ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNAウイルスは、ウイルスがコードするRNAポリメラーゼを用いてゲノムを複製します。これらのポリメラーゼは本質的にエラー率が高く、これによりウイルスは迅速に適応し、進化することが可能です。本ビデオでは、複製の際のエラー率または忠実度に影響を与えるRNAポリメラーゼの変異を持つウイルスをスクリーニングし、同定するための最適化された手法を紹介します。

まず、細胞を死滅させたりウイルスの増殖を抑制したりせずに使用できる変異原の最大レベルを決定するため、ウイルス宿主細胞に変異原を添加します。最適条件が決定した後、RNA変異原による選択圧の下でウイルスを継代します。その後、変異原耐性集団の配列を解析し、原因となる変異を特定します。

次に、変異原耐性変異体を単離します。複製キネティクスをモニタリングした結果、ポリメラーゼの忠実度の向上または低下が示されます。これは、RNA変異原に対する広範な耐性と、ウイルス集団の変異頻度の変化と同時に起こります。

精製ポリメラーゼを用いた生化学的忠実度分析などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、組織培養が可能なあらゆるRNAウイルスに適用できる点にある。本手法は、ウイルス適応と進化におけるポリメラーゼ活性の役割など、ウイルス学分野における重要な疑問を解決するのに役立つ。一般的に、本手法に不慣れな者は、設定した選択圧が強すぎまたは弱すぎることや、解析する領域の配列サンプルサイズおよびクローン数が統計的検出力を確保するために最適化されていないことで、困難に直面することが多い。

まず、以降の実験において細胞死を招かずに使用可能な変異原濃度の範囲を決定します。hilar細胞のサブコンフルエントな単層を含む6ウェルプレートから培地を吸引します。次に、変異原を添加した培地を2 mL加えます。ここでは、変異原としてリボビリン、5-フルオロウラシル、5-アザシチジン、塩化マグネシウム、および塩化マンガンを使用します。

細胞を37°C、5%二酸化炭素条件下でインキュベートします。その後、2〜7日間、24時間ごとに1枚の細胞プレートを用いて、トリパンブルー排除法により生存率を確認します。ヘモサイトメーターを用いて、各変異原濃度における生存細胞率を算出してください。なお、感染エンドポイントまでに細胞死が50%未満となる未処理のコントロール条件も含めて算出します。

最大タイターに達した理想的な状態で、次の手順として、集団を過剰に突然変異させずに、最適な選択圧をかけることができる突然変異剤の濃度を決定します。これにより、すべてのゲノムに少なくとも1〜2箇所の変異が導入されます。したがって、突然変異剤によって耐性変異が誘発され、その後の継代を通じて選択されることになります。

あまりに多くの変異が導入されると、耐性変異を持つ変異体自体が致死的な影響を受けます。そのため、変異剤を添加した培地2 mLを用いて、6ウェルプレートに播種し、変異体の単離を妨げない範囲で、細胞死が50%を超えた濃度を除外した前述の濃度範囲を使用します。

変異原を取り込ませるため、インキュベーション後2時間培養します。培地を吸引し、200 µLの低感染多重度（MOI）でウイルスを感染させ、ウイルスが細胞に感染するまで15〜60分間インキュベートします。その際、接種液が細胞単層全体に行き渡るよう、定期的にプレートを揺らしてください。接種したウイルスを吸引し、2 mLのPBSで2回洗浄して、接種液をできるだけ除去します。

次に、変異原を含む培地を各ウェルに加え、通常2～7日間に相当する3～6回の複製サイクル分、細胞をインキュベートします。各ウェルからウイルスを回収し、標準的なプラークアッセイまたは限界希釈法を行い、算出されたタイターからウイルスタイターに対する抗ウイルス効果を判定します。未処理の対照感染群と比較してウイルスタイターを0.5～2 log減少させ、かつ細胞に対する毒性が高くない変異原の濃度を特定します。

変異原耐性変異体を単離するには、理想的には毒性を50%未満に抑えます。まず、各変異原の最適濃度を用いて、ヒーラー細胞でウイルスを継代します。必要に応じて、各継代で最大30回まで継代を行う場合があります。ここで示すように、ウイルスのタイターを測定し、変異原を用いた感染と培養を繰り返します。変異原処理したサンプルのウイルスタイターは、元のウイルスタイターおよび未処理の対照ウイルスタイターと比較して、最初の数回の継代で低下するはずです。特定のシリーズのウイルスタイターが、未処理の対照タイターと同程度の大きさに達した時点で、耐性が示唆されます。

標的ウイルスのポリメラーゼまたはレプリカーゼ遺伝子を増幅するプライマーを用いて、シーケンシング用のウイルスRNAを抽出します。RT-PCRによりウイルスゲノムのcDNAを合成し、その後DNAをシーケンシングします。配列情報が得られた後、

アライメントソフトウェアを用いて、得られた配列をリファレンスコンセンサスとアライメントし、新たな点変異を特定します。さらに、アライメントソフトウェアでは見落とされた可能性があるマイノリティピークがないか、クロマトグラムを確認してください。全集団の20〜30%を占める変異体は依然としてピークとして現れますが、標準的な配列解析では混合ヌクレオチドとして識別するには小さすぎます。目的の変異を特定するには、ここに示されているように、同一継代の未処理コントロールと比較して、変異原処理した集団にのみ特異的に現れる一塩基多型を探します。変異が特定されたら、感染性cDNAから耐性変異体を再構築するか、組織培養で単離し、耐性表現型を確認する必要があります。

ここでは、同定した変異株を分離するためにプラークアッセイを行います。窒素耐性サンプルの段階希釈液を調製し、37°C、5% CO₂で1時間インキュベートした後、6ウェルプレート上の細胞単層に加えてプラークアッセイを行います。感染から2〜5日後にアガロースオーバーレイを追加します。

プラークがはっきりと確認できる必要があります。理想的には、プレートのいずれかで10個から50個の十分に分離したプラークが形成されている状態となります。マーカーを使用してプレート上のプラークの位置に点を打って印を付けます。その際、アガロースオーバーレイの位置をずらしたり動かしたりしないよう注意し、P 200フィルターチップをアガロースオーバーレイにそっと刺し入れてください。

プラークを回収するため、チップをオーバーレイから慎重に持ち上げ、arosプラグを250 µLの培地が入ったマイクロ遠心チューブに移します。arosプラグがチップから離れているかどうかにかかわらず、十分な量のウイルスが転移します。チューブを10回ほどボルテックス処理して回収します。後で生ウイルスを増幅させるために、サンプルのの一部を保存しておきます。

その後、サンプルの残分からRNAを抽出し、RT-PCRを行って、目的の変異を含むプラークサンプルを同定します。cDNAをシーケンシングし、追加の変異がないことを確認してください。

その後、すべての下流研究に使用するため、このウイルスのストックを大量に調製します。次に、同定された変異によって付与される耐性を確認します。いくつかの変異原条件下で、変異原アッセイを繰り返します。

変異体が複数の変異原に対して耐性を持つ場合、その忠実度が向上している可能性があります。忠実度を変化させる変異はポリメラーゼにマッピングされるため、複製キネティクスが著しく変化していないことを確認することが重要です。変異頻度を決定する前に、少なくとも2つの相補的なアプローチで複製を確認してください。

例えば、定量R-T-P-C-RやノーザンブロットなどのRNA合成を調べる手法に加え、プラークアッセイやTCID 50などのウイルス産生を調べる手法を併用することがあります。次に、耐性を付与するポリメラーゼの変化が複製能を変化させていないかを確認するため、忠実度変異頻度を測定します。これは、生存ウイルス集団または全ウイルス集団のいずれかで行うことができます。

生存可能な変異体と生存不可能な変異体の両方を含む全ウイルス集団の変異頻度を決定するために、RNAを抽出し、構造タンパク質をコードする領域など、遺伝的変異があることが分かっているコード配列から800〜1,200ヌクレオチドの領域をRT-PCRで増幅させます。次に、研究対象となる各ウイルス集団について、精製した産物をtopo TAクローニングします。X-galコートプレート上のブルーホワイトスクリーニングにより、インサートが正であると確認された96個のコロニーを選択します。

ブルーホワイトスクリーニングの妥当性を確認するため、シングルコロニーPCRを行います。上記のフラグメントサイズと条件を用いれば、コロニーの約90%が陽性となるはずです。陽性のホワイトコロニーについて、爪楊枝を用いて各コロニーを96ウェルプレート内の1 mLのLB培地へ的に移します。

細菌培養プレートを37°Cで定常的に振盪しながら一晩インキュベートします。翌日、96ウェル形式でミニプレップを行いDNAを単離し、クローン断片の最大限のカバレッジを得るのに十分なプライマーを用いて各プレートをシーケンスします。

600塩基をカバーする2本のプライマーで十分であると考えられます。各集団のリファレンス配列またはコンセンサス配列と、一塩基多型（SNP）を容易に特定できる適切なアライメントソフトウェアを用いて配列解析を行ってください。DNASTAR社のソフトウェアの利用を検討してください。

まず、ベースコーリングに不備がある末端部分や、長さが短すぎるものなど、品質の低い配列を除去します。残った配列をアライメントし、解析に用いるすべての配列に共通してカバーされているヌクレオチド範囲を特定します。

この領域全体を完全にカバーしていないクローンは廃棄してください。比較を行うため、同一の領域が完全にカバーされていることが不可欠です。参照株とは異なる一塩基多型（SNP）を特定し、その数を数えます。

全シングルヌクレオチド多型（SNP）の数を、シーケンシングされた全ヌクレオチド数で除して変異頻度を算出します。この数値を、シーケンシングされた10,000ヌクレオチドあたりの平均変異数として示してください。同一のシングルヌクレオチド多型が多数のクローンで確認された場合は、これらの重複した変異を含む値と除外した値の2つを提示してください。

変異分布を決定します。各ポピュレーションにおいて、0、1、2、3などの変異を持つクローンの数をランキング形式のリストにします。オプションとしてシーケンスした領域内の変異を解析します。

編集した配列を用いて、サンプル内のすべての可能なペアワイズ比較を行い、集団多様性の平均値を算出します。ここでは、いくつかのアライメントプログラムが利用可能です。MEGAとしても知られる分子進化遺伝学解析プログラムを使用して、RNA変異剤耐性に対する最適な選択条件を決定します。

細胞を濃度の異なるリボビリンで処理し、野生型Cox AKI Bウイルスを感染多重度（MOI）0.0 1で感染させ、感染後48時間まで培養しました。子ウイルスを回収し、TCID₅₀によって力価を決定しました。この図のx軸下は、感染後48時間のトリパンブルー染色によって決定された、処理後に生存した細胞の割合を示しています。

結果から、100および200 µMの濃度で、細胞生存率に影響を与えることなく、ウイルス価を1〜2 log減少させることが示されました。変異原耐性集団を選抜するため、灰色のバーで示す50 µMのリボバリン存在下、または黒色のバーで示す不在下で、hilar細胞にCHI gangaウイルスを感染させました。各継代後、ここに示されるように、BHK細胞を用いた従来のプラークアッセイによりウイルス子孫量を定量しました。変異原の効果は、処理したウイルス価が2 log低下した最初の数回の継代において顕著に現れています。

次第にTitusは未処理の状態と同等のレベルまで回復しました。5つの変異原処理集団と未処理集団との間に有意な差は観察されず、耐性変異体が選択されたことが示唆されました。実際に、リボバリン処理を受けたウイルス集団のシーケンシングにより、特有の変異が同定され、構造の異なる様々なRNA変異原に対する広範な耐性が確認されました。スクリーニングで最初に単離されたCOA virus B threeの高忠実度A 3 72 V変異体を用いて、異なる濃度のRNA変異原であるRIBOVIRIN、5-フルオロウラシル、5-アザシチジンに対する感受性の低下を検証しました。

細胞を指示された濃度のリボビリンで処理し、野生型Coxsackievirus B3を感染多重度0.01で感染させた。感染から48時間後に子ウイルスを回収し、TCID₅₀により力価を決定した。ここに、変異原濃度に対する野生型およびA372V変異体の力価を示す。A372Vは一貫して野生型よりも高い力価を示した。

ウイルスの産生に関する一段階増殖曲線を決定するためにテストしたすべての条件下で、細胞を野生型、高忠実度変異体A372V、または複製不全変異体CX64のいずれかのCox AKI virus B3を用いて、感染多重度10で感染させました。示された時点において、凍結融解法により細胞および上清から子ウイルス粒子を回収し、TCID₅₀によってタイターを測定しました。A372Vの忠実度の向上は、組織培養における観察可能な複製欠損とは一致しません。変異体CX64は、複製キネティクスに顕著な遅延を示し、最大タイターは野生型ウイルスの1000分の1にとどまりました。

このビデオで説明した手法を用いることで、シーケンスされる各クローンはウイルス集団全体の個別のゲノムに由来し、したがって固有の変異を保持することになります。この図は、低品質の配列をクリーンアップし、一塩基多型を可視化した後の典型的なアライメントを示しています。集団内の合計一塩基多型数を算出し、各クローンに現れる一塩基多型数を記録しました。

例えば、バーで下線が引かれたクローンには2つの固有の変異が含まれていますが、他の8つのクローンには単一の固有の変異が含まれています。このデータは、ここに示すような表を作成するために使用されます。この表は、変異数によるシーケンス済みクローンの順位分布を示しています。

順位付けされた値の統計的比較により、ある分布が別の分布と有意に異なるかどうかを判断できます。解釈を容易にするため、配列解析および統計解析から得られた数値データは、チャートまたはヒストグラムとして表現することが可能です。ここで示すように、A 3 72 V ウイルスは野生型よりも変異数が少なく、P 値が 0.01 未満であり、変異頻度が有意に低いことがわかります。

同一のchicken ganga virus集団からは、ウイルスストックを用いるか、あるいは10の5乗倍希釈液を用いてRNA抽出を行うかに関わらず、同様の変異頻度が得られます。したがって、本手順に従った後、このポリメラーゼ変異体における正確性の機序および構造的基盤をより深く理解するために、in vitroでの生化学的アッセイや結晶化研究を行うことが推奨されます。

この開発を経て、本手法は生物学分野の研究者が、生体内における遺伝的多様性とウイルスの適応度の相関性を探究するための道を開きました。このビデオを視聴することで、RNAウイルスのフィデリティ変異株を分離できる確率を高める方法と、変異頻度を用いてこれらのフィデリティの差を特定する方法について、十分に理解できるはずです。