Name: マウス神経堤幹細胞の培養のためのニワトリ胚抽出物の製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶニワトリ胚抽出物の製造法。11日齢胚の分離・遠心・ろ過を含む標準化された手順で、マウス神経堤幹細胞の培養に必要な高品質なCEEを得る方法を解説。神経科学・幹細胞生物学研究に有用です。

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マルクスPajtlerとロバートボーラーのサポートやアドバイスは、このプロトコルの可視化のための非常に貴重でした。

動物実験は動物実験で定められている実験的な手続きと規制のための動物の管理と使用に関するNI​​Hのガイドラインに従って、欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に準拠して行われたという著者らの状態ケアとデュースブルク - エッセン大学（ドイツ）での委員会（IACUC）を使用してください。 パート1：（ビデオで示されていない）の設定 （インキュベータから卵を取る前に）材料と溶液の調製<ul><li>卵は37℃で11日間の加湿インキュベーター中でインキュベートする必要があります° C（100 ° F）。 </li><li> 70％エタノールのスプレー、クリーンプレート、正確な清潔なピンセットを用い、4℃（40 ° F）冷滅菌氷上でDMEM、60 mLの滅菌シリンジ</li><li> 50 mLの滅菌コーニングチューブには、° C、コールドDMEMは1:1の比率（：DMEM浸軟質量）で浸軟した胚を混在させる4を半分埋める必要があります。早く卵がニワトリ胚のインキュベータの解剖から取り出されているとして起動する必要があります。 </li><li>オートクレーブや解剖の日に解剖ツールを殺菌、20分間70％エタノールでツールを浸す。 </li></ul>第2部：ニワトリ胚の解剖（ビデオで実証） <ol><li>少なくとも30秒間、70％エタノールを噴霧インキュベート卵を湿らせ、過度に卵を振っていないがきれいで柔らかなペーパータオルで慎重にそれらを乾燥させます。 注：私たちは、同時に60以上のニワトリ胚を解剖することはお勧めしません。 </li><li>鋭いエッジに対して破線で慎重に卵を開いて、卵黄の袋またはニワトリ胚自体を破壊しない、注意して胚を取り出す。 </li><li>すぐに臍帯の開始のための検索と卵黄の袋または少し船を破壊することなく明確なラッピングを開きます。その後、正確な清潔なピンセットを用い、へその緒を解剖。 </li><li>卵黄の袋から胚を取り出す。 注：胚が（ビデオに示されていない）すぐに断頭してください。 </li><li> 4で最小必須培地で胚を収集℃に</li></ol>パート3：ニワトリ胚のマセラシオン<ol><li> 60 mLの滅菌注射器の外プランジャーを取る。 </li><li> one 60mLのシリンジに約10胚を転送します。 </li><li>浸軟物質を失うリスクにしないために慎重に戻ってシリンジにプランジャーを置く。 </li><li>プランジ​​ャーを押し下げることによって痩せ衰えさせる。 </li><li>準備コーニングチューブ1:1（：DMEM浸軟質量）の比でDMEMで半分満たさで浸軟した質量を収集する。約25 mLの量が生産される10の胚を使用する。 </li><li> 4℃45分℃でシェーカーで混合物を置かない</li></ol>第4部：ニワトリ胚の遠心分離 - DMEMサスペンション<ol><li>ニワトリ胚を移す - DMEM懸濁液を遠心管に。 </li><li>胚の25 mg当たり1ミリグラムの濃度で滅菌ヒアルロニダーゼを追加。 </li><li>非常に正確に風袋遠心分離チューブ。 注：遠心操作は非常に高いg力および材料または不均衡なチューブを使用する場合は、遠心機が発生する可能性の損傷時に実行されるため、この手順は慎重に行われるべき。すべてのチューブの小数点以下をDMEMで不足額を調整することで受信する必要があります後に3つのポジションについて、マシンに基づいて秤量精度の高い。 </li><li> 4に遠心分離機の温度を下げる℃に 注：また、遠心分離ローターは、一晩冷却室または冷蔵庫に保管してください。 </li><li>少なくとも180.000 xgx時間にわたって6時間を遠心注：単相の分離に関する優れた結果を得るためには266.000 xgx hを使用する可能であれば、バキューム調整を使用してください。 </li></ol>第5部：ニワトリ胚抽出物のろ過遠心分離後、3つのフェーズは気づいたことができる：脂肪のフラグメントを持つ上層薄汚い液相、中央にある透明な液体の相と遠心チューブの下部にあるペレットを注：遠心混合物の振動や移動活発になる必 ​​要がありますこれは明確な中心的な液相​​を失うことによって遠心分離のステップの結果を破壊するように厳密に、避けて。 注：すべての次の手順では、層流のベンチを使用して無菌条件下で実行する必要があります。 <ol><li> 0.45μmの細孔を有するフィルターシステムに明確な液相をピペット。その後、接続された真空ポンプのスイッチをオンにします。 注：下部にあるペレットに触れないでください。これは、抽出液とフィルターシステムの閉塞の汚染につながる。 </li><li> 0.22μmのと接続された真空ポンプのスイッチを再度の細孔を持つフィルターシステムに事前に抽出して転送する。 </li><li>注し達成ニワトリ胚エキス滅菌15mlのコーニングチューブインチ</li><li>迅速° C（-62 ° F）-80分注して保存する。注：-80で保存した場合最長2年間の最後のCEE℃に</li></ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Rao, M. S., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+controlled+in+vitro+differentiation+of+murine+multipotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells.</a> J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).</li>
<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
<li>Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+and+cell+fate+specification+in+premigratory+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Bioessays%22%5BJournal%5D)">Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest.</a> Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).</li>
<li>Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+lineage+specification+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Factors controlling lineage specification in the neural crest.</a> Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).</li>
<li>Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+stem+cells%3A+control+of+neural+crest+cell+fate+and+plasticity+by+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3.</a> Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).</li>
<li>Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+controlled+differentiation+of+neural+crest+stem+cell+lines+using+conditional+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis.</a> Differentiation. 75, 890-891 (2007).</li>
<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは過去10,11に記載されている手順の変更に基づいています。前者の出版物に加えて、我々はここで、プロセスの個々の異なるステップより多くの拡張を示します。これが正しい手続きで信頼性の高い成果を保証する重要な詳細と実験者をサポートしています。さらに、解剖プロセスとして我々は細部に卵黄の袋から胚を取り出すの手順を記述するCEEの抽出の重要な部分です。以下に述べるように注意することは、いくつかの重要な点があります。 インキュベーションが終了した後のニワトリ胚の解剖はできるだけ早く開始する必要があります。前の解剖に死んでいる胚に悪影響結果に影響を与える可能性がある酵素活性とタンパク質の分解など、このプロトコルのいずれかのステップには使用しないでください。 いくつか手の訓練を始める前にすることは解剖のプロセスのすべてのステップとして実行する必要があります迅速かつ正確に実施する必要があります。それは否定的に干渉するタンパク質の顕著な量を伴っていた卵黄と汚染を避けるために、手順全体の成功にとって重要です。胚...

<table><tbody><tr><td>11日間培養した鶏卵</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルコール消毒スプレー</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ (60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌チューブ (50; 15 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ピペットチップ</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ typeIV-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milipore stericups 滅菌フィルター (0.45; 0.22 &amp;mu;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ピペット (25; 10; 5 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 L5-50</td><td>ローター type Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス神経堤幹細胞の培養のためのニワトリ胚抽出物の製造

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

神経堤は、胚発生中に神経外胚葉から発生し、一時的にしか保持されます。初期の実験は、すでに神経堤1の重要部分であると多能性前駆細胞をへのドア。表現型、神経堤幹細胞（NCSC）を同時に神経堤2,3,4,5から、その移行中にP75（低アフィン神経成長因子受容体、LNGFR）とSOX10の発現によって定義されます。これらの前駆細胞は平滑筋細胞、クロム親和性細胞、神経細胞とグリア細胞だけでなく、メラノサイト、軟骨や骨6,7,8,9に分化することができる。 in vitroで NCSCを育成するために、特別な神経堤幹細胞の培地（NCSCM）が10必要です。 NCSCMの最も複雑な部分は、NCSCのためだけでなく、神経外植片の他の種​​類の成長因子の本質的なソースを表すニワトリ胚抽出物（CEE）の準備です。 CEEの横にある他のNCSCM成分は市販されている。それは分離、浸軟、遠心分離、およびろ過プロセスなどの挑戦的な詳細を知るために非常に重要であるCCE使用して実験室の標準機器を生産。このプロトコルでは、純粋かつ高品質CEEの最大化の量を生産するために、正確なテクニックを説明します。

in vitroで神経堤幹細胞（NCSC）を育成するために、特殊な培地（NCSCM）が必要です。 NCSCMの本質的な部分は、ニワトリ胚抽出物（CEE）です。ここでは、分離、浸軟、遠心分離、およびろ過プロセスなどの詳細を含む、純粋で高品質CEEの最大化量を、生成する正確なテクニックを説明します。

神経堤は胚発生過程において神経外胚葉から生じ、一時的にのみ存在します。初期の実験により、すでに多能性が証明されており...

こんにちは。ドイツのエッセンにある大学小児病院、小児腫瘍科のIka Egar教授の研究室に所属しているAnnaaです。今日は、胎齢11日目のニワトリ胚から抽出物を調製する方法について説明します。DMEMを氷上に置き、4°C以下まで冷却してください。GIB社製のDMEMグルタミン酸を滅菌チューブに半分まで満たして使用します。100°Fの加湿インキュベーターで11日間培養した卵を、MEMおよび70%エタノールを用いて洗浄します。エタノールが少なくとも30秒間浸透するようにしてください。塗布後、柔らかいペーパータオルで卵を丁寧に乾かします。プラスチック製またはガラス製のプレートをエタノールで洗浄します。卵を開きます。胚を慎重にプレートに入れてください。卵原腸（EC）や微小血管を破壊しないように注意してください。鋭利で清潔な精密ピンセットを使用して、胚を切り出します。まず、臍帯を探します。その際、臍帯を探している間に卵黄嚢や細い血管を破壊しないように注意してください。臍帯が見つかったら、その起点まで辿り、解剖します。胚の上の透明なラッピングを開いた後、胚を破壊しないように注意して、ECから取り出します。胚を氷上の滅菌済み最小必須培地に置きます。ここでは、gyp Co.製のDMEMグルタミン酸を使用しています。滅菌済みの60 mLシリンジからプランジャーを取り出します。一度に約10個の胚をサイリンダーに入れます。プランジャーをサイリンダーに挿入します。プランジャーを押し下げて胚を成熟させます。圧力をかけすぎると成熟した材料を失う可能性があるため、注意してください。準備したチューブに、成熟した胚とMEMの比率を1:10として回収します。体積は約25 millilitersになるはずです。胚とEMEMを1:1の割合で混合し、4°Cで45分間振盪します。混合液を慎重に遠心分離チューブに移します。ヒアルロニダーゼを添加します。Sigma社より入手したボイン精巣由来のR Hay daysを使用します。専用のAC高精度電子天秤を用いて、遠心チューブを計量します。小数点以下3桁まで正確に計量することが非常に重要です。これらは同量である必要があります。そうでない場合、混合物を遠心分離するために必要な高速回転により、遠心分離機に問題が生じるリスクがあります。必要に応じて、不足している量のMEMをピペッティングして不均衡を調整してください。ローターは、4 °Cまで冷却するために、一晩冷蔵庫または冷却チャンバーに入れておく必要があります。遠心チューブは非常にしっかりと閉める必要があります。そうしないと、ローターから取り出す際に問題が生じる恐れがあります。遠心分離後、ローターにチューブをセットし、あらかじめしっかりと閉じてください。遠心分離機を4 °Cまで冷却します。常に真空状態で使用してください。ローターが最終速度に達するまで待ちます。異常が発生した場合は、直ちに遠心分離機を停止してください。ブレーキボタンを押し、遠心分離を停止させます。これは、TI I 45ローターを45,000 rpmの速度で6時間回転させた後の操作です。チューブを慎重に取り出します。チューブ内部の上層にある濁った液体層が増加する可能性があるため、決して振らないでください。3つの相を確認します。上層には脂肪片を含む濁った液体があり、中層には透明な液体、そして下層にペレットが見えます。チューブの中層から透明な相を慎重に回収してください。ペレットには一切触れないでください。抽出液の汚染やフィルターシステムの詰まりの原因となります。まず、真空ポンプに接続した0.45 µmフィルターを使用します。次に、得られた液体を0.22 µmフィルターでろ過します。こちらも真空ポンプに接続し、抽出液をチューブに入れます。最後に、チューブを−80°Cで保存します。

production-chick-embryo-extract-for-cultivation-murine-neural-crest

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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