ニューロン相馬と軸索のコンパートメントのためのマイクロ流体デバイスの作製
2007年8月22日
このビデオでは、我々は、培養神経細胞のためのマイクロ流体デバイスをfarbricateするために使用するポリジメチルシロキサン（PDMS）とソフトリソグラフィーの手法を示しています。
Dr.Newly Johnの研究室へようこそ。John Labは、生物学的アプリケーション向けのマイクロ流体プラットフォームのエンジニアリングを専門としています。このビデオでは、一次ニューロンのコンパートメント化と培養のために設計されたマイクロ流体デバイスの作製と利用について紹介します。
このニューロンデバイスは、2005年8月にNature Methods誌に初めて発表されました。このニューロンデバイスは、その導入以来、世界中の共同研究者によって広く使用されてきました。ニューロンデバイスは、以前にフォトリソグラフィーによって作成されたデバイスのSUAパターンを含むシリコンウェーハ上にキャストされたPDMSの一部で構成されています。
この装置は、直径8ミリメートルの4つのリザーバー、幅1.5ミリメートル、長さ7ミリメートル、高さ100ミクロンの2つのメインチャネルと、幅10マイクロメートル、高さ3マイクロメートルのマイクロ溝の3つの主要な特徴を備えています。マイクログルーブの長さは150ミクロンから900ミクロンまでさまざまですが、標準の長さは450ミクロンです。メインチャネルとマイクログルーブが垂直になるようにデバイスを観察すると、グルーブの左側のリザーバーがメインチャネルを介して接続されており、右側のリザーバーもメインチャネルを介して接続されていることがわかります。
この機能により、液体がメインチャネルを流れることができ、これは重要な機能であり、セルのロードや媒体の交換が可能になります。ニューロンデバイスには、従来の組織培養プラットフォームに比べて3つの大きな利点があります。1つは、細胞体または体細胞と軸索のコンパートメント化を可能にするニューロンデバイスを使用すると、純粋な軸索画分を取得することが可能です。
マイクログルーブのサイズと長さにより、軸索は他のメインチャネルを通過し、鋸体が交差するのを防ぐことができます。第2に、デバイスの設計と静水圧を利用することにより、デバイスの一方の側よりも一方の側に対して体積とリザーバーを高く維持するだけで、デバイスの細胞側およびまたは軸索側のいずれかを別々の処理にさらすことが可能です。そして3つ目は、デバイスの純粋な軸索画分を真空吸引で切断できるため、研究者は軸索再生を研究し観察することができます。
研究者のヒナ・リーが、マイクロ流体ニューロンデバイスの準備を実演します。フォトリソグラフィーによってSU8から作られたパターンを持つ3Angシリコンウェーハを使用して、ポリジメチルスローンPDMSマイクロ流体モールドをキャストします。SUAパターンシリコンウェーハをマスターモールドまたは単にマスターと呼びます。
PDMSは、10対1の重量比で硬化剤と混合されます。つまり、例えば、硬化剤1.5グラムあたり15グラムのPDMSです。次に、PDMSをよく混合し、シリコンウェーハに注ぎます。
シリコンウェーハは、10cmのポリスチレン製ペトリ皿に封入されています。約4mmの厚さのMAを覆うには、約12グラムから15グラムのPDMSが必要です。次に、PDMSを搭載したマスターを真空乾燥させ、蓋をシャーレから外して真空を適用します。
これは、硬化剤の攪拌中に導入されたPDMSからの気泡を除去するために行われます。気泡が取り除かれるまでに約15分かかります。PDMSを搭載したマスターは、真空乾燥剤で15分後に乾燥剤から取り出します。
PDMS マスターにはまだいくつかのバブルが残っています。0.45ミクロンのフィルターが付いたエアガンを使用して、残っている気泡を取り除きます。その後、マスターを80度のホットプレートに1時間置いて硬化させます。
真空乾燥剤が利用できない場合は、マスターを室温で数時間放置できます。気泡はやがて自然に消えていきます。ホットプレートが利用できない場合、PDMSは24時間後に室温で硬化します。
硬化プロセス中にマスターが水平であることを確認することが重要です。PDMSがマスターで硬化したら、外科用ブレードを使用して清潔なフードに運ばれます。デバイスの周囲を囲むように円が描かれています。
ブレードをPDMSに挿入してシリコンウェーハと接触させるとき、ウェーハに過度の圧力をかけないようにすることが重要です。そうしないと、マスターがデバイスの周り全体に円を切って亀裂が入ります。3インチのシリコンマスターごとに4つのデバイスがあります。PDMS はマスターから慎重に持ち上げられます。
これは、手術用ブレードを前のカットに挿入するときに、手術用ブレードを静かにひねることから始めることができます。PDMSデバイスを金型に載せただけで、本当に薄いです。フェイスアップリザーバーは、8mmの組織生検パンチを使用してデバイスに打ち抜かれます。
パンチャーに残ったゴミをロッドで押し出します。その後、デバイスを四つ分にし、余分なPDMSをトリミングして、デバイスがコーニングのカバーにきちんと収まるようにします。ガラスナンバーワンサイズの24mm×40mmの窒素空気を使用して、余分な破片を吹き飛ばします。
頑固な破片は、3M Scotch Brand 4 7 1ビニールテープを使用して取り除くこともできます。これで、クリーンなデバイスはプラズマボンディングの準備が整いました。ヘリックプラズマクリーナーを使用して、ニューロンデバイスをカバースリップに短時間接着します。
デバイスとカバースリップはトレイに置かれ、トレイはプラズマクリーナーとチャンバーから空気を排出するために使用される真空ポンプに入れられます。PDMS デバイスは表向きに配置されることに注意してください。それは、彼らがプラズマガスにさらされるようにデザインを上向きにすることです。
真空圧が300に達した後、ミリトールの電力が電気コイルに回され、高に設定されます。ドアにはすべてひびが入っていて、チャンバーに少しの空気が入り、プラズマの生成に役立ちます。デバイスとカバーガラスは2分間プラズマ処理されます。
チャンバー内の紫色に注目してください。それが実際のプラズマです。電気コイルは、電子、イオン、および中性のアトスまたは分子からなる部分的にイオン化されたガスであるプラズマを生成します。
プラズマは、ガラスとデバイスの表面に反応性種を生成し、それらを一緒に配置すると永久的な結合を形成します。また、プラズマは表面の親水性を変化させ、液体の添加を促進します。プラズマクリーナーは、デバイスを滅菌します。
プラズマ処理を2分間行った後、真空中の電源を切り、空気をチャンバーに導きます。ガラスとマイクロ流体デバイスのプラズマ処理サービスは、クリーンベンチ内で互いに接触して組み立てられます。次に、デバイスを滅菌した60ミリメートルの皿に入れます。
ガラスとデバイスのプラズマ処理された表面は、緊密な不可逆的な結合を形成します。プラズマ結合から10分以内に、デバイスはガラスポリオールリジンをデバイスに加えます。10分後、デバイスの親水性は減少します。
PLLがデバイスに入るのを困難にします。PLLを追加した後、デバイス内の気泡を確認することが重要です。存在する気泡を除去する簡単な方法は、100マイクロリットルの液体で満たされたP200ピペットを使用することです。
この場合、PLLは先端をメインチャネルの開口部に直接配置し、P200を強く押し下げます。これを数回繰り返す必要があるかもしれませんが、最終的にはピペットからの力で気泡が押し出されます。PLLを含むデバイスは一晩インキュベートし、標準的な組織培養インキュベーターを37°Cで5%CO2でインキュベートします。
PLLで24時間インキュベートした後、デバイスをオートクレーブ脱イオン水で2回すばやくすすぎます。このプロセス中、液体がメインチャネルから完全に除去されることはなく、リザーバーからのみ除去されます。メインチャネルから液体を取り除くと、気泡が発生します。
2回の迅速なすすぎの後、デバイスをオートクレーブ脱イオン水で再度満たし、インキュベーターに最低3時間または一晩戻します。翌日、デバイスを水で一晩または最低3時間インキュベートした後、再びバイオセーフティキャビネットに持ち込まれ、脱イオン水で2回すすぎます。次いで、初代ラットニューロンを培養するために必要なサプリメント、B27およびグルタミン酸を含む神経基礎培地を装置に加える。
その後、デバイスは将来の使用のためにインキュベーターに戻されます。これで、デバイスはニューロンを装着する準備が整いました。このビデオでは、ニューロンデバイスの製造に使用しているソフトリソグラフィーの技術を実演しました。
これらのデバイスは、ニューロンやその他の目的の細胞タイプの培養に使用できます。これらのデバイスの主な利点は、デバイスの片側のニューロン細胞体の培養を、デバイスの反対側の純粋な軸索画分から分離し、区画化できることです。次のビデオでは、E 18胎児ラック皮質ニューロンをどのように準備し、細胞をデバイスにロードする方法を示します。
というわけで、John Labからの投稿です。ご覧いただきありがとうございます。
概要
このビデオは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を使用してソフトリソグラフィの技術を実演し、ニューロンを培養するためのマイクロ流体デバイスを製作します。このデバイスは、神経細胞体と軸索の区画化を可能にし、神経生物学の先進的な研究を促進します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- マイクロ流体工学
- 細胞培養技術
背景
- ニューロンデバイスは2005年8月にNature Methodsで初めて発表されました。
- 世界中の研究者によって広く採用されています。
- デバイスはシリコンウェーハにPDMSを鋳造して作られます。
- ニューロン培養用に設計された貯留池とチャンネルを特徴としています。
研究の目的
- ニューロン培養用のマイクロ流体デバイスの製作を実演すること。
- 従来の組織培養プラットフォームに比べてこのデバイスを使用する利点を強調すること。
- ニューロンデバイスの準備のための詳細な方法論を提供すること。
使用した方法
- 特定の比率でPDMSと硬化剤を混合します。
- 真空乾燥器を使用してPDMSの気泡を除去します。
- ホットプレートまたは室温でPDMSを硬化させます。
- 機能強化のためにPDMSデバイスをカバースリップにプラズマボンディングします。
主要な結果
- デバイスは細胞体と軸索の区画化を可能にします。
- 異なる区画に別々の処理を施すことができます。
- 研究者は純粋な軸索分画を研究のために得ることができます。
- 設計は軸索再生の観察を促進します。
結論
- マイクロ流体ニューロンデバイスは神経科学研究にとって価値あるツールです。
- ニューロンの挙動と再生を研究する上で大きな利点を提供します。
- 製作プロセスは詳細で研究者にとって再現可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Compartmentalized microfluidic platforms enable precise spatial control of neuronal subpopulations, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By isolating soma and axon compartments, these systems facilitate mechanistic de-risking of therapeutic candidates through compartment-specific treatment and readout. This approach enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological noise and improving assay specificity for axonal regeneration and neuroprotection studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal and somal compartments for independent manipulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through compartment-specific treatment and readout of axonal integrity.
- Predictive Value: Increases confidence in lead compounds by reducing confounding signals from cell bodies in axonal assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal systems for downstream compound screening with compartmentalized readouts.
- Operational Value: Standardizes axonal isolation and culture conditions, improving reproducibility across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates platform reuse for multiple targets and therapeutic modalities in neuroscience discovery.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal architecture from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of target engagement and pathway modulation in axons without somatic interference.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on axonal regeneration or degeneration phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic neuron device integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, enabling compartment-specific analysis at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating axonal responses to therapeutic perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative axonal readouts for reliable compound evaluation in neurodegeneration programs.
- Analytics: Generates compartment-specific measurements (e.g., axonal outgrowth, degeneration) that enable objective comparison of treatment conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by preserving neuronal polarity and enabling biomarker-aligned axonal assays.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform across multiple projects, reducing redevelopment costs and ensuring consistent neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in axonal vs. somal responses.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of neuronal compartmentalization assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in neurodegeneration portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on compartment-specific efficacy and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum desiccators, and precision fabrication tools for master mold preparation.
- Necessitates cross-team standardization of fabrication protocols and quality control for device-to-device consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to human iPSC-derived neurons or disease models with altered neurite dynamics.
- Includes practical limitations such as device fouling over long-term culture and the need for media maintenance to prevent channel bubbling.
