マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

Newly John博士の研究室へようこそ。前回のビデオでは、研究者がニューロンの細胞体と純粋な軸索分画を分離できるプラットフォームである、ニューロンデバイスの作製方法を実演しました。デバイスの作製にはソフトリソグラフィーという技術を用いており、これはフォトリソグラフィーを用いて事前に作製したデバイス設計を含むシリコンウェハー上に、PDMSをキャストして硬化させる工程で構成されています。

このビデオでは、出生後18日目のラット皮質ニューロンの準備方法と、ニューロンデバイスにニューロンをロードする方法を実演します。それでは、本日の実演を担当するKiana Leeを紹介します。

実験を開始する前に、必要なすべての培地および試薬をウォーターバスで37 °Cに加温しておくことが重要です。ここでは、Neurobasal培地、0.25% trypsin、および10% FBS含有DMEMが用意されています。細胞の操作に使用し、クリーンベンチ内に配置するすべての物品は、滅菌済みであること、および70% ethanolで拭き上げられていることを確認してください。

まず、組織培養フードを70% ethanolで拭き上げます。次に、チューブを保持するためのプラスチックラックにethanolをスプレーします。続いて、3本線画線法に使用するゴムボールをethanolで洗浄します。

十分に乾燥させる時間を確保するため、この操作を早い段階で行うことが重要です。次に、必要な試薬をエタノールで拭き取り、フード内へ移動させます。あらかじめ解剖された1個の脳に相当する2片のE18ラット胎児皮質を、1 mLの氷冷したカルシウムおよびマグネシウムフリーの解剖バッファーを含む15 mLチューブに入れます。この解剖バッファー中の皮質に0.25% trypsin EDTAを1 mL加え、最終容量を2 mL、最終trypsin濃度を0.125%にします。trypsinを添加した皮質を含む15 mLチューブを37 °Cのウォーターバスに8分間静置し、胎児皮質を37 °Cでtrypsin処理しながらインキュベートします。

3本のペーストピペットを火炎研磨します。ガラスピペットの先端を、火炎の青い部分に近いところで軽く炎に接触させ、開口部がちょうどオレンジ色に変わるまでゆっくりと回転させます。オレンジ色に変わったところで...

ガラスピペットを回転させ続け、潰れないようにすることが重要です。ガラスピペットの開口部は、順に小さくなっていることに注意してください。また、開口部を小さくしすぎないことが重要です。開口部が小さすぎると、皮質を37 °Cで8分間トリプシン処理した後に細胞が溶解する原因となるためです。トリプシン反応を停止させるため、10% FBS含有DMEMを10 mL、皮質に添加します。

皮質と10%FBS含有DMEMが入った15 mlチューブを、2,500 RPMで2分間遠心分離します。バイオセーフティキャビネット内で、ガラスピペットに取り付けた真空吸引装置を用いて、皮質から上清を除去します。この際、ペレットを乱したり、剥がしたりしないように注意してください。

B 27およびグルタミン酸を含む神経基底培地 1 mlを皮質ペレットに加え、ピペットで穏やかに吸い上げと吐き出しを繰り返します。気泡は酸化により細胞を損傷させる可能性があるため、ピペッティング時に気泡を発生させないことが非常に重要です。次に、開口部が最も広い火 polishing 処理済みの後方ピペットを使用し、ピペットの端に滅菌済みのゴムバルブを取り付けて、約5回ピペッティングして皮質をトリチュレーション（細胞分散）します。

気泡が混入しないように注意してください。これで、開口部を小さくした他の2本のガラスピペットについても、同様の操作を継続します。前述の通り、トリストリエーション（三段階線条希釈）の過程で気泡を混入させないようにすることが重要です。

また、可視的な塊が見えなくなったことに気づくはずです。培地の中で皮質の塊が一切見えなくなるまで、トリチュレーションを継続することが重要です。その後、細胞を再び 2, 500 RPM で 2 分間遠心分離します。

これは、2つの皮質片から得られることが予想されるペレットのおおよそのサイズです。遠心分離後、上清を細胞ペレットから再び除去します。上清を除去した後、B 27およびグルタミン酸を含む1 mlのNeurobasal培地を皮質に加え、皮質を再懸濁します。

気泡の混入を避け、細胞ペレットが均一に分散し、凝集が解消されるように、再びピペットで慎重に吸い上げと吐き出しを繰り返します。細胞懸濁液にニューロベーサル培地をさらに1 mL加え、最終容量を2 mLにします。次に、再懸濁した細胞溶液をBD biosciencesの40 µmセルストレーナーでろ過し、細胞数のカウントと生存率の評価を行います。

滅菌済みのマイクロ遠心チューブに、新鮮なNeural Basal Mediumを60 µL分注します。次に、この60 µLのNeural Basal Mediumに細胞懸濁液を20 µL加え、最後に、Neural Basal Medium中の細胞にトリパンブルーを20 µL加えます。トリパンブルーで染色した後、死細胞が染色されます。

20 µLをヘモサイトメーターに分注し、顕微鏡下で観察します。生存細胞は透明で透き通って見えますが、細胞膜に穴が開いた細胞はトリパンブルーにより青く染色されます。通常、1つの皮質あたり約250万個から800万個の細胞が得られます。

通常、1つの脳から2片の大脳皮質を採取し、最終的に2 mLの容量で細胞を再懸濁します。したがって、最終的な細胞濃度は通常、2.5 million cells/mLから8 million cells/mLの間になります。通常、1デバイスあたり約20 µLの細胞をロードします。

これにより、デバイス1個あたりの細胞数は50,000 cellsから160,000 cellsの範囲になります。細胞密度はアプリケーションに応じて変更可能です。ただし、初代ニューロンを低すぎる密度で播種すると、通常は細胞死を招きます。神経基底培地を充填して事前に準備したデバイスを、無菌状態を維持するためにバイオセーフティキャビネット内に取り出します。

ウェル内の余剰な培地をバキュームセクションで除去します。ただし、すべての培地を除去しないよう注意してください。メインチャネルには培地が残っている必要があり、リザーバーからのみ培地を吸引してください。

デバイスの左上のリザーバーに、20 µLの細胞を注入します。細胞はデバイス内に流れ込み、PLL処理された表面に接着します。ここで、細胞がメインチャネル内を流れ下る様子を確認でき、一部の細胞が実際にガラスに接着し始めるのが分かります。

播種後、細胞を含むデバイスをインキュベーターに約10分間戻し、細胞を接着させます。10分後、デバイスを再びバイオセーフティキャビネットに移し、リザーバーに培地を満たしてから、デバイスをインキュベーターに戻します。留意すべき重要な点として、インキュベーターの性能や培地に必要とされる湿度レベルに応じて、2〜3日ごとにデバイス内の培地を交換する必要がある場合があります。

新鮮な培地を上のウェルに入れ、すべてのリザーバーを満たす前に、一部の新鮮な培地をデバイス内およびメインチャネルに流すことが推奨されます。ここでは、生細胞を染色する細胞透過性染料であるカルシウム用染料を用いて、ニューロンを可視化しています。ここでは、細胞体、軸索、および樹状突起が含まれるデバイスの細胞側コンパートメントを確認できます。

デバイス全体をパンして見ると、軸索がデバイスの反対側、すなわち純粋な軸索画分が含まれる軸索側に到達するために成長するマイクログルーブ（微細溝）が確認できます。デモンストレーションのため、これらの蛍光標識された細胞を用いて軸索切断の手順を説明します。

ニューロンデバイスの特性の一つに、デバイス内の純粋な軸索画分から軸索を切断する「axotomy（軸索切断）」を研究者が行えることが挙げられます。これにより、軸索再生などの研究が可能となります。ここでは、Keanoがニューロンデバイスでのaxotomyの実施方法を実演します。axotomyは真空を用いて行われます。

滅菌済みのガラスピペットをウェルの軸索側の底面開口部に配置し、培地を真空吸引で除去します。メインチャネル内の培地を含め、デバイスの軸索側からすべての培地を完全に除去してください。培地を除去した後、この操作を繰り返すには、ピペットのチップをメインチャネルの開口部に配置し、ピペットを強く押し込んで150 µLの培地をメインチャネルに注入します。

次に、メインチャネルの開口部とデバイスの軸索側の上部ウェルに真空を適用します。再び真空を用いて、メインチャネルを含む軸索側からすべての培地を除去します。その後、ピペットのチップをメインチャネルの開口部に当て、力を入れてピペットを押し出すことで、150 µLの培地をメインチャネル内に強制的に注入します。

この時点で、研究者は顕微鏡下でデバイスを観察し、軸索の切断効率を確認できます。軸索が十分に切断されていない場合は、必要に応じてこの工程を繰り返してください。このビデオでは、E 18 胎児ラット皮質ニューロンを調製し、ニューロンデバイスにロードする方法について説明しました。

これらのデバイスの最大の利点は、デバイスの一方でニューロン細胞体を培養し、もう一方では純粋な軸索画分を分離して区画化できることです。このビデオが有益で役立つものであったなら幸いです。それでは、John Labから以上となります。

ご視聴ありがとうございました。