Name: プロテオーム解析のためのマウスの硝子体と網膜の内臓摘出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: 学ぶマウスの硝子体と網膜の内臓摘出法。前眼部の解剖、遠心分離、タンパク質アッセイによる組織の分離と特性評価を含むプロトコルです。プロテオーム解析に適した純粋な試料を取得できます。

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資金は、視力および失明を防ぐために研究のための闘いによって提供されていました。

1。前眼部の解剖。 <ol><li>角膜輪部に後部強膜組織を0.22 forcepと地球儀（眼球）安定していると把握されています。 </li><li>顕微ブレードは、角膜輪部から角膜輪部に角膜の線形切開を行うために使用されます。 </li><li> 0.12コリブリforcepは、切開で角膜を把握するために使用されます。 </li><li>前房の流体は、その後ベックリキセル外科槍で吸収される。 </li></ol> 2。レンズ内臓摘出。 <ol><li>角膜を把握0.12コリブリforcepは世界を安定させるために使用されます。 </li><li>細かいカーブニードルホルダーは（または曲線麦粒鉗子）世界の後面に向かってレンズの後ろに挿入されます。ニードルホルダーは部分的に閉じられ、そして前方に引っ張られている。圧力は、眼の壁をそのままにして角膜を切開して前方にレンズを押し出す強膜の外表面にピンセットを用いて適用されます。硝子体は半透明のゲルとして表示され、レンズに部分的に付着しています。 </li><li>レンズ、硝子体組織をPBSに溶解したプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）の20マイクロリットルを含むフィルタリング遠心分離管に配置されます。 </li></ol> 3。網膜の内臓摘出。 <ol><li>角膜切開を把握0.12コリブリ鉗子で地球を安定させるために引き続き。 </li><li>細かいカーブニードルホルダーは（または曲線麦粒鉗子）視神経の近くに、できるだけ地球にはるかに後方に配置されます。ニードルホルダーは部分的に閉じられ、そして前方に引っ張られている。圧力は、角膜を切開して前方に網膜を押す強膜の外表面にピンセットを用いて適用されます。硝子体が網膜に付着している半透明のゲルとして表示されます。網膜は黄色、血管組織として可視化される。色素組織の任意のストリップは、鉗子で剥離することができます。 </li><li>網膜硝子体の組織を、レンズ、硝子体の組織を含むフィルタ処理された遠心分離管に配置されます。 </li></ol> 4。フィルタリングされた遠心分離。 <ol><li>フィルタリングされた遠心管は、ベンチトップ遠心機に配置されます。 12分間14,000 × Gで回転する。 </li><li>硝子である下部チャンバ、から溶離液を吸引除去する。網膜は、上室に残ります。これらのサンプルは、タンパク質の研究に利用することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果硝子体サンプルはSDS - PAGE（図2）により分析した。サンプルはまた、酵素活性アッセイ（図3）を使用しました。 <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1マウスのアイダイアグラム。ヒトとマウスの眼の断面模式は、その大きなレンズのためにマウスの眼の相対的な小さな硝子体の体積を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2一次元SDS - PAGEマウスの硝子体と網膜の。マウスの硝子体、13.6 mg / mLの（レーン1）、および網膜のタンパク質プロファイル、11.35 mg / mLの（レーン2）。ゲル電気泳動は、フラミンゴ蛍光ゲル染色で染色、45分、150 kVで行い、VersaDocイメージングシステム（バイオラッド、ヘラクレス、CA）を用いて可視化した。 <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。マウスとヒト硝子体中のスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）酵素活性 。総SOD活性の測定（SOD活性を比色aasayキット、＃AB65354、アブカム株式会社、ケンブリッジ、MA）は、DBAとアルビノマウスの内臓摘出によって収集された硝子体と網膜を行った。これは、人間の硝子体コアと相対活性を決定するために事後ヒトドナーの目から採取したヒトの網膜におけるSODの活性と比較した。希釈していないガラス質コア試料は、手動で11、23ゲージの針を用いて吸引され、網膜は目の開花とRPE /脈絡膜複合体から離れて組織を切断して回収した。アッセイは、SODのアイソフォームを区別しませんが、それが唯一の細胞外アイソフォームであるため、ガラス質のSOD活性は、SOD3を反映する可能性が高い12網膜のSOD活性は、3つすべてのSODのアイソフォームを反映する可能性がある：。細胞内SOD1、ミトコンドリアSOD2、および細胞外SOD3。このSODアッセイを含む、高感度の酵素アッセイ、12、タンパク質の交差汚染の可能性は可能であり、さらなる研究が必要です。エラーバーはSEMを示す。

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &amp, Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Ophthalmol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+RS+%22Systematic+evaluation+of+the+mouse+eye%3A+Anatomy%2C+pathology%2C+and+biomethods%22">Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods</a>. , CRC Press. 161-195 (2002).</li>
<li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li>
<li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+Stickler%27s+syndrome%3A+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+%28pro%29collagen+gene+%28Col2a1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li>
<li>Marneros, A. G. &amp, Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII%2Fendostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li>
<li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li>
<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li>
<li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li>
</ol>

動物実験は、眼科と視覚研究における動物の使用のための眼科の文の研究とビジョンのための協会に準拠して行った。

トランスジェニックマウスは、網膜と網膜硝子体疾患を調べるための重要なモデルである。6-10マウス硝子体、しかし、マウスの眼の大きいレンズに起因する人間の硝子体に比べて眼の非常に小さい割合で構成されています。5これになるにはそれが困難なマウスの硝子体を単離精製する。このような増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、ブドウ膜炎、および網膜剥離などの疾患の間に硝子体に関連するタンパク質の変化を理解することにより、彼らは進歩のメカニズムへの洞察を与える。酵素とプロテオーム解析のためのタンパク質の収量を最大化しながら、この可視化実験のプロトコールは、マウスの硝子体を取得し、浄化する手段を提供します。

<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> 15 °、BDビーバー顕微ブレード</td><td>ベクトンディッキンソン- </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS、pH7.4の</td><td>インビトロジェン</td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22ファイン- Castroviejo縫合鉗子</td><td>シュトルツ眼科</td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0.12コリブリ鑷子</td><td>シュトルツ眼科</td><td> 132分の2 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心フィルタUltracel YM - 100またはYM - 50 </td><td>ミリポア</td><td> 42412、42415 </td><td></td></tr><tr><td> SOD活性比色アッセイキット</td><td>アブカム</td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td>ベックリキセル外科スピアーズ</td><td>メドトロニック</td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロッシュ</td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td>フラミンゴ蛍光ゲル染色</td><td> Bio - Rad社</td><td> 161から04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

プロテオーム解析のためのマウスの硝子体と網膜の内臓摘出

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

マウスの網膜は、遺伝性網膜疾患のための重要な遺伝的モデルとして浮上している一方で、マウスの硝子体が検討されていない。硝子体は眼内だけでなく、眼のタンパク質が病気中に蓄積網膜の上に横たわって高度に水性細胞外マトリックスである。硝子体と網膜の間に1月3日異常の相互作用は、網膜剥離、増殖性糖尿病網膜症、ブドウ膜炎、および増殖性硝子体網膜症などのいくつかの疾患の根底にある1。マウスのレンズが眼の75％近くを占めているので、4相対的なマウスの硝子体の量は、ヒトの硝子体（図1）より大幅に小さくなります。5は 、これはマウスの硝子体の生化学的研究が困難な作られている。このビデオの記事では、我々はトランスジェニックマウスモデルの使用がより明確に網膜硝子体疾患の開発にこの細胞外マトリックスの役割を定義できるようになります網膜から、マウスの硝子体を細かく分析し、分離する手法を提案。

解剖手法は、硝子体、網膜、およびマウスの眼からレンズ、遠心分離により分離し、タンパク質アッセイと特性評価の空洞化を示しています。

マウスの網膜は遺伝性網膜疾患の重要な遺伝学モデルとして台頭していますが、マウスの硝子体については依然として解明すべき点が多く残されています。硝子体とは...

ヒトの眼と同様に、マウスの眼内は硝子体と呼ばれる液状の細胞外マトリックスで満たされています。この空間の大部分は水晶体によって占められています。硝子体と網膜を単離するには、まず前眼部を解剖し、ピンセットで眼球を固定した後、超鋭利なブレードを用いて角膜を横方向に一度切り込みを入れます。刃が鈍いと角膜を切り裂く可能性があり、また数回の切開が必要になります。前房内の液体を吸収するために、WEXセルスポンジを使用します。矢印は、ピンセットで水晶体と硝子体を絞り出し、ピンセットを部分的に閉じて前方に引き出す箇所を示しています。水晶体は透明な球体に見え、その後ろに硝子体ゲルが続きます。この例では、硝子体が水晶体の背面に付着したままになっています。網膜を分離するために、視神経に近いさらに後方に網膜鉗子を配置し、軽く挟んで前方へ引き出します。網膜は黄色のゼラチン状の物質として現れます。場合によっては、網膜、硝子体、および水晶体が一つの組織として取り出されることがあります。次のステップでは、フィルター遠心分離装置を用いて、これら3つの組織を単離・分離します。フィルターピースをエッペンドルフチューブの上部に取り付け、リン酸緩衝生理食塩水を加えます。各組織を分離しながら、フィルターが入った上部のウェルに配置します。水晶体は左上のコーナーに、網膜および硝子体は右下の場所に配置します。チューブをマイクロ遠心分離機にかけ、14,000 Gsで12分間遠心分離します。硝子体はエッペンドルフチューブの底に沈み、網膜は上層に留まります。ピンセットを用いて水晶体と網膜を分離し、その後、上部のウェルから網膜を単離します。これらの組織はすべてエッペンドルフチューブに入れ、プロテオミクス解析に供することができます。

evisceration-of-mouse-vitreous-and-retina-for-proteomic-analyses

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、死後の目には人間の硝子体の様々な半透明の構造を差別化し、解剖のための効果的なテクニックを示しています。...

プロテオーム解析のための人間の硝子体の要素の解剖

トリプシン消化は、網膜血管系を分析するために最も一般的に使用される方法の1つである。本稿では、技術を最適化し、船舶の全体的なアーキテクチャを維持しながら、非血管組織を除去するための重要な変化を含めて詳細に方法を説明します。...

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このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。...

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網膜は、その層状構造全体で複雑な空間構成を示します。最新の空間トランスクリプトミクスおよびシーケンシング技術では、厚さ20μm&lt;組織切片が必要であり、網膜研究の適用性は限られています。この新鮮凍結凍結切片法は、平面的な空間的関係を維持しながら、マウス網膜の薄い 顔...

顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

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プロテオーム解析のためのマウスの硝子体と網膜の内臓摘出

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