Name: マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学ぶE18ラット大脳皮質ニューロンの分離とマイクロ流体デバイスへのロード法。トリプシン処理と火磨きピペットを用いた細胞解離、台盼藍による生存率評価、軸索切断実験への応用を解説。神経科学研究に必須の技術です。

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コンパートメントのためのE18胎児ラット皮質ニューロンの準備出開始する前に、それは37℃に必要なすべての培地および試薬を温めることが重要です。 70％エタノールでダウン拭いて、ボンネットに配置されている細胞（例えば、ゴムの球根、チューブラック、メディアのボトルなど）、およびその調製のために使用されるすべてのものを殺菌することも重要です。 <ol><li> 1ミリリットルの氷冷カルシウムフリーマグネシウムフリー解剖のバッファを含む15 mlのチューブに場所E18胎児ラット皮質の2つ（一つの脳、以前に解剖して）。 </li><li> 2mlと0.125％、最終的なトリプシン濃度に最終的なボリュームをもたらし、解剖バッファ内の皮質に0.25％トリプシン- EDTA 1 mlの。 </li><li> 8分間37℃の水浴中に15 mlのチューブを置きます。 </li><li>この時間の間に、火災研磨3ガラスパスツールピペットは、無菌性を維持するために生物学的安全キャビネット内で、連続して小さな開口部を形成する。 </li><li>皮質の8分間のインキュベーションの後、DMEM 10 mlのトリプシンの反応を阻止するために皮質に10％FBSを含む追加。 </li><li> 2分間2500rpmで皮質とDMEM/10％FBSを含む15 mlチューブを遠心します。 </li><li>バイオセーフティキャビネットでは、接続された真空吸引によるガラスパスツールピペットを用いて皮質から上清を取り除く。妨害またはペレットが剥がれないよう注意してください。 </li><li>皮質ペレットと静かにピペット上下にNMBの1 mlの。それは空気の気泡が酸化によって細胞を損傷することができるように、上下にペッティングしながら、気泡を作らないように非常に重要です。 </li><li>気泡を導入しないように注意して、再度、5回を最後に滅菌ゴム球を取り付け、最大ペッティングやダウンによって皮質をひいて粉にするために広い開口部とファイアーポリッシュパスツールピペットを使用してください。減少した開口部のサイズと、それぞれ、他の2つのガラスピペットでこのプロセスを続けます。 </li><li>粉砕した後、2分間、2500rpmで再び細胞を遠心分離。 </li><li>遠心分離後、再び上清を除去し、NBMの2mlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 45 UMセルストレイナーを通して再懸濁した細胞溶液をフィルタ。 </li><li> 、トリパンブルーで細胞を染色カウント、およびデバイスにロードされます。我々は通常、デバイスごとに細胞の20 ulを読み込みます。 </li></ol> 注 ：細胞の最終濃度が250万細胞/ mlと800万細胞/ mlの間に典型的である細胞のロード細胞がカウントされた後、それはデバイス内のセルをロードする時間です。 <ol><li>無菌性を維持するために生物学的安全キャビネットにNBMを含む事前に準備したデバイスをもたらす。 </li><li>真空吸引により井戸から余分なメディアを取り出します。しかし、メディアのすべてを削除しないように注意してください - メインチ​​ャネル内の一部のメディアが存在している必要があります。 </li><li>デバイスの上部左側のリザーバー（必要に応じて図を参照）への細胞の20 ulを適用します。細胞はデバイスに流れ込むとPLL処理面に付着する。 </li><li>ロード後に、細胞がアタッチできるように10分間インキュベーターに戻し、細胞を含むデバイスに置く。 </li><li> 10分後、戻ってインキュベーター内のメディアと場所のデバイスとの貯水池を埋める。 </li></ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

細胞密度は、用途に応じて変化させることができる。しかし、密度の低すぎる時に一次ニューロンのシードを設定すると、通常は細胞死につながる。インキュベーターと湿度のレベルに応じて、メディアがデバイスに2〜3日おきに変更する必要がある場合があります。メディアを変更する場合、それはメインチャンネルからメディアを削除しないように、貯水池からメディアを削除した後に重要です。さらに、それはトップの井戸で、新鮮な培地を配置し、いくつかの新鮮なメディアがデバイスを通過し、すべての貯水池を満杯にする前に、メインチャンネルに流れるようにすることをお勧めします。

<table><tbody><tr><td>NBM</td><td>培地</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Neural Basal Mediaは、InvitrogenのGibco細胞培養試薬ラインから入手可能です。</td></tr><tr><td>E18ラット胚</td><td>動物</td><td></td><td></td><td>妊娠したSprague Dawleyラットから採取。妊娠ラットを安楽死させ、E18の胎児ラットを解剖してE18胎児ラット皮質を得ます。</td></tr><tr><td>CMFM解剖バッファーHBSS</td><td>バッファー</td><td></td><td></td><td>氷冷したカルシウムフリー・マグネシウムフリーのHBSSベース解剖バッファー。</td></tr><tr><td>15 mlチューブ</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Fisher Scientificカタログ番号 14-959-70C を通じて入手可能です。</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#730;C恒温水槽</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パストールピペット</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>ガラス製</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>培地</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>血清、DMEMに10%で添加して使用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td><td>2500 rpmに設定</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td>生細胞/死細胞のカウント用</td></tr><tr><td>BD Falcon セルストレーナー 40 um</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon cat# 352340</td><td>Fisher Scientificを通じて入手可能です。Fisherカタログ# 08-771-1</td></tr><tr><td>B27</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27は、InvitrogenのGibco細胞培養試薬ラインから入手可能な独自サプリメントです。</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamaxは、InvitrogenのGibco細胞培養試薬ラインから入手可能です。</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのe18脳ラットのニューロンの準備

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

このビデオでは、我々はE18皮質ラットの神経細胞の準備を示しています。 E18皮質ラットの神経細胞は、以前は切開し準備E18胎児ラットの大脳皮質から得られる。 E18皮質は、解剖時に、個々のニューロンにすぐに解離している。それは、解離が実行される前までの週までは4でB27が含まれているHibernateのEバッファ° CでE18皮質を格納することが可能です。しかし、細胞の生存率の低下が生じます。一般的に我々はE18のCortex新鮮を得る。それは氷冷カルシウムフリーマグネシウムフリー解剖バッファー（CMFM）に研究室に運ばれる。到着時に、トリプシンは0.125％の最終濃度に皮質に追加されます。皮質は、その後8分間37℃でインキュベートする。 10％FBSを含むDMEMして反応を停止する皮質に追加されます。皮質は、その後2分間2500rpmで遠心分離される。上清を除去し、2％B27（vol / vol）のおよび0.25％を含むニューラル基礎培地（NBM）を2mlさグルタミン（体積/体積）はその後、ピペッティングにより再懸濁している皮質に追加されます。次に、皮質は、以前に研磨したガラスピペット、連続する小さな開口部をそれぞれ発射で摩砕しています。摩砕した後、皮質は再び2分間2500rpmで遠心分離される。上清を除去し、皮質ペレットB27とグルタミンを含むNBM 2mlで再懸濁されている。細胞懸濁液を40ミクロ​​ンのナイロンセルストレーナーを通過させる。次に、細胞がカウントされます。ニューロンはニューロンマイクロ流体デバイスにロードするのに準備が整いました。

このビデオでは、E18皮質ラットニューロンの準備を示しています。

マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

このビデオでは、ラット胎生18日目（E18）皮質ニューロンの調製法を実演します。E18皮質ラットニューロンは、あらかじめ採取したE18ラット胎児の皮質から取得します。

Newly John博士の研究室へようこそ。前回のビデオでは、研究者がニューロンの細胞体と純粋な軸索分画を分離できるプラットフォームである、ニューロンデバイスの作製方法を実演しました。デバイスの作製にはソフトリソグラフィーという技術を用いており、これはフォトリソグラフィーを用いて事前に作製したデバイス設計を含むシリコンウェハー上に、PDMSをキャストして硬化させる工程で構成されています。このビデオでは、出生後18日目のラット皮質ニューロンの準備方法と、ニューロンデバイスにニューロンをロードする方法を実演します。それでは、本日の実演を担当するKiana Leeを紹介します。実験を開始する前に、必要なすべての培地および試薬をウォーターバスで37 °Cに加温しておくことが重要です。ここでは、Neurobasal培地、0.25% trypsin、および10% FBS含有DMEMが用意されています。細胞の操作に使用し、クリーンベンチ内に配置するすべての物品は、滅菌済みであること、および70% ethanolで拭き上げられていることを確認してください。まず、組織培養フードを70% ethanolで拭き上げます。次に、チューブを保持するためのプラスチックラックにethanolをスプレーします。続いて、3本線画線法に使用するゴムボールをethanolで洗浄します。十分に乾燥させる時間を確保するため、この操作を早い段階で行うことが重要です。次に、必要な試薬をエタノールで拭き取り、フード内へ移動させます。あらかじめ解剖された1個の脳に相当する2片のE18ラット胎児皮質を、1 mLの氷冷したカルシウムおよびマグネシウムフリーの解剖バッファーを含む15 mLチューブに入れます。この解剖バッファー中の皮質に0.25% trypsin EDTAを1 mL加え、最終容量を2 mL、最終trypsin濃度を0.125%にします。trypsinを添加した皮質を含む15 mLチューブを37 °Cのウォーターバスに8分間静置し、胎児皮質を37 °Cでtrypsin処理しながらインキュベートします。3本のペーストピペットを火炎研磨します。ガラスピペットの先端を、火炎の青い部分に近いところで軽く炎に接触させ、開口部がちょうどオレンジ色に変わるまでゆっくりと回転させます。オレンジ色に変わったところで...ガラスピペットを回転させ続け、潰れないようにすることが重要です。ガラスピペットの開口部は、順に小さくなっていることに注意してください。また、開口部を小さくしすぎないことが重要です。開口部が小さすぎると、皮質を37 °Cで8分間トリプシン処理した後に細胞が溶解する原因となるためです。トリプシン反応を停止させるため、10% FBS含有DMEMを10 mL、皮質に添加します。皮質と10%FBS含有DMEMが入った15 mlチューブを、2,500 RPMで2分間遠心分離します。バイオセーフティキャビネット内で、ガラスピペットに取り付けた真空吸引装置を用いて、皮質から上清を除去します。この際、ペレットを乱したり、剥がしたりしないように注意してください。B 27およびグルタミン酸を含む神経基底培地 1 mlを皮質ペレットに加え、ピペットで穏やかに吸い上げと吐き出しを繰り返します。気泡は酸化により細胞を損傷させる可能性があるため、ピペッティング時に気泡を発生させないことが非常に重要です。次に、開口部が最も広い火 polishing 処理済みの後方ピペットを使用し、ピペットの端に滅菌済みのゴムバルブを取り付けて、約5回ピペッティングして皮質をトリチュレーション（細胞分散）します。気泡が混入しないように注意してください。これで、開口部を小さくした他の2本のガラスピペットについても、同様の操作を継続します。前述の通り、トリストリエーション（三段階線条希釈）の過程で気泡を混入させないようにすることが重要です。また、可視的な塊が見えなくなったことに気づくはずです。培地の中で皮質の塊が一切見えなくなるまで、トリチュレーションを継続することが重要です。その後、細胞を再び 2, 500 RPM で 2 分間遠心分離します。これは、2つの皮質片から得られることが予想されるペレットのおおよそのサイズです。遠心分離後、上清を細胞ペレットから再び除去します。上清を除去した後、B 27およびグルタミン酸を含む1 mlのNeurobasal培地を皮質に加え、皮質を再懸濁します。気泡の混入を避け、細胞ペレットが均一に分散し、凝集が解消されるように、再びピペットで慎重に吸い上げと吐き出しを繰り返します。細胞懸濁液にニューロベーサル培地をさらに1 mL加え、最終容量を2 mLにします。次に、再懸濁した細胞溶液をBD biosciencesの40 µmセルストレーナーでろ過し、細胞数のカウントと生存率の評価を行います。滅菌済みのマイクロ遠心チューブに、新鮮なNeural Basal Mediumを60 µL分注します。次に、この60 µLのNeural Basal Mediumに細胞懸濁液を20 µL加え、最後に、Neural Basal Medium中の細胞にトリパンブルーを20 µL加えます。トリパンブルーで染色した後、死細胞が染色されます。20 µLをヘモサイトメーターに分注し、顕微鏡下で観察します。生存細胞は透明で透き通って見えますが、細胞膜に穴が開いた細胞はトリパンブルーにより青く染色されます。通常、1つの皮質あたり約250万個から800万個の細胞が得られます。通常、1つの脳から2片の大脳皮質を採取し、最終的に2 mLの容量で細胞を再懸濁します。したがって、最終的な細胞濃度は通常、2.5 million cells/mLから8 million cells/mLの間になります。通常、1デバイスあたり約20 µLの細胞をロードします。これにより、デバイス1個あたりの細胞数は50,000 cellsから160,000 cellsの範囲になります。細胞密度はアプリケーションに応じて変更可能です。ただし、初代ニューロンを低すぎる密度で播種すると、通常は細胞死を招きます。神経基底培地を充填して事前に準備したデバイスを、無菌状態を維持するためにバイオセーフティキャビネット内に取り出します。ウェル内の余剰な培地をバキュームセクションで除去します。ただし、すべての培地を除去しないよう注意してください。メインチャネルには培地が残っている必要があり、リザーバーからのみ培地を吸引してください。デバイスの左上のリザーバーに、20 µLの細胞を注入します。細胞はデバイス内に流れ込み、PLL処理された表面に接着します。ここで、細胞がメインチャネル内を流れ下る様子を確認でき、一部の細胞が実際にガラスに接着し始めるのが分かります。播種後、細胞を含むデバイスをインキュベーターに約10分間戻し、細胞を接着させます。10分後、デバイスを再びバイオセーフティキャビネットに移し、リザーバーに培地を満たしてから、デバイスをインキュベーターに戻します。留意すべき重要な点として、インキュベーターの性能や培地に必要とされる湿度レベルに応じて、2〜3日ごとにデバイス内の培地を交換する必要がある場合があります。新鮮な培地を上のウェルに入れ、すべてのリザーバーを満たす前に、一部の新鮮な培地をデバイス内およびメインチャネルに流すことが推奨されます。ここでは、生細胞を染色する細胞透過性染料であるカルシウム用染料を用いて、ニューロンを可視化しています。ここでは、細胞体、軸索、および樹状突起が含まれるデバイスの細胞側コンパートメントを確認できます。デバイス全体をパンして見ると、軸索がデバイスの反対側、すなわち純粋な軸索画分が含まれる軸索側に到達するために成長するマイクログルーブ（微細溝）が確認できます。デモンストレーションのため、これらの蛍光標識された細胞を用いて軸索切断の手順を説明します。ニューロンデバイスの特性の一つに、デバイス内の純粋な軸索画分から軸索を切断する「axotomy（軸索切断）」を研究者が行えることが挙げられます。これにより、軸索再生などの研究が可能となります。ここでは、Keanoがニューロンデバイスでのaxotomyの実施方法を実演します。axotomyは真空を用いて行われます。滅菌済みのガラスピペットをウェルの軸索側の底面開口部に配置し、培地を真空吸引で除去します。メインチャネル内の培地を含め、デバイスの軸索側からすべての培地を完全に除去してください。培地を除去した後、この操作を繰り返すには、ピペットのチップをメインチャネルの開口部に配置し、ピペットを強く押し込んで150 µLの培地をメインチャネルに注入します。次に、メインチャネルの開口部とデバイスの軸索側の上部ウェルに真空を適用します。再び真空を用いて、メインチャネルを含む軸索側からすべての培地を除去します。その後、ピペットのチップをメインチャネルの開口部に当て、力を入れてピペットを押し出すことで、150 µLの培地をメインチャネル内に強制的に注入します。この時点で、研究者は顕微鏡下でデバイスを観察し、軸索の切断効率を確認できます。軸索が十分に切断されていない場合は、必要に応じてこの工程を繰り返してください。このビデオでは、E 18 胎児ラット皮質ニューロンを調製し、ニューロンデバイスにロードする方法について説明しました。これらのデバイスの最大の利点は、デバイスの一方でニューロン細胞体を培養し、もう一方では純粋な軸索画分を分離して区画化できることです。このビデオが有益で役立つものであったなら幸いです。それでは、John Labから以上となります。ご視聴ありがとうございました。

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