細菌感染定量アッセイ:細菌性眼内炎のマウスモデルにおける眼内細菌負荷を定量化する方法

細菌性眼内炎は、病原菌であるセレウス菌が眼内領域に感染したときに発生する炎症性眼疾患です。

細菌感染を定量化するには、細菌性眼内炎の安楽死マウスモデルを手術台に横方向に置きます。眼球を眼窩から外すのを助けるために、目の下に軽い圧力を加えます。眼球を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した適切なバッファーを含むチューブに移します。

眼組織を均質化して崩壊させ、懸濁液中の細菌を放出します。バッファー中に存在するプロテアーゼ阻害剤は、放出された細胞プロテアーゼを不活性化して細菌の生存率を維持します。次に、細菌懸濁液を連続的に希釈して、さまざまな濃度のセレウス菌を得る。

濃縮寒天培地を含む角度の付いた培養プレートを取り、各希釈濃度に対応する行を区切ります。指定された列の上部にある細菌懸濁液から数滴を分配し、プレートの端に達するまで流れ落ちるようにすることで、細菌の均一な拡散を助けます。プレートを平らにしてインキュベートします。

インキュベーション中、各細菌は寒天からの栄養素を使用して増殖し、個々のコロニーを形成します。コロニーの数は減少し、細菌懸濁液の希釈の増加に対応します。特定の行のコロニー数を数えて、眼の細菌負荷を定量化します。

適切な実験エンドポイントで、プロテアーゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルのPBSを、氷上の1つの目ごとに1つの標識オートクレーブ収穫チューブに加え、感染した目の両側に開いた細い先端鉗子を置きます。先端を頭に向かって押し下げて、目をプロトトメントします。

トングがアイグローブの後ろに来たら、トングを一緒に握り、鉗子を頭から引き離して眼球を外します。次に、すぐに眼球を適切にラベル付けされた採取チューブに入れます。サンプル採取から60分以内に、閉じた採取チューブを組織ホモジナイザーに入れ、サンプルを2回1分間のホモジナイズ期間、その間に30秒間の休憩時間で均質化します。

均質化後、サンプルを氷の上に置き、20マイクロリットルのホモジネートのアリコートを使用して、1倍の10から負の8に達するまで、希釈ごとに180マイクロリットルのPBSでサンプルを連続的に希釈します。次に、予熱した正方形のBHIプレートの各列に適切な希釈濃度でラベルを付け、プレートを45度の角度に傾けた状態で、各希釈液10マイクロリットルをプレート上部の個々の列に加えます。プレートを平らに置く前に、各サンプルをプレートの底にほぼ到達するまで実行します。サンプルが寒天に吸収されたら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに移します。コロニーは、8時間のインキュベーション後に見え始めるはずです。

サンプル中の濃度を正確に表すには、10〜100コロニーの行を数えます。