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制御性 T 細胞 (Treg) は、免疫抑制効果を発揮して免疫系の恒常性を媒介する特殊な T 細胞亜集団です。Tregは細胞表面マーカーCD4、CD25、ニューロピリン1、Nrp1、核転写因子フォークヘッドボックスP3、Foxp3、Heliosを発現
する マウス膵臓ドレナージリンパ節(PDLN)からTregを分離するには、円錐形のチューブの上に金属メッシュを置きます。PDLNをメッシュ上に置き、組織を粉砕して機械的に解離させます。メッシュ上に適切な培地を追加し、細胞をチューブに洗い流します。
遠心分離機で死んだ細胞や細胞の破片を除去します。生細胞を培地に再懸濁します。丸底チューブに取り付けられた細胞ストレーナーキャップに細胞を通し、均質な単一細胞懸濁液を取得し、残っている細胞の塊を除去します。
蛍光色素結合抗CD4、抗CD25、および抗Nrp1抗体を追加します。抗CD4抗体と抗CD25抗体は、Treg上のそれぞれの細胞表面抗原に結合します。同時に、抗Nrp1はNrp1受容体に結合します。
細胞を適切な透過処理固定バッファーで処理し、細胞を固定し、細胞膜と核膜を透過処理します。Foxp3とHeliosを標的とする蛍光色素結合抗体を追加します。
透過処理された膜により、抗体は細胞に入り、それぞれの核内標的に結合します。フローサイトメトリーを使用して細胞を分析します。
Tregは、核転写因子Foxp3およびHeliosとともに、CD4、CD25、およびNrp1の陽性の細胞表面発現によって特徴付けられます。
まず、15ミリリットルの円錐形のチューブをラックに入れます。滅菌された250マイクロメートルの金属メッシュをチューブの上に置きます。メッシュを1ミリリットルのRPMIですすいでください。次に、リンパ節を金属メッシュに移し、ピンセットを使用してメッシュを通してリンパ節を研磨します。メッシュに1ミリリットルのRPMIを塗布して、細胞をチューブに洗い流します。リンパ節を移送して粉砕するこのプロセスをサンプルごとに3回繰り返してから、メッシュを取り外します。
チューブを433 x g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を約5ミリリットルのRPMIに再懸濁し、チューブにRPMIを充填します。サンプルの遠心分離からチューブにRPMIを充填するまで、このプロセスを1回繰り返します。
チューブを再び433 x g で摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを2ミリリットルのRPMIに再懸濁します。2ミリリットルの細胞懸濁液を、細胞ストレーナーキャップ付きの5ミリリットルの丸底チューブに移します。
まず、PDLNサンプルからの細胞懸濁液を433 x g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨てます。テキストプロトコルに概説されているように、細胞を表面抗体で染色し、チューブを氷上で40分間インキュベートします。
次に、各チューブに200マイクロリットルのFACSバッファーを加えます。433 x g および摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。このプロセスを繰り返し、バッファーを加え、遠心分離し、上清を1回廃棄します。細胞ペレットを500マイクロリットルの透過処理固定バッファーに再懸濁して、細胞を固定および透過処理します。
チューブを摂氏4度の冷蔵庫に一晩移します。翌日、PDLNサンプルからの細胞懸濁液を433 x g および摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを500マイクロリットルの透過処理洗浄バッファーに再懸濁します。細胞を再び433 x g および摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
テキストプロトコルに概説されているように、細胞内抗体で細胞を染色します。チューブを氷上で1時間インキュベートします。この後、500マイクロリットルの透過処理洗浄バッファーを各チューブに加えます。433 x g で摂氏 4 度で 5 分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを500マイクロリットルの透過処理洗浄バッファーに再懸濁します。
摂氏4度で433 x g inで5分間、もう一度遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを300マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、フローサイトメーターで細胞を分析します。