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細菌緑 膿 菌をブロスで培養します。
培養物を単離寒天培地にプレートし、インキュベートして細菌の増殖とウロン酸で構成されるエキソ多糖類であるアルギン酸塩の生成を促進します。
細菌の芝生に等張生理食塩水を加え、こすってアルギン酸塩と一緒に細菌細胞を集めます。
懸濁液をチューブに移し、ボルテックスして内容物を分散させ、酵素分解を防ぐために氷の上に置きます。
光学密度(OD)を測定して、細菌密度を決定します。
細菌懸濁液を酸ホウ酸塩溶液に加え、混合してアルギン酸をウロン酸モノマーに加水分解します。
発色試薬であるカルバゾールを加え、インキュベートします。酸性条件下では、試薬はウロン酸と反応して着色された複合体を形成します。
吸光度を測定して、アルギン酸濃度を反映するウロン酸レベルを定量化します。
標準曲線を使用して、アルギン酸濃度を決定し、それを測定された細菌細胞密度で割って、バイオマス単位あたりのアルギン酸生産量を計算します。
ウロン酸カルバゾールアッセイを開始するには、試験する目的の株の純粋な培養物から単一のコロニーを特定し、滅菌つまようじを使用してコロニーをピックします。
つまようじを5ミリリットルのPIBを含む培養試験管に入れます。摂氏37度のシェーカーインキュベーターで24時間成長させます。インキュベーション後、培養したPIBブロスのアリコートを予熱したPIAプレートに加えます。
滅菌セルスプレッダーを使用して、ブロスをプレートの上に広げ、摂氏37度で24時間成長させます。ピペットコントローラーと滅菌50ミリリットルピペットを使用して、0.85%の塩化ナトリウムを大人の芝生に加え、セルスプレッダーを使用してプレートをこすってサンプルを収集します。新鮮な 50 ミリリットルのピペットを使用してサンプルを吸引し、50 ミリリットルの収集チューブに移します。
サンプルを高温でボルテックスして混合し、氷の上に置きます。サンプルのOD 600を測定するには、まず1ミリリットルの0.85%塩化ナトリウムを使用して分光光度計をブランクします。次に、1ミリリットルのサンプルを新しい使い捨てキュベットに加え、ODを読み取ります。この手順を2回繰り返して、各サンプルのリードを3回取得します。
次に、3ミリリットルの硫酸ホウ酸塩溶液を培養チューブに加え、氷の上に置きます。採取したサンプル350マイクロリットルを試験管内の酸混合物にゆっくりと加えます。低温で短時間ボルテックスした後、100マイクロリットルの0.1%カルバゾールおよびエタノール溶液を酸サンプル混合物に加えます。
チューブにキャップをかぶせ、ミディアム設定で5秒間ボルテックスします。その後、摂氏55度の乾浴に30分間入れます。インキュベーション後、チューブを高温で短時間ボルテックスし、5分間冷却します。
0.85%塩化ナトリウムを入れたチューブを分光光度計のブランクとして使用します。次に、1ミリリットルの混合物をきれいなキュベットに加え、分光光度計で530ナノメートルのサンプルの外径を読み取ります。既知の濃度のd-マンヌロン酸の連続希釈液のOD 530を測定することにより、標準曲線を準備します。
2回繰り返し、これらの読み取り値から線形方程式を抽出します。標準曲線を使用して各サンプル中のアルギン酸塩の濃度を計算し、線形方程式のアルギン酸塩濃度をOD 600で割って、OD 600あたりのアルギン酸塩の総量を求めます。