網膜神経節細胞の生存を研究するために視神経挫滅モデルマウス
April 25th, 2011
このプロトコルは、逆行性に網膜神経節細胞、およびどのように続いて網膜神経節細胞の生存とアポトーシスを分析するために視神経挫滅するためにラベルを付ける方法を示しています。それは、緑内障を含む視神経障害の様々なタイプ、のための実験的疾患モデルです。
この手順は、マウスモデルにおける視神経挫傷とその後の網膜神経節細胞生存の解析を示しています。これは、蛍光色素を上丘に注入することによって達成されます。初日には、DIは逆行性になり、網膜神経節細胞に運ばれ、この細胞集団を第2ステップとして標識します。
視神経挫傷は4日目に行われ、視神経変性を引き起こし、網膜神経節細胞が徐々に死滅します。11日目に、網膜神経節細胞の生存を調査するために網膜を解剖します。この手順の結果は、蛍光顕微鏡を用いて実施されたフローラゴールド標識網膜神経節細胞の説明に基づいて、残りの生存可能な網膜神経節細胞の数を示している。
こんにちは、私はNIHの国立眼科研究所のDr.Labから来ました。次に、マウスの視神経衝突傷害モデルの実行方法を紹介します。この技術の主な利点は、網膜ギャングリング細胞を標識し、光学クラッシュ損傷の生存または変性を調査するためのシンプルで安定した効率的な方法を提供することです。
この尺度は、緑内障などの視神経領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、視神経の衝突の前または同時に、成長因子や受容体アゴニストまたは阻害剤などの治療を適用すると、治療にまで及びます。一般的に、この方法に不慣れな個人は苦労します 出血は、光学が視覚的な血管であるため、最初はしばしば発生します。
したがって、視神経ガレージ部分を学ぶのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。ただし、承認された麻酔薬でマウスに深く麻酔をかけた後、練習すると簡単になります。切開部位の周りの頭の毛を剃ります。
マウスを脳定位固定装置に慎重に置き、頭が安定していることを確認します。頭皮をヨウ素と70%アルコール溶液でそれぞれ3回消毒します。滅菌メスを使用して、頭皮に矢状切開を行い、頭蓋骨を露出させます。
3%の過酸化水素で頭蓋骨をきれいにします。次に、矢状縫合糸が頭蓋骨の冠状縫合糸と交差する場所の bgma を特定します。後部2.9ミリメートルと側方トレマ0.5ミリメートルを測定します。
そして、このポイントをマークし、2番目のマークのポイントに小さな穴を慎重に開けます。穴あけ中は、二次的な熱損傷を防ぐために、穴を開ける場所に生理食塩水を適用してください。適切な穴を開けたら、ハミルトンシリンジを穴の上に置きます。
針が髄膜をはっきりと通過していることを確認し、注射器の先端を脳の表面から1.6ミリメートルの深さまで下げます。.次に、1分間に0.2マイクロリットルの流量として非常にゆっくりと、1マイクロリットルのフルオロゴールドニューラルトレーサー色素を上丘に注入します。蛍光金が針の軌跡に沿って拡散するのを防ぐために、針を5分間所定の位置に置きます。
次に、針を慎重に引き抜き、切開部位を縫合糸で閉じます。次に、マウスを定位固定装置から離します。鎮痛のためにブプレノルフィンの皮下注射を投与します。.
マウスを暖かく乾燥した場所に移動します。動物が直立姿勢を維持できるようになるまで、動物を監視します。その後、ラベリング手順後の最初の3日間はホームケージに戻します。
全身性鎮痛薬と局所抗生物質軟膏を1日2回投与し、マウスを綿密に監視します。トレーサー色素注射の3日後、マウスは承認された麻酔薬で深く麻酔されます。マウスを解剖顕微鏡の下に置き、マウスに送って目を視覚化します。
スプリングハサミを使用して、4時の位置で左目の結膜を切開します。次に、眼窩筋をそっと解剖し、片側に動かします。血管を傷つけないように注意してください。
白い視神経を眼球からの出口のレベルで露出させます。次に、交差作用鉗子を使用します。眼球から2ミリメートルの距離で視神経を粉砕し、3秒間圧力をかけます。
挫傷の終了後、視神経を変位した組織と結膜で覆い、10個のゼロサイズのシルク縫合材料を使用して縫合します。縫合後、マウスが麻酔から回復する前に、抗生物質の眼科用軟膏を目に塗布し、鎮痛剤としてブプレノルフィンを注射します。最後に、マウスを暖かく乾燥した回復エリアに移動します。
動物が麻酔から十分に回復して直立姿勢を維持するまで、動物を監視します。その後、動物を家のケージに戻します。動物が綿密に監視されていることを確認し、全身性鎮痛薬と局所抗生物質を1日2回投与します。
視神経挫傷術後の最初の3日間は、視神経挫傷術の7日後に網膜が採取されました。二酸化炭素、窒息、および頸部脱臼によってマウスを安楽死させた後、一対の鉗子を使用して眼窩に圧力を加えて眼を核形成します。4%パラホルムアルデヒドに目を2時間浸して固定します。
次に、4%パラホルムアルデヒドを取り除き、PBSで目を3回洗います。固定後、網膜を解剖します。以前に公開されたプロトコル画像によれば、蛍光顕微鏡を用いて網膜の所定の領域における生存可能な生存網膜神経節細胞を、これらの画像から各領域における網膜神経節細胞密度を計算できる。
この顕微鏡画像は、固定され、平らにされ、取り付けられた網膜を示しています。この画像は、無傷の正常な網膜で視神経挫傷傷を受ける前の網膜神経節細胞で標識された植物相金を示しています。網膜神経節細胞は、緑色植物相、金の神経トレーサー色素を上丘に注入して逆行性標識しています。
この画像は、視神経挫傷傷の7日後にラベル付けされた網膜神経節細胞をラベル付けしたフローラゴールドを示しています。損傷していない正常な網膜の網膜神経節細胞の前の画像と比較して、視神経挫傷のある網膜では生存可能な網膜神経節細胞の数が有意に少なくなっています。最初の部分であるoidが1つになると、網膜神経節細胞の標識は20分で行うことができます。
2番目の部分、視神経のクラッシュは、この手順を試みながら5分で行うことができますが、力を入れすぎたり、落下時の眼動脈の損傷につながる可能性があるため、長時間クラッシュしないようにすることが不可欠です。その後、網膜、視神経衝突損傷ミラーモデルは、網膜神経節、細胞死、および生存のプロセスを研究するのに役立ちます。このモデルは、網膜神経節、細胞、眼垂体、および生存に対するさまざまな領域と遺伝子の影響を調査するためにもよく使用されます。
このモデルの利点の一つは、再現性が高いので、頑張ってください。
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概要
このプロトコルは網膜神経節細胞を逆行的にラベル化し、視神経圧迫損傷を施して細胞生存とアポトーシスを分析するプロセスを示しています。この方法は、緑内障を含む様々な視神経病変を研究するための実験モデルとして機能します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 視神経病変
- 細胞生存分析
背景
- 網膜神経節細胞は視覚信号伝達に不可欠です。
- 視神経損傷は重大な視力喪失につながる可能性があります。
- 細胞生存メカニズムの理解は治療法の開発に不可欠です。
- このプロトコルは実験分析のためにマウスモデルを利用します。
研究の目的
- 生存分析のために網膜神経節細胞をラベル化すること。
- 視神経圧迫損傷の効果を調査すること。
- 緑内障などの視神経病変をモデル化すること。
使用された方法
- 上丘への蛍光染料の注入。
- 網膜神経節細胞をラベル化するための逆行性輸送。
- 4日目に視神経圧迫損傷を施行。
- 分析のために11日目に網膜の解剖。
主な結果
- 蛍光顕微鏡を用いた生存している網膜神経節細胞の評価。
- 損傷後の残存細胞の定量化。
- 網膜神経節細胞の生存率に関する洞察。
- データは視神経変性を理解する上での理解をサポートします。
結論
- このプロトコルは視神経損傷を効果的にモデル化します。
- 網膜神経節細胞の生存を研究するためのフレームワークを提供します。
- 結果は視神経病変の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The optic nerve crush injury model provides a reproducible system for studying retinal ganglion cell death and survival mechanisms, which is critical for target validation in neurodegenerative disease programs. By enabling quantitative assessment of neuronal survival following axonal injury, this model supports mechanistic de-risking of therapeutic candidates aimed at preventing vision loss in glaucoma and traumatic optic neuropathy. The model’s utility in evaluating pharmacological and molecular interventions positions it as a valuable tool for preclinical screening and lead identification in ophthalmology R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to retinal ganglion cell survival pathways after axonal injury.
- Operational Value: Provides a stable, standardized model for functional target validation in optic neuropathy research.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring neuroprotective effects of candidate compounds on retinal ganglion cell density.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable fluorescence-based readouts of retinal ganglion cell survival for compound screening.
- Reproducibility: Offers high reproducibility in injury induction and cell counting, supporting assay standardization across studies.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and imaging platforms for medium-throughput evaluation of therapeutic reagents.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models key pathophysiological features of human optic neuropathies, including glaucoma and traumatic optic nerve injury.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical efficacy testing through consistent outcome measures.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing quantitative data on neuroprotection and cell survival post-injury.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation through to lead optimization in neuroprotection programs for retinal diseases.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on cell death and survival signaling pathways following optic nerve trauma.
- Screening: Enables reliable compound evaluation via fluorescence microscopy-based quantification of labeled retinal ganglion cells.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (cell counts per retinal region) essential for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by modeling human-relevant neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for assessing diverse therapeutic modalities, including growth factors, receptor modulators, and gene-based interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in neuronal survival mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization in injury modeling and outcome assessment across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early biological de-risking of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of advancement decisions based on empirical survival data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, stereotaxic injection, and retinal tissue handling.
- Dependent on fluorescence microscopy and image analysis infrastructure for accurate cell quantification.
- Necessitates standardized protocols for injury application (force, duration, location) to ensure reproducibility.
- Adaptation considerations include species-specific anatomy and tracer dye compatibility across models.
- Practical limitations include surgical variability and potential confounding effects from vascular damage during optic nerve manipulation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:25
Baseline Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells (RGCs) at Day 1
4:47
Optic Nerve Crush Injury at Day 4 after Fluorescence Dye Injection
6:22
Retinal Harvest and Analysis of RGC Survival
7:13
Analysis of Retinal Ganglion Cell Survival after Optic Nerve Crush Injury
8:01
Conclusion
