マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

こんにちは、Dr.Newly Johnの研究室へようこそ。前回のビデオでは、研究者がニューロンの細胞体を純粋な軸索画分から分離することを可能にするプラットフォームであるニューロンデバイスの製造方法を示しました。ソフトリソグラフィーは、デバイスの製造に使用される技術であり、以前にフォトリソグラフィーを使用して製造されたデバイス設計を含むシリコンウェーハ上にPDMSをキャストして硬化させることで構成されます。

このビデオでは、spro dolly E 18皮質ラットニューロンの調製方法と、ニューロンをニューロンデバイスにロードする方法を示します。キアナ・リーさんについてご紹介します。彼女は今日、デモンストレーションを行います。

始める前に、必要なすべての培地と試薬をウォーターバスで37度に温めることが重要です。神経基礎培地0.25%トリプシンと10%FBSを含むDMEMが見られます。細胞の修復に使用されるフードに入れられるすべてのものを滅菌し、70%エタノールで拭き取ることが重要です。

まず、組織培養フードを70%エタノールで拭き取ります。次に、チューブを保持するために使用されるプラスチックラックにエタノールを噴霧します。次に、トライストライエーションの工程で使われるゴムボールをエタノールで洗浄します。

乾燥するのに十分な時間を確保するために、これを早い段階で行うことが重要です。次に、必要な試薬をエタノールで拭き取り、フードに移動します。以前に解剖された1つの脳を表すE 18胎児ラット皮質の2つのピースは、1ml、氷冷、カルシウムフリー、マグネシウムフリーの解剖緩衝液を含む15mlチューブに入れられ、1mlの0.25%tripsin EDTAが解剖バッファーの皮質に追加され、最終容量が2ミルになり、最終トライイン濃度が0.125%になりましたトリプシンが今追加された皮質を含む15mlチューブが次に配置されます胎児の皮質がトリプシンで37度でインキュベートしている間、37度の水浴で8分間

3つのペーストピペットはファイヤーポリッシュされています。ガラスピペットの先端は、炎の青い部分の近くで炎にちょうど接触するように配置され、開口部だけがオレンジ色に変わるまでゆっくりと回転します。オレンジ色に変わったように。

ガラスピペットが潰れないように、ガラスピペットを回転させ続けることが重要です。ガラスピペットの開口部が徐々に小さくなっていることに注意してください。これは皮質がトリプシン10mlsのDMEMを含んで10%FBSと37度で8分間インキュベートされた後で細胞の溶解を引き起こすことができるので、開口部を小さくしすぎることを望まないことに注意することも重要ですトリプシンの反応を止めるのを助けるために皮質に加えられます。

皮質およびDMEM 10%FBSを含んでいる15のmlの管は2、2のための500 RPMで2分間遠心分離される。バイオセーフティキャビネットでは、ガラスピペットに取り付けられた真空吸引を使用して、皮質から上清を除去します。ペレットを邪魔したり、はがれたりしないように注意してください。

B 27とグルタミン酸を含む神経基礎培地1mlを皮質ペレットに加え、静かにピペットで上下させます。ピペッティングで上下に行う際には、気泡が酸化によって細胞に損傷を与える可能性があるため、気泡を作らないことが非常に重要です。次に、ピペットの端に滅菌ゴム球を取り付け、約5回ピペッティングすることにより、皮質をトライするために使用される最も広い開口部を持つファイヤーポリッシュ後部ピペット。

気泡が入らないように注意してください。大丈夫です。このプロセスは、他の2つのガラスピペットでも継続されており、それぞれ開口部のサイズが小さくなっています。前述のように、トライストリエーションプロセス中に気泡が発生しないようにすることが重要です。

また、目に見えるチャンクが表示されなくなったことにも気づくはずです。メディアで皮質の塊が見えなくなるまで、トライレーティングを維持することが重要です。イオン化後、細胞は再び2,500RPMで2分間遠心融合されます。

これは、皮質の2つの部分から予想されるペレットのおおよそのサイズです。遠心分離後、sup natinは再び細胞ペレットから除去されます。スーパーナチンを除去した後、B27とグルタミン酸を含む神経基礎培地1mlを皮質に加え、皮質の懸濁液を蘇生させます。

細胞ペレットは、気泡が追加されないように、また細胞ペレットが均一に分散して分解されるように、再度慎重にピペットで上下させます。さらに1ミルの神経基礎培地を細胞懸濁液に添加し、最終容量を2ミルにします。次に、再懸濁した細胞溶液をBD biosciences 40ミクロンのセルストレーナーでろ過し、細胞をカウントして生存率を評価します。

次に、20マイクロリットルの細胞を60マイクロリットルの神経基礎培地に加え、最後に20マイクロリットルのトライアンブルーを神経基礎培地の細胞に加える。トライアンブルーは、細胞をトライアンブルーで染色した後、生きていない細胞を染色します。

20マイクロリットルをヘモサイトメーターにピペットで固定し、顕微鏡で観察します。生細胞は透明で半透明に見えますが、膜に穴が開いている細胞はトライアンブルーのために青く染色されます。通常、皮質あたり約250万個の細胞と800万個の細胞が得られます。

通常、1つの脳から皮質の2つの部分を取得し、細胞は最終体積2ミルに再懸濁されます。したがって、細胞の最終濃度は、典型的には250万細胞/milから800万細胞/milの間である。通常、デバイスごとに約20マイクロリットルの細胞をロードします。

これにより、デバイスあたりのセル数は 50, 000 セルから 160, 000 セルの範囲になります。細胞密度は、アプリケーションに応じて変化させることができます。しかし、低すぎる密度で初代ニューロンを播種すると、通常、細胞死につながります神経基礎培地を含む以前に調製されたデバイスは、無菌性を維持するためにバイオセーフティキャビネットに持ち込まれます。

ウェルからの余分な媒体は、真空セクションによって除去されます。ただし、すべてのメディアを取り外さないように注意する必要があります。メインチャネルには、リザーバーからメディアを吸引するだけのメディアが必要です。

デバイスの左上のリザーバーに塗布されるのはわずか20マイクロリットルの細胞です。細胞はデバイスに流れ込み、PLL処理された表面に付着します。ここでは、セルがメインチャネルを通って流れ落ちるのを見ることができ、実際にガラスに取り付けられているセルの一部が見え始めます。

ロード後、細胞を含むデバイスをインキュベーターに約10分間戻し、細胞を接着させます。インキュベーター内で10分後、デバイスは再びバイオセーフティキャビネットに運ばれ、リザーバーに培地が充填され、デバイスはインキュベーターに戻されます。インキュベーターと培地が必要とする湿度のレベルによっては、2〜3日ごとにデバイス内で交換する必要がある場合があります。

新鮮な培地をトップウェルに置き、新鮮な培地が装置を通ってメインチャネルに流れ込むのを待ってから、すべてのリザーバーを充填することをお勧めします。ここでは、ニューロンを、生細胞を染色する細胞透過性色素であるカルシウムを用いて可視化しています。ここでは、細胞体、軸索、樹状突起を含むデバイスのSOコンパートメントまたは細胞側を見ることができます。

デバイスをパンすると、軸索が成長してデバイスの反対側、つまり純粋な軸索画分を含む軸索側に到達するための微細な溝が見えます。デモンストレーション用です。これらの蛍光標識細胞は、ax otomy 手順を説明するために使用されます。

ニューロンデバイスの特性の1つは、研究者がデバイスの純粋な軸索画分から軸索を切断するexotomyを実行できることです。軸索再生の研究などの研究を行うため。Keanoは、ニューロンデバイスでexオトミーを実行することを実演します。exオトミーは真空によって行われます。

滅菌ガラスピペットをウェルの底部の軸索側の開口部に配置し、培地を真空で吸引します。すべてのメディアは、メインチャネルのメディアを含め、デバイスの軸索側から完全に除去されます。メディアを取り外した後にこのプロセスを繰り返すには、ピペットの先端をメインチャネルの開口部に置き、ピペットを力で押し下げることにより、150マイクロリットルのメディアをメインチャネルに押し込みます。

次に、真空をメインチャネルの開口部とデバイスの軸索側のトップウェルに加えます。真空は、メインチャネルを含む軸索側からすべての媒体を除去するために再び使用されます。もう一度、ピペットの先端をメインチャネルの開口部に置き、ピペットを力で押し下げることにより、150マイクロリットルのメディアがメインチャネルに押し込まれます。

この時点で、研究者は顕微鏡でデバイスを見て、軸索切断の効率を確認できます。軸索が十分に切断されていない場合は、必要に応じてこのプロセスを再度繰り返すことができます。このビデオでは、E 18胎児ラック皮質ニューロンを準備し、それらをニューロンデバイスにロードする方法を紹介しました。

これらのデバイスの主な利点は、デバイスの片側のニューロン細胞体の培養を、デバイスの反対側の純粋な軸索画分から分離し、区画化できることです。このビデオが有益で役立つことをお考えだっただければ幸いです。というわけで、ジョン研究所からのお伝えです。

ご覧いただきありがとうございます。