベーターでカバーガラスを10分間乾燥させます。乾燥後、室温まで冷却させてください。

カバーガラスを、二回蒸留水で調製した1% Glutaraldehyde溶液に浸します。撹拌機上のガラス製正方形ディッシュを用い、30分間浸漬させてください。その際、必ず清潔なディッシュを使用してください。

そうしないと、その後で溶液が濁る場合があります。カバーガラスを、攪拌しながら二回蒸留水で3回、1回につき10分間洗浄します。次に、ホコリが付着するのを防ぐためにカバーガラスをアルミホイルで覆い、室温で乾燥させます。

乾燥後、カバーガラスはホコリのない乾燥した場所に最大2か月間保存します。ポリアクリルアミド（PAA）ゲルを調製するには、まずRIプロトコルに従い、40% アクリルアミドと2% ビスアクリルアミドを用いてアクリルアミド・ビスのアクリルアミドミックスストック溶液を作成します。

真空チャンバー内でアクリルアミド溶液を20分間脱気します。これによりゲル内の酸素が除去され、重合の阻害が防止されます。その間に、10%過硫酸アンモニウム（APS溶液）を調製します。

次に、1×3インチの顕微鏡用ガラススライドをRain-Xワイプで拭き、スライド表面を疎水化させます。ゲル表面を滑らかにするため、キムワイプでほこりを取り除きます。スライドをアルミホイルで覆い、置いておきます。

次に、真空チャンバーからアクリルアミド溶液を取り出し、蛍光ビーズを加えます。ゲルの重合を開始させるために、0.75 µLのTM Eと2.5 µLの10%a PSを加えます。ピペッティングにより溶液を軽く混ぜ合わせます。次に、あらかじめ準備した疎水性顕微鏡スライドに、アクリルアミド溶液を10〜12 µL滴下します。

活性化した22 by 40 millimeterのカバーガラスを液滴の上に載せます。ゲル溶液がカバーガラス全体を覆うようにしてください。溶液内に気泡が生じた場合は、取り除いて平滑にします。

ゲル溶液を室温で約10分間重合させます。重合が完了すると、ゲルがカバーガラスの端から剥がれます。ピンセットの先端を用いて、ゲルが付着したカバーガラスを顕微鏡スライド表面から慎重に取り除きます。

細胞外マトリックス（ECM）タンパク質をゲルに架橋するための、水和したゲル表面を維持するため、ゲルを二回蒸留水を入れたペトリ皿に浸します。まず、SULF san par粉末を無水ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、40 µLのSULF san par作業分注液を調製します。次に、カバースリップスピナーを短時間使用して、ゲル表面から二回蒸留水を取り除きます。

使用直前にゲルを乾燥させないように注意します。硫黄サンプルDMSO分注液を二回蒸留水で希釈し、ゲルの表面中央に約200 µLを塗布します。その後、UVクロスリンカーオーブンを用いてゲル表面にUV光を照射します。

UV照射後、カバーガラスを二回蒸留水の入ったビーカーに浸します。カバースリップスピナーを用いて、ゲルの表面から溶液を取り除きます。その後、パラムをペトリ皿に入れ、冷えたフィブロネクチン50 µLをパラムに滴下します。

カバースリップを反転させ、ゲルの面をフィブロネクチンの上に置きます。室温で1〜2時間、または4 °Cで一晩反応させます。その後、滅菌済みの組織培養用通风フード内でインキュベートします。

カバーガラスをPBSを含む6 cmの組織培養皿に入れ、コーティングを行います。洗浄後、無菌条件下でPBSを数回交換し、カバーガラスを十分に洗浄します。その後、UV照射を30分間行い、カバーガラスを滅菌します。

その後、細胞を播種する前に、カバーガラスを細胞培地で30〜45分間インキュベートします。次に、真空グリースを用いてカバーガラスを固定し、22 × 30 mmのカバーガラスをWarner Instruments社製共焦点イメージングチャンバーの上部カバーガラスホルダーに装着します。カバーガラスの上にチャンバー形成用ゴムガスケットを配置し、入口と出口の両方のポリエチレンチューブにアクセスできるようにします。

これにより、使用するガスケットのサイズに応じて、上部のカバーガラスとゲルをコーティングした22 by 40 millimeterのカバーガラスとの間に150から1000 micronsの間隔を設けることができます。次に、加温した細胞培地を入れたシリンジをコネクタキットを介して入口チューブに接続し、培地がチューブを通って上部のカバーガラスに流れていることを確認します。チャンバーの底部に真空グリースを塗布し、ゲルをコーティングした22 by 40 millimeterのカバーガラスを細胞側を上にしてセットします。

細胞に温めた培地を添加します。チャンバーベースの上にトップカバースリップホルダーを配置し、チャンバーガスケットでゲルコートされたカバースリップと分離させます。チャンバーベース内の位置決めピンが、トップカバースリップの位置決め穴に正しく収まっていることを確認してください。

プレッシャープレートをチャンバーベースに取り付け、プレッシャープレートレンチを使用してネジを締め、プレートを固定します。チューブおよびチャンバー内を通る培地の流れを確認し、チャンバー内に漏れがないか監視します。これにより、細胞表面に培地が届かない領域が生じるのを防ぎます。

共焦点蛍光顕微鏡を用いて、ゲル基質内に埋め込まれた蛍光標識タンパク質および蛍光ビーズをイメージングするため、共焦点イメージングチャンバーを顕微鏡ホルダー内のステージアダプターに取り付け、ゲル灌流内における歪みのないビーズ位置の画像を取得します。ゲルから細胞接着を切り離し、細胞が存在したのと同じイメージング視野で蛍光ビーズの画像を撮影します。プロトコルが正しく実行されていれば、ゲル表面は比較的平坦かつ滑らかであり、蛍光ビーズが全体に均一に埋め込まれています。

ECMはフィブロネクチンの免疫蛍光染色によっても可視化できます。焦点接着部位におけるゲルの収縮を測定する場合は、焦点接着部位の共焦点光学平面でゲルと細胞のイメージングを行う必要があります。ここでは、GFP pxiで標識されたヒト骨肉腫細胞またはU2 OS細胞を用いた吸引力実験において、焦点接着部位を可視化しています。

ゲルの収縮は、焦点接着の下に埋め込まれた蛍光ビーズの変位によって視覚化できます。緑色で示される歪みの生じたビーズと、赤色で示される歪みのないビーズの位置を比較することで、収縮下におけるゲル基質の変位を定量化することが可能です。ここでは、トリプシンによってゲル表面から剥離した伸展細胞の代表的な結果を示します。また、歪みの生じたビーズと歪みのないビーズの位置を比較した代表的な結果をここに示します。

高度な計算アルゴリズムを使用することで、ビーズの変位およびゲルの弾性係数に関連する牽引応力を算出できます。これらの応力は、ヒートスケールマップとベクトルを用いて可視化されており、ヒートマップの暖色系および大きな矢印は、より強い力を示しています。本手順では、細胞収縮を測定するためのコンプライアントマトリックスの作製方法について説明しました。

時間制限のあるステップを迅速に遂行できるよう、事前に計画を立てることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。