Name: ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 10 s
Description: 学ぶRNAウイルスのRNAポリメラーゼ忠実性変異の分離と特性評価法。変異原選択圧下での伝代培養とシーケンス解析により、複製時のエラー率変化を同定し、ウイルス適応と進化のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は、パリ市から医療研究助成金、フランス国立助成金ANR - 09 - JCJC - 0118 - 1、およびno ERCの開始グラントRNAvirusPopDivNVaxプロジェクトからの資金によって支えられている。 242719。

<ol><li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+%28in%29fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li>
<li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li>
<li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%3A+fidelity%2C+replication+speed%2C+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li>
<li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li>
<li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li>
<li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%27s+antiviral+mechanism+of+action%3A+lethal+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li>
<li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li>
<li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li>
<li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li>
<li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect%2C+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li>
<li>Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis%3A+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li>
<li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li>
<li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin%3A+implications+for+error+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞株の選択は。RNA変異原性物質として塩基類似体の効果は、異なる細胞型11によるそれらの相対的な取り込みと相関する。通常、ウイルスの継代に使用される細胞株は、取り込みや敏感すぎ（高い細胞毒性を）変異原性物質に不応性であることが判明した場合、それはこれらの要件を満たしていると、まだウイルス複製に許容である別の細胞株を使用する必要があります。変異原性の抵抗のバリアントが分離されると、特性の残りの部分はオリジナルの、好ましい細胞ラインで実行することができます。我々の経験では、HeLa細胞は容易に変異を取る、BHK細胞は変異の取り込みに抵抗性の10倍高い濃度およびVero細胞にまで必要とする。 変異原性の複数のタイプが使用されている場合は変異原性物質の選択は。変異処理により忠実度の亜種を分離しようとするには、成功の可能性を高めることができます。誤って複製中にゲノムに組み込まれている別の構造の基本アナログ変異原性物質は、主にその後の複製サイクルにおける突然変異の特定のサブセットの結果を誘発する：リバビリンの治療はGtoAとCtoU遷移変異12を支持し、5 -アザシチジンはと、同じようなバイアスを持っていますCtoGとGtoCトランスバージョン13の加算は、5 -フルオロウラシル優先エイトグと宇徳遷移14を誘導する。また、Mg 2 +のまたはMn 2の高濃度は、+ 12、上記のバイアスなしでRNAウイルスの全体的な突然変異の頻度を増加させる培地に補足することができます。ウイルスのコドンの配列、および忠実度のバリアントを生成するために必要なコドンの変化に応じて、これらの条件のいくつかは他のものに比べてこの変種の出現を優先します。忠実度の高いポリオウイルスG64SおよびコクサッキーウイルスA372V、コドンのサイトで必要なエイトグの遷移が主にこのリバビリンによって生成される突然変異に相当するので、最も容易に亜種のために選択されたリバビリンの治療のために。 MOI対人口サイズ。ウイルス感染症領域では、組織培養感染のプロトコルはのために、欠陥干渉粒子（低MOI）の蓄積を避けるために、またはウイルス（高MOI）との間で組換えを促進するため、感染の多重度（MOI）に特に注意を払う例。継代シリアルオーバー出現のイベントのために選択するには、ウイルスの人口規模を考慮することも重要です。耐性変異株は、当初は低頻度で存在するので、それは各通路にこれらの新興の変種を失うのを避けるために（10 5 -10 6ウイルス、など）次の1つの通路から、できるだけ多くの人口のサイズとして転送することが最善です。よくまたはフラスコの大きさ（感染した細胞の数）をスケールアップすること、これが問題になる場合MOIの増加を最小限に抑えるために役立つことがあります。一方、変異原性物質に対するウイルスの感受性がテストされている実験のために、低MOI感染は実験で発生する複製のサイクル数を増やすこととによってより高い適応度のゲノムで変異ゲノムの救助を避けるために行われ共同感染細胞における相補。複製の最初のラウンドの間に子孫のゲノム上で生成された変異がすぐに検出されないので、これは重要です。これらの変異RNAのほとんどは、依然としてビリオンにパッケージ化されます。それはこれらのゲノムに存在する致死突然変異が中止された複製サイクルにつながる、とウイルス力価の低下することを感染症の次のラウンドになります。それは致死突然変異誘発の有意な効果が観察される前に、変異の蓄積のいくつかのラウンドを可能にするために必要となる場合があります。最後に、変異原性物質の存在下で継代のシリーズを介して、ウイルスの力価が絶滅するまで低下し続ける場合は、研究者は徐々に変異原性物質（非常に低濃度から開始する）の量を増やすことで、ウイルスを継代してみてください。 RNA変異-抵抗性個体群からRNA変異原性物質耐性クローンの単離と世代。RNA変異原性物質は、それぞれのゲノムに複数のランダムな突然変異を導入するが、抵抗の選択は、唯一の（とコンセンサス配列に修正）耐性変異を豊かにする。この変異を識別するには、我々の配列変異の抵抗性の人口（人口のコンセンサス）ではなく、個々のウイルス。したがって、変異原によって作成された単一の、ランダムな突然変異が連続して検出されていない、唯一の変異は選択した後のコンセンサスの変化にその結果が、発見されています。我々の経験では、1つまたは2つだけそのようなコンセンサス配列の変更を識別します。変異原物質抵抗性個体群が得られ、耐性変異が同定されれば、それはこの亜種の多くの純粋な株式を生成する必要があります。上記の、我々は、プラーク精製の手順を説明した。また、興味のあるウイルスが容易に識別できるプラークを生成しない場合は、希望するバリアントはpurif可能性があります限界希釈法によってIED。このアプローチは、本質的にウイルスストックは、井戸の50％未満が感染しているように希釈して96ウェルフォーマット、のTCID 50です。この希釈を用い、上記と同様のアプローチは、10個の変種まで分離し、そのシーケンスを確認するには、取得されます。前述したように、最善のケースでは、ウイルス株の感染性cDNAクローンは入手可能です。変異体の分離は、このように必要ではないでしょう。我々の経験では、忠実度の亜種は、単一のアミノ酸置換の結果であり、したがってそのようなQuikchange（アジレント）のような単純な、市販の変異導入キットを使用して生成することができます。 secondaryオプションは、密接に関連菌株のcDNAクローンを使用することです。しかし、関連株が使用されている場合、我々は強く我々は2つ​​の密接に関連ウイルスに突然変異を変える同じ忠実度は、必ずしも同じ効果を持っていないことを発見したので、このアプローチとウイルスの分離（例えば、プラーク精製）の両方を使用することをお勧めします。 フィデリティと複製。RNA変異原性物質耐性変異株の選択は、野生型の対応4,12,15に似ている成長の特性を持つ上位と下位忠実バリアントの両方の分離をもたらしました。現在、ポリメラーゼ活性率と忠実度の間のリンクは完全には分かっていない。低忠実度の亜種は、より高速な処理1-3,12を持っている傾向がある一方、in vitroで精製したRNAポリメラーゼを用いて生化学的研究は、より高い忠実度の亜種が遅い処理速度を有することが示されている。組織培養では、これらの違いは、律速段階である、そのリソースの可用性ではなく、内因性ポリメラーゼ活性の動態を示唆し、通常は明らかではありません。忠実度のバリアントは、野生型と有意差はない速度で複製する場合は、それらの変異の頻度の比較を直接行うことができます。レプリケーションの速度で非常に重要な変更が存在する場合、データは複製を同じサイクル数を受けたウイルスを比較することによって、例えば運動の違い、を考慮して正規化する必要があります。ワンステップの成長速度に有意差が野生型と高忠実度の亜種間で観察されなかったものの、我々の経験では、、（内々には、より高い忠実度の亜種が一貫して野生型に比べて（1ログ内の）より高い力価が観察しかし、彼らはわずかにRNAを作る同程度の大きさ）は、さらにそれらが生み出すゲノムが少ない突然変異を含む多くの感染、従ってであることを示唆している。 サンプル調製とシーケンシングは。これらのプロトコルのすべての手順については、それは彼らが生物学的に関連する変異と区別できないので、高忠実度、プルーフリーディング酵素は、さらなる変異を導入制限するためにPCRおよびRT - PCRに使用されることが不可欠です。それは比較されるウイルスの集団は十分な出発材料ができたことを確認することも重要であると同じ条件（流路の歴史、組織培養培地、温度、RNA抽出法、RT - PCRのプロトコル、等）で準備されていることが重要です強力なバンドがRT - PCRによって生成されるように、RNAの抽出から得られる。 RNAサンプルの1 / 100希釈は、試料が（何度も同じゲノムを増幅する）表現のバイアスを避けるために、RNA分子の十分な数字が含まれていることを示す、検出可能なRT - PCRのバンドを与える必要があります。変異頻度がディストリビューションなので、一つは前述のバイアス発生していないを提供し、同様の値に関係なく、人口規模の得られることを期待。図6に示すように、ウイルスストックの10 5倍希釈では、親の株と大幅に異なるがない突然変異の頻度を与えます。 TopoTAクローニングのための最適な条件が見つかるまで、シーケンスの前にコロニーPCRによって、青/白スクリーニング後の挿入の有無を確認する。である（ウイルスのゲノムに対応するのin vitro転写されたRNAの変異ノイズ（RT - PCRおよびシークエンシングによって導入された変異）、プラスミドベアリングから同じウイルス配列をPCR産物をクローンおよび/またはクローンとシーケンスRT - PCR産物のためのコントロールとしてin vitro転写酵素で異なるが）別のエラー率を持っていると、プロシージャの実際のバックグラウンドでエラーに有用な情報を得られない可能性があることに注意。いくつかのウイルスの配列は、バクテリアに有毒かもしれないので、突然変異の頻度のために配列決定されるウイルスゲノムの領域を決定する前にこれを確認することが重要です。 TopoTAによって得られた配列を分析する際に、各クローンは1つだけ挿入/配列を含む必要があることに注意して。ダブルピークが混合集団を示唆し、観察される場合、それは2つの隣接する細菌のコロニーが選択されている可能性があります。非常に低い突然変異は細菌培養におけるプラスミドの増幅の間に導入されたこと、細菌の複製に低い突然変異の周波数を与えられたが、それは、も可能です。プラークpのurified集団、ダブルピークが重なってプラーク、またはプラークの開発中に新たな変異を獲得したり突然変異を戻しているウイルスを表してもよい。一貫性と数えるかどうか、これらの変異をカウントするかどうかを決定します。 最後に、ここで使用される突然変異の頻度は相対値であることに留意してください。彼らは、同じ条件下で栽培したウイルス集団の比較でのみ有効であり、同じ領域に塩基配列を決定！これらは、突然変異率、または全体としてのゲノムの変異頻度の絶対値として解釈されるべきではない。しかし、条件が制御されている場合、それらは、突然変異の分布と周波数の差の再現性、定量的な比較を許可しません。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>リバビリン</td><td>シグマ</td><td> R9644 - 10mgの</td><td></td></tr><tr><td> 5 - フルオロウラシル</td><td>シグマ</td><td> F6627 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> 5 - アザシチジン</td><td>シグマ</td><td> A2385 - 100mgの</td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2の </td><td>シグマ</td><td> M1028 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2を </td><td>シグマ</td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマ</td><td> T8154 - 20mlの</td><td></td></tr><tr><td> TopoTAクローニングキット</td><td>インビトロジェン</td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange変異導入キット</td><td>アジレント</td><td> 200516 </td><td> cDNAの感染性クローンは入手可能である場合</td></tr><tr><td> 96ウェルミニプレップキット</td><td>マシュレ-ナーゲル</td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene、Sequencher </td><td> DNASTAR、ジーンコード株式会社</td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td>または他のアラインメントソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ウイルスの変異頻度のrnaウイルスと特性の忠実性の変異の分離

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNAウイルスは、自分のゲノムを複製するRNA依存性RNAポリメラーゼを使用してください。これらの酵素の本質的に高いエラー率は、ウイルスの適応と進化を容易に極端な人口の多様性の世代に大きな貢献しています。証拠を増やすと、RNAウイルスの固有誤差率、および結果として得られる変異の頻度は、ウイルスのポリメラーゼに微妙なアミノ酸の変化によって変調することができることを示しています。生化学的アッセイは、定款の忠実度の定量的測定を可能にするいくつかのウイルスRNAポリメラーゼのために存在しますが、ここで我々は忠実変える変異を同定する生化学的なアプローチな限り正確であることが証明されてRNAウイルスの変異の頻度を測定する簡単な方法を説明します。アプローチは、ほとんどの生物学の実験室で行うことができる、従来のウイルス学的およびシーケンシング技術を使用しています。異なるウイルスの数の経験に基づいて、我々は、忠実度の亜種を分離して統計的有意性のデータを生成する可能性を高めるために最適化する必要がある重要な手順を特定している。忠実変える変異の単離および特性は、ポリメラーゼの構造と機能1月3日に新たな洞察を提供することができます。さらに、これらの忠実度の亜種は、ウイルスの適応と進化4-7のメカニズムを特徴付けるのに有用なツールになります。

現在の記事は、RNAウイルスとどのように組織培養の忠実度の変化を確認するために、変異頻度のデータを使用するためのRNAポリメラーゼの忠実度の亜種を分離し、特徴付けるために必要な手順を説明します。

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNAウイルスは、ゲノムを複製するためにRNA依存性RNAポリメラーゼを利用している。これらの酵素が本質的に高い誤り率を持つことは、...の大きな要因となっている。

RNAウイルスは、ウイルスがコードするRNAポリメラーゼを用いてゲノムを複製します。これらのポリメラーゼは本質的にエラー率が高く、これによりウイルスは迅速に適応し、進化することが可能です。本ビデオでは、複製の際のエラー率または忠実度に影響を与えるRNAポリメラーゼの変異を持つウイルスをスクリーニングし、同定するための最適化された手法を紹介します。まず、細胞を死滅させたりウイルスの増殖を抑制したりせずに使用できる変異原の最大レベルを決定するため、ウイルス宿主細胞に変異原を添加します。最適条件が決定した後、RNA変異原による選択圧の下でウイルスを継代します。その後、変異原耐性集団の配列を解析し、原因となる変異を特定します。次に、変異原耐性変異体を単離します。複製キネティクスをモニタリングした結果、ポリメラーゼの忠実度の向上または低下が示されます。これは、RNA変異原に対する広範な耐性と、ウイルス集団の変異頻度の変化と同時に起こります。精製ポリメラーゼを用いた生化学的忠実度分析などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、組織培養が可能なあらゆるRNAウイルスに適用できる点にある。本手法は、ウイルス適応と進化におけるポリメラーゼ活性の役割など、ウイルス学分野における重要な疑問を解決するのに役立つ。一般的に、本手法に不慣れな者は、設定した選択圧が強すぎまたは弱すぎることや、解析する領域の配列サンプルサイズおよびクローン数が統計的検出力を確保するために最適化されていないことで、困難に直面することが多い。まず、以降の実験において細胞死を招かずに使用可能な変異原濃度の範囲を決定します。hilar細胞のサブコンフルエントな単層を含む6ウェルプレートから培地を吸引します。次に、変異原を添加した培地を2 mL加えます。ここでは、変異原としてリボビリン、5-フルオロウラシル、5-アザシチジン、塩化マグネシウム、および塩化マンガンを使用します。細胞を37°C、5%二酸化炭素条件下でインキュベートします。その後、2〜7日間、24時間ごとに1枚の細胞プレートを用いて、トリパンブルー排除法により生存率を確認します。ヘモサイトメーターを用いて、各変異原濃度における生存細胞率を算出してください。なお、感染エンドポイントまでに細胞死が50%未満となる未処理のコントロール条件も含めて算出します。最大タイターに達した理想的な状態で、次の手順として、集団を過剰に突然変異させずに、最適な選択圧をかけることができる突然変異剤の濃度を決定します。これにより、すべてのゲノムに少なくとも1〜2箇所の変異が導入されます。したがって、突然変異剤によって耐性変異が誘発され、その後の継代を通じて選択されることになります。あまりに多くの変異が導入されると、耐性変異を持つ変異体自体が致死的な影響を受けます。そのため、変異剤を添加した培地2 mLを用いて、6ウェルプレートに播種し、変異体の単離を妨げない範囲で、細胞死が50%を超えた濃度を除外した前述の濃度範囲を使用します。変異原を取り込ませるため、インキュベーション後2時間培養します。培地を吸引し、200 µLの低感染多重度（MOI）でウイルスを感染させ、ウイルスが細胞に感染するまで15〜60分間インキュベートします。その際、接種液が細胞単層全体に行き渡るよう、定期的にプレートを揺らしてください。接種したウイルスを吸引し、2 mLのPBSで2回洗浄して、接種液をできるだけ除去します。次に、変異原を含む培地を各ウェルに加え、通常2～7日間に相当する3～6回の複製サイクル分、細胞をインキュベートします。各ウェルからウイルスを回収し、標準的なプラークアッセイまたは限界希釈法を行い、算出されたタイターからウイルスタイターに対する抗ウイルス効果を判定します。未処理の対照感染群と比較してウイルスタイターを0.5～2 log減少させ、かつ細胞に対する毒性が高くない変異原の濃度を特定します。変異原耐性変異体を単離するには、理想的には毒性を50%未満に抑えます。まず、各変異原の最適濃度を用いて、ヒーラー細胞でウイルスを継代します。必要に応じて、各継代で最大30回まで継代を行う場合があります。ここで示すように、ウイルスのタイターを測定し、変異原を用いた感染と培養を繰り返します。変異原処理したサンプルのウイルスタイターは、元のウイルスタイターおよび未処理の対照ウイルスタイターと比較して、最初の数回の継代で低下するはずです。特定のシリーズのウイルスタイターが、未処理の対照タイターと同程度の大きさに達した時点で、耐性が示唆されます。標的ウイルスのポリメラーゼまたはレプリカーゼ遺伝子を増幅するプライマーを用いて、シーケンシング用のウイルスRNAを抽出します。RT-PCRによりウイルスゲノムのcDNAを合成し、その後DNAをシーケンシングします。配列情報が得られた後、アライメントソフトウェアを用いて、得られた配列をリファレンスコンセンサスとアライメントし、新たな点変異を特定します。さらに、アライメントソフトウェアでは見落とされた可能性があるマイノリティピークがないか、クロマトグラムを確認してください。全集団の20〜30%を占める変異体は依然としてピークとして現れますが、標準的な配列解析では混合ヌクレオチドとして識別するには小さすぎます。目的の変異を特定するには、ここに示されているように、同一継代の未処理コントロールと比較して、変異原処理した集団にのみ特異的に現れる一塩基多型を探します。変異が特定されたら、感染性cDNAから耐性変異体を再構築するか、組織培養で単離し、耐性表現型を確認する必要があります。ここでは、同定した変異株を分離するためにプラークアッセイを行います。窒素耐性サンプルの段階希釈液を調製し、37°C、5% CO₂で1時間インキュベートした後、6ウェルプレート上の細胞単層に加えてプラークアッセイを行います。感染から2〜5日後にアガロースオーバーレイを追加します。プラークがはっきりと確認できる必要があります。理想的には、プレートのいずれかで10個から50個の十分に分離したプラークが形成されている状態となります。マーカーを使用してプレート上のプラークの位置に点を打って印を付けます。その際、アガロースオーバーレイの位置をずらしたり動かしたりしないよう注意し、P 200フィルターチップをアガロースオーバーレイにそっと刺し入れてください。プラークを回収するため、チップをオーバーレイから慎重に持ち上げ、arosプラグを250 µLの培地が入ったマイクロ遠心チューブに移します。arosプラグがチップから離れているかどうかにかかわらず、十分な量のウイルスが転移します。チューブを10回ほどボルテックス処理して回収します。後で生ウイルスを増幅させるために、サンプルのの一部を保存しておきます。その後、サンプルの残分からRNAを抽出し、RT-PCRを行って、目的の変異を含むプラークサンプルを同定します。cDNAをシーケンシングし、追加の変異がないことを確認してください。その後、すべての下流研究に使用するため、このウイルスのストックを大量に調製します。次に、同定された変異によって付与される耐性を確認します。いくつかの変異原条件下で、変異原アッセイを繰り返します。変異体が複数の変異原に対して耐性を持つ場合、その忠実度が向上している可能性があります。忠実度を変化させる変異はポリメラーゼにマッピングされるため、複製キネティクスが著しく変化していないことを確認することが重要です。変異頻度を決定する前に、少なくとも2つの相補的なアプローチで複製を確認してください。例えば、定量R-T-P-C-RやノーザンブロットなどのRNA合成を調べる手法に加え、プラークアッセイやTCID 50などのウイルス産生を調べる手法を併用することがあります。次に、耐性を付与するポリメラーゼの変化が複製能を変化させていないかを確認するため、忠実度変異頻度を測定します。これは、生存ウイルス集団または全ウイルス集団のいずれかで行うことができます。生存可能な変異体と生存不可能な変異体の両方を含む全ウイルス集団の変異頻度を決定するために、RNAを抽出し、構造タンパク質をコードする領域など、遺伝的変異があることが分かっているコード配列から800〜1,200ヌクレオチドの領域をRT-PCRで増幅させます。次に、研究対象となる各ウイルス集団について、精製した産物をtopo TAクローニングします。X-galコートプレート上のブルーホワイトスクリーニングにより、インサートが正であると確認された96個のコロニーを選択します。ブルーホワイトスクリーニングの妥当性を確認するため、シングルコロニーPCRを行います。上記のフラグメントサイズと条件を用いれば、コロニーの約90%が陽性となるはずです。陽性のホワイトコロニーについて、爪楊枝を用いて各コロニーを96ウェルプレート内の1 mLのLB培地へ的に移します。細菌培養プレートを37°Cで定常的に振盪しながら一晩インキュベートします。翌日、96ウェル形式でミニプレップを行いDNAを単離し、クローン断片の最大限のカバレッジを得るのに十分なプライマーを用いて各プレートをシーケンスします。600塩基をカバーする2本のプライマーで十分であると考えられます。各集団のリファレンス配列またはコンセンサス配列と、一塩基多型（SNP）を容易に特定できる適切なアライメントソフトウェアを用いて配列解析を行ってください。DNASTAR社のソフトウェアの利用を検討してください。まず、ベースコーリングに不備がある末端部分や、長さが短すぎるものなど、品質の低い配列を除去します。残った配列をアライメントし、解析に用いるすべての配列に共通してカバーされているヌクレオチド範囲を特定します。この領域全体を完全にカバーしていないクローンは廃棄してください。比較を行うため、同一の領域が完全にカバーされていることが不可欠です。参照株とは異なる一塩基多型（SNP）を特定し、その数を数えます。全シングルヌクレオチド多型（SNP）の数を、シーケンシングされた全ヌクレオチド数で除して変異頻度を算出します。この数値を、シーケンシングされた10,000ヌクレオチドあたりの平均変異数として示してください。同一のシングルヌクレオチド多型が多数のクローンで確認された場合は、これらの重複した変異を含む値と除外した値の2つを提示してください。変異分布を決定します。各ポピュレーションにおいて、0、1、2、3などの変異を持つクローンの数をランキング形式のリストにします。オプションとしてシーケンスした領域内の変異を解析します。編集した配列を用いて、サンプル内のすべての可能なペアワイズ比較を行い、集団多様性の平均値を算出します。ここでは、いくつかのアライメントプログラムが利用可能です。MEGAとしても知られる分子進化遺伝学解析プログラムを使用して、RNA変異剤耐性に対する最適な選択条件を決定します。細胞を濃度の異なるリボビリンで処理し、野生型Cox AKI Bウイルスを感染多重度（MOI）0.0 1で感染させ、感染後48時間まで培養しました。子ウイルスを回収し、TCID₅₀によって力価を決定しました。この図のx軸下は、感染後48時間のトリパンブルー染色によって決定された、処理後に生存した細胞の割合を示しています。結果から、100および200 µMの濃度で、細胞生存率に影響を与えることなく、ウイルス価を1〜2 log減少させることが示されました。変異原耐性集団を選抜するため、灰色のバーで示す50 µMのリボバリン存在下、または黒色のバーで示す不在下で、hilar細胞にCHI gangaウイルスを感染させました。各継代後、ここに示されるように、BHK細胞を用いた従来のプラークアッセイによりウイルス子孫量を定量しました。変異原の効果は、処理したウイルス価が2 log低下した最初の数回の継代において顕著に現れています。次第にTitusは未処理の状態と同等のレベルまで回復しました。5つの変異原処理集団と未処理集団との間に有意な差は観察されず、耐性変異体が選択されたことが示唆されました。実際に、リボバリン処理を受けたウイルス集団のシーケンシングにより、特有の変異が同定され、構造の異なる様々なRNA変異原に対する広範な耐性が確認されました。スクリーニングで最初に単離されたCOA virus B threeの高忠実度A 3 72 V変異体を用いて、異なる濃度のRNA変異原であるRIBOVIRIN、5-フルオロウラシル、5-アザシチジンに対する感受性の低下を検証しました。細胞を指示された濃度のリボビリンで処理し、野生型Coxsackievirus B3を感染多重度0.01で感染させた。感染から48時間後に子ウイルスを回収し、TCID₅₀により力価を決定した。ここに、変異原濃度に対する野生型およびA372V変異体の力価を示す。A372Vは一貫して野生型よりも高い力価を示した。ウイルスの産生に関する一段階増殖曲線を決定するためにテストしたすべての条件下で、細胞を野生型、高忠実度変異体A372V、または複製不全変異体CX64のいずれかのCox AKI virus B3を用いて、感染多重度10で感染させました。示された時点において、凍結融解法により細胞および上清から子ウイルス粒子を回収し、TCID₅₀によってタイターを測定しました。A372Vの忠実度の向上は、組織培養における観察可能な複製欠損とは一致しません。変異体CX64は、複製キネティクスに顕著な遅延を示し、最大タイターは野生型ウイルスの1000分の1にとどまりました。このビデオで説明した手法を用いることで、シーケンスされる各クローンはウイルス集団全体の個別のゲノムに由来し、したがって固有の変異を保持することになります。この図は、低品質の配列をクリーンアップし、一塩基多型を可視化した後の典型的なアライメントを示しています。集団内の合計一塩基多型数を算出し、各クローンに現れる一塩基多型数を記録しました。例えば、バーで下線が引かれたクローンには2つの固有の変異が含まれていますが、他の8つのクローンには単一の固有の変異が含まれています。このデータは、ここに示すような表を作成するために使用されます。この表は、変異数によるシーケンス済みクローンの順位分布を示しています。順位付けされた値の統計的比較により、ある分布が別の分布と有意に異なるかどうかを判断できます。解釈を容易にするため、配列解析および統計解析から得られた数値データは、チャートまたはヒストグラムとして表現することが可能です。ここで示すように、A 3 72 V ウイルスは野生型よりも変異数が少なく、P 値が 0.01 未満であり、変異頻度が有意に低いことがわかります。同一のchicken ganga virus集団からは、ウイルスストックを用いるか、あるいは10の5乗倍希釈液を用いてRNA抽出を行うかに関わらず、同様の変異頻度が得られます。したがって、本手順に従った後、このポリメラーゼ変異体における正確性の機序および構造的基盤をより深く理解するために、in vitroでの生化学的アッセイや結晶化研究を行うことが推奨されます。この開発を経て、本手法は生物学分野の研究者が、生体内における遺伝的多様性とウイルスの適応度の相関性を探究するための道を開きました。このビデオを視聴することで、RNAウイルスのフィデリティ変異株を分離できる確率を高める方法と、変異頻度を用いてこれらのフィデリティの差を特定する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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