Name: ヒトのインビトロ抑制 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: 学ぶヒトインビトロ抑制アッセイを用いたTreg機能測定法。1型糖尿病リスク個体の免疫バランス異常を早期に識別し、自己免疫疾患の病態理解に貢献する研究手法を解説します。

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この研究は、ウィスコンシン州とウィスコンシン州の子どもの研究所の少年Diabetesat医科大学のマックスマギー国立研究センターによってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析の役割、または原稿の準備がなかった。

1。抑制アッセイを設定する前に、その後の細胞の刺激とするための抗ヒトCD3（クローンUCHT1、最終濃度1μg/mlの）でコーティングtosylactivatedビーズへの1つのニーズは、ビーズが効率的に人間を用いた in vitro増殖アッセイで設定することによって被覆されているかどうかを確認するT細胞<ol><li>オリジナルバイアル、磁気スタンドの場所からM - 450 tosylactivatedビーズを1mlを取り、すべてのビーズがチューブの側面に付着するまで押し続けます。チューブは、磁気スタンドに入れたままでバッファを削除します。 37、撹拌機を再懸濁しますビーズをbuffer1の1mlの抗ヒトCD3の40μlのを追加°、磁気スタンドからチューブを取り、buffer1の1mlを追加、再び磁気スタンドにチューブを配置し、チューブを磁気スタンドにある間buffer1を削除するC 15分間、0.1％w / vのBSAを追加し、次の16時間攪拌を続行。 </li><li>バッファを削除するとbuffer2の1mlのビーズを再懸濁さ;ビーズがある℃、一回5分間buffer3で2〜8℃上記で説明したように磁気スタンドを使用して2〜8℃で5分間二回buffer2でビーズを洗浄4 × 10 8 / mlの最終濃度、使用できるようになります。 </li><li>分注し50,000 25000 PBMC /ウェル、96ウェルプレートでトリプリケートでとCD3でコーティングされたビーズの数が可変（4 × 10 8ビーズ/ mlと、CD31μg/mlの、例えば1、2、3、4、5ビーズ/細胞追加）細胞当たりのビーズの最適数を決定するために。文化の中で72時間後、1μCi[3 H]チミジンを追加し、37℃でインキュベートし、次の16時間継続する。マルチスクリーン収穫プレート（ミリポア）で収穫細胞は、シンチレーション液を追加し、トップカウントNXT（パッカード、CT）を使用しても/分当たりのカウント（cpm）をお読みください。抑制機能を失う可能性が制御性T、の過剰刺激を避けるために、ビーズ/インプレッション単価が5000を超えている細胞の比率が15000未満を使用してください。通常、3ビーズ/細胞の比は、これまでに1から4までテストしたすべての被験者群でのレスポンダとTreg細胞の両方を刺激する。 </li></ol> 2。地元の輸血センターから健康なドナーからのまたは人間leukopacksまたはバフィーコート（BC）からの全血からPBMCを分離、通常健康なボランティアから採取し、無料で利用できる（図1） <ol><li> BC（〜50ml）にPBS 1:6を（250ミリリットルを追加する）希釈してください。今すぐ300ミリリットルの合計体積があります。徐々に15ミリリットルをFicoll - Paqueの上に希薄化後のBCの25ミリリットル層PLUSは、層を乱すことなく、50ミリリットルのファルコンチューブに加えた。 4℃で30分間800xg（スイングバケットローターSH - 3000とソーバル遠心機で1400rpm）で遠心° C、ブレーキをオフにした。 </li><li>慎重にPBMC層（中間相）を収集し、新鮮な50ミリリットルファルコンチューブに移す。 DPBSで50ミリリットルにチューブが満杯になってPBMCを洗ってください。つのチューブに2細胞ペレットを収集する。で10分間4℃で400xgで遠心分離、二回一本のチューブに2細胞ペレットを組み合わせたたびに洗浄ステップを繰り返します。シングル50ミリリットルチューブにすべての細胞ペレットを組み合わせる。 </li><li>トリパンブルー排除試験を用いてPBMCを数えます。染色トリパンブルーの180μlにPBMCの20μlのを追加してトリパンブルーで1:10希釈液を加えます。よく混和して、直ちに血球計でカウントする20μlのかかります。二つの四角いブロック16より小さい正方形を含むそれぞれの内にあるすべての未染色とのみ青色に染色された細胞数を数える。両方の数値の平均を取ると10を掛けます。 PBMC / mlの数を得るために100でこの数を分け。生存細胞の割合として計算する[1 - （全細胞の青色のセル/数の数）× 100]。生存率が≥95％の場合進みます。 </li></ol> 3。 CD4 T細胞のMACS事前ソート<ol><li>先に進む前に、新しいチューブにPBMCの1mlを転送する、5000rad - これらは、抗原提示細胞（APC）になると照射のために細胞を調製するためにメディアの4ミリリットル加える。 </li><li> 4℃で10分間PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファー中で250xgでの細胞の残りを遠心分離℃にPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの4ミリリットルで上清、再懸濁します細胞を捨て。 </li><li> MACS抗CD4マイクロビーズ200μlのを追加し、4℃でインキュベート℃で20分間。 </li><li> 4℃で10分間250xgでPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーと遠心の40ミリリットルを追加することで、洗う℃に脱気、室温PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの8ミリリットルの上清と再懸を捨て。 </li><li> LSカラム上にロードする前に、プレセパレーションフィルターを使用してフィルタ - 別々の細胞懸濁液。 </li><li>キャリブレーションLSカラムに各細胞懸濁液および層の4ミリリットルを分割（deggassed PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの3ミリリットルを持つ）。 LSカラムはMidiMACSセパレータに固定されています。細胞懸濁液は、再実行のフロースルー、不足またはdeggassed室温PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの3ミリリットルを加えるとバッファがから実行できるようにする前に。それが出て明らかになるまでより多くのバッファを追加。 </li><li> LSのカラムにピペット5ミリリットルdeggassedバッファ、〜1.0ミリリットルを介して実行させる新しい滅菌15ミリリットルコレクションチューブにMidiMACSセパレータと場所からLSカラムを削除します。列にプランジャーを入れて、ゆっくりと残りの部分を押してくださいボリュームから。 </li><li>両方のLSの列でも同じことが二CD4 +分画を組み合わせる。 50ミリリットルPBSとカウントセルを追加します。予想される収量は、5 × 10 8細胞までです。 2ミリリットルPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファー中でも10分、懸濁し、細胞のために400xgで遠心分離します。 </li></ol> 4。蛍光活性化細胞選別（FACS）の分離（図2） <ol><li> 、抗ヒトCD8 - FITC（クローンRPA - T8）、抗ヒトCD14 - FITC（クローンM5E2の20μlを、20μlの次の細胞表面マーカー（光から保護保持）にCDのマーカーに対する抗体のカクテルを作るLPS受容体）、抗ヒトCD32 - FITC（クローンFLI8.26の20μlを、FcγRのタイプII）と抗ヒトCD116 - FITC（クローンM5D126μlの、GM -CSFRαチェーン）とは、代わりに、40μlの抗を追加ヒトCD4 - APCCy7（クローンRPA - T4）。 </li><li> 5μlのは、2ミリリットルの細胞懸濁液を取り出し、汚れカクテルの2μlのと染色、これは、しきい値（蛍光色素マイナスOne - FMO）5を決定するためのチューブです。 </li><li>染色カクテルに、そして4℃で30分で細胞懸濁液とインキュベートするカクテルを追加し、抗ヒトCD25 - PE（IL -2RαクローンM - A251）の50μlを追加。 PBS緩衝液、10分および10 7 / mlの細胞濃度に懸濁し、細胞のための400xgで遠心分離で細胞を洗浄。 </li><li>未染色の細胞と細胞またはFACSアリア（BD Biosciences社、サンノゼ、ニュージャージー州）での細胞選別のために補償制御として使用する単一の蛍光色素で染色されたビーズを準備します。 </li><li>ユーザーは、CD25 + T細胞（図2a）のソートのしきい値を設定できるようになりますFMOチューブに細胞を取得する。単球、マクロファージおよび他のすべてのCD4 + -非T細胞（図2b）からなるFITC陽性細胞を除外するためにFITC -陰性細胞の周りのゲートを設定します。 </li><li>別のプロットでは、CD25 -、CD25lowとCD25high T細胞- Tregsの（CD25の最大数を発現する細胞の上位1％）（図2c）のためにゲートを描きます。細胞サブセットは一般的に高純度（図2d、2eと2fを）示しています。 </li><li> 10分間400xgで細胞を用いたコレクションチューブを遠心し、メッキまで氷上で保管して下さい。 </li></ol> 5。 200μl/wellで96穴プレート（表1として添付する方式）で細胞培養を設定する<ol><li> CD3でコーティングされたビーズのアリコート50μlの（1μg/ mlの）は3ビーズ/ U -底部では10％プールしたヒトAB血清で完全なメディアに再懸濁してウェル内のレスポンダのセル、96ウェルプレートになるように計算。 （たとえば、CD3でコーティングした2ミリリットルのメディアを作るために、CD3でコーティングされたの株式ビーズ-最終濃度4 × 10 8 / mlから7.5μl取るとメディアの2ミリリットルで希釈し、すべての50μlのは75,000 beads-3beads/cellが含まれます）。 </li><li> 5 × 10 5 / mlの細胞濃度と、"唯一のTregsの"というラベルの井戸を含む、以前に追加した刺激、との各ウェルに（2.5 × 10 4細胞を含む）50μlずつを追加し、"APCだけ"と、表の"メディアのみ"に照射APCを薄める1。 </li><li>表1の設計は、次の連で2.5 × 10 4 /ウェルCD4CD25 -またはCD4CD25low T細胞を追加。 </li><li>比1:10（2,500 Treg細胞）の共培養（列B、表1）にし、"唯一のTregsの"というラベルのウェルにTregsのを追加し、5％CO 2とCO 2インキュベーターで37℃プレート℃でインキュベートする、72時間飽和湿度インチ</li><li>パルス1μCi[3 H]チミジンをウェルの中とは° C次の16時間37℃でインキュベーションを続ける。 </li></ol> 6。収穫とカウント<ol><li>パッカードfiltermate収穫機または別のシステムを使用してマルチスクリーン収穫プレート上に細胞を回収。 </li><li>シンチレーション液（Microscint 20）追加、最後のステップの準備のために透明なプラスチックカバーでプレートを収穫するカバー。 </li><li>分当たりのカウント数（cpm）を読んで/ウェルトップカウントNXT（パッカード、CT）または別のシステムを使用して。 </li></ol> 7。抑制のコンピューティングの割合<ol><li>細胞は三連で培養したように、平均を各条件ごとに計算されます。変動係数が&gt; 30％の場合、外れ値が排除され、2つの井戸からのみCPMは平均化されます。抑制の割合は、共培養の単文化とc = CPMの計算[（SC）/秒] × 100％、S = CPMすることによって得られる。 </li><li>ナイーブ（CD25 -）とin vivoで活性化（CD25low） にエフェクターT細胞は、レスポンダーT細胞として播種され、これらのサブセットの各々を抑制する制御性Tの能力の差が前提に基づいて潜在的な機能的な予後の指標として取り込まれ、使用されているようにその活性化細胞では抑制が困難です。 </li></ol> 8。代表的な結果： 方法に大きなばらつきが使用され、in vitroでヒトの抑制アッセイから得られた結果は、私たちはアッセイ1に影響を与える条件の総合的な研究を実行するためのプロンプトが表示。我々は以前の6に決定Teffs（1:10）、：私達はTregsの間に低比を考慮するだけでなく、Tregの機能をテストする検定だけでなく、その純度を開発している。さらに、Tregsのは目に異なる免疫バランスが侵害された場合T1D開発するためにリスクのある被験者のように成功し、ナイーブと、図3に、より顕著になる私たちの以前の研究2,4に示すように、さらに健常者の in vivo活性化T細胞における抑制するEIRの能力。アッセイは、LS（最近発症（RO）T1Dと長年、私たちは健康な制御との間でそれらの機能を比較することが、我々は自然（nTregs）の抑制機能を比較して研究、誘導（iTregs） と in vitro拡張のnTregs で非常にうまくいった）T1D科目。我々はRO T1D被験者はLS T1Dと健常者7に比べて機能的iTregs両方と拡張nTregsを生成するのより良い能力を持っていたと結論づけた。したがって、このアッセイは免疫不均衡の初期および後期の状態の両方の認識に優れたツールとして使用することができます。 in vitroでの抑制アッセイのために必要な手順のスキーム1回路図のプレゼンテーション<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1写真を提示in vitroでの抑制アッセイのステップ<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> FACS細胞の分離2。ゲーティング戦略図 。 ）CD25 +しきい値は、FITC -陰性細胞は（さらにゲートしたとCD + CD25 -、CD + CD25lowとCD + CD25highとして収集された）細胞は、C FITC陰性としてゲーティングした）蛍光色素マイナスワン（FMO）、Bに応じて調整された割合、dで示すように、Tregsのは））、電子、ソート後にTregsのをソートFACS）ソート後にソートされたCD + CD25lowをFACS、およびf）ソート後にソートされたCD4 + CD25 - T細胞をFACS <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。健常者の代表の結果）関連するすべての細胞サブセットのための単一文化として提示健常者（ナイーブ- CD25 -、in vivoで活性化- CD25low で 、抗原提示細胞- APCの毎分のカウントの代表的な結果（CPM）がと各CD25 -と自己制御性TによってCD25lowレスポンダーT細胞は健常者のために提示されている（nの抑制の制御性T細胞- Tregの）だけでなく、レスポンダーT細胞の共培養（CD25 -またはCD25low）とTregsの。B）の割合= 4）。抑制は、共培養の単文化とc = CPMで[（SC）/秒]として× 100％、S = CPMを計算した。レスポンダーT細胞を抑制する制御性Tの容量のわずかな違いが気づいていたが、それは。C（t検定P = 0.08ペア））発表は、応答側としてCD25 -とCD25lowを含め、それぞれ単一の文化のためのリスクの被験者でのcpmである有意ではなかったT細胞だけでなく、それぞれのレスポンダーT細胞サブセットは、自家で各CD25 -とCD25lowレスポンダーT細胞の抑制の制御性T（CD25-/TregsとCD25low/Tregs）。d）の割合で播種されたAPCとTregsの、そして共培養Tregsのは、リスクの被験者（N = 4）でのために提示されます。 CD25 -対CD25lowレスポンダーT細胞を抑制する制御性Tの能力の差は有意であった（t検定P = 0.04をペアになった）。 表1。回路図は 、in vitro 抑制アッセイのセットアップ<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1月3日</td><td> 4月6日</td><td> 7月9日</td><td> 10月12日</td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25 - </td><td> CD4CD25low </td><td>メディアのみ</td><td>メディアのみ</td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25 - / Tregsの</td><td> CD4CD25low / Tregsの</td><td>のみTregsの</td><td> APCのみ</td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

Tregsのへの唯一のユニークな特徴として、抑制機能は、同じ内および異なる研究間の疾患の開発のさまざまな段階での被験者の間で確実にかつ均一にテストする必要があります。我々は、このアッセイの標準化への貢献として、当研究室で開発抑制アッセイの詳細を提供します。私たちの広範な最適化の研究では、我々は自然の刺激を提供するAPCとしてPBMCとの併用で抗ヒトCD3でコーティングされたビーズ（UCHT1クローン、1μg/mlの濃度で（のような市販の5μg/mlとは対照的に）とT細胞の刺激と判断したのみAncell抗体が期待される結果を与えた我々の手のように1抗ヒトCD3抗体の選択は、非常に重要である。同時抗ヒトCD3で刺激と抗がテストの被験者にもレスポンダーT細胞とTregsの両方を活性化することができるPBMCは、シグナル伝達と効率的な刺激のチャンスを増やすこと、共刺激シグナルの完全なパレットを提供しながら、ヒトCD28は、対象グループ（結果は示していない）との違いを検出するのに十分ではなかった。 このプロトコルはleukopacksと患者血液の両方で使用できます。唯...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬や器具の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>をFicoll - Paque PLUS </td><td>アマシャムファルマシアバイオテク</td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS - 1X </td><td>ギブコ</td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>インビトロジェン</td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td>抗CD4マイクロビーズ</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td>プレセパレーションフィルター</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LSカラム</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD4 - APCCy7（クローンRPA - T4） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD25 - PE（クローンM - A251、IL -2Rα） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD8 - FITC（クローンRPA - T8） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD14 - FITC（クローンM5E2、LPSの受容体） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD32 - FITC（クローンFLI8.26、FcγRのタイプII） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD116 - FITC（クローンM5D12、GM -CSFRαチェーン） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M - 450 tosylactivated </td><td>インビトロジェン</td><td> 140から13 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD3 </td><td> Ancell </td><td> 144から024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td>手作り</td><td></td><td> 0.1MのNa 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td>手作り</td><td></td><td> PBS/2mM EDTA / 0.1％BSA pH7.4の</td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td>手作り</td><td></td><td> 0.2M Tris/0.1％BSA pH8.5 </td></tr><tr><td>完全RPMI培地</td><td>手作り</td><td></td><td> RPMI 1640培地2mM L -グルタミン、5mMのHEPES 100 U /μg/ mlのpeni / strept 0.5mMのピルビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td> [3 H]チミジン</td><td>パーキンエルマー</td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td>人間のプールされたAB血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td>マルチスクリーン収穫プレート</td><td>ミリポア</td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td>パーキンエルマー</td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

制御性T細胞（Treg）は自己抗原に対する免疫寛容の重要なメディエーターである。さらに、彼らは感染後の免疫応答の重要な調節因子である。 Tregsの上でユニークな表面マーカーを同定するための努力にもかかわらず、唯一のユニークな特徴は、エフェクターT細胞の増殖や機能を抑制する能力です。それが唯一のin vitroアッセイにおいてヒトTregの機能を評価に使用される場合があることは明らかですが健康な細胞と細胞（1型糖尿- T1Dのような）自己免疫疾患を有する被験者から分離された横断的研究からの結果を評価する際に、これは問題となる必 ​​要があります。比較する。応答者の比率とのin vitro抑制アッセイにおけるヒトで使用されている抗原提示細胞（APC）の数と種類：レスポンダーT細胞、刺激の性質と強さ、Tregの数と種類の研究所の間で大きなばらつきがあります。この変動は、困難なTregの機能を測定する研究間の比較を行います。 Tregのフィールドには、健常者と自己免疫疾患患者の両方でうまく動作する標準化された抑制アッセイを必要とします。我々は、膵β細胞の自己免疫破壊の根底にあるの被験者に比べて健康なボランティアから単離したT細胞の刺激ではほとんどのイントラアッセイのばらつきを示すin vitroでの抑制アッセイで開発した。この作品の主な目的は、異なる被験者グループ間の比較を可能にするin vitroでヒトの抑制アッセイで記述することです。さらに、このアッセイは、このように予防的免疫療法の1から利益を得ることができる科目を識別する、機能をnTregに小さな損失を描くと、将来のさらなる損失を予測する可能性を秘めています。以下、我々は、この手順に必要な手順の徹底的な説明を提供しています。我々はTregの機能を測定するために使用されるin vitroでの抑制アッセイの標準化に貢献したいと考えています。さらに、我々は免疫不均衡の初期の状態とT1Dのための潜在的な機能のバイオマーカーを認識するツールとして、このアッセイを提供する。

Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明<em&gt; in vitroで</emT1D開発するリスクのある被験者において免疫不均衡を識別することができる&gt;アッセイ。

制御性T細胞（Treg）は、自己抗原に対する免疫寛容の重要な媒介因子である。加えて、Tregは免疫応答の極めて重要な調節因子であり、...

この手順の全体的な目的は、in vitro ヒューマンサプレッションアッセイを用いてtreg機能を測定し、将来的な機能喪失を予測することです。まず、細胞刺激剤として使用するコードビーズを調製し、テストすることでこれを達成します。次に、ナイーブCD4陽性CD25陰性T細胞、in vivo 活性化CD4陽性CD25 low T細胞、および制御性CD4陽性CD25 high T細胞を単離し、抗原提示細胞（APC）として使用するための放射線照射PP BMCを準備します。次に、レスポンダーとしてナイーブT細胞または活性化T細胞を用い、APCとしてP BMCsを用いた単独培養、あるいは同一条件下でtregsを1:10の比率で添加した共培養を行います。最終ステップとして細胞を回収し、トリチウム標識チミジンの取り込みによって増殖能を測定します。最終的に得られた結果から、ナイーブT細胞応答とin vivoで活性化されたT細胞応答における抑制能の差を実証することができます。ジェフ・ウッドクリフです。制御性T細胞は、固有の細胞表面マーカーを発現していません。したがって、その機能を確実に測定するためには、最高の分離精度を持つ手法を用いて単離する必要があります。max isolationなどの他の手法と比較して、フローサイトメトリーによる細胞分取（FACS）を用いる主な利点は、非常に純度の高い細胞集団を得られることです。これにより、本手法で示したように、in vitro 抑制アッセイにおいて細胞機能を信頼性高く試験することが可能になります。この手法は、健康な被験者および1型糖尿病に関連する被験者におけるTreg機能への洞察を提供しますが、ヒトの関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症などの他の自己免疫疾患にも適用可能です。抗ヒトCD3でTAAL活性化ビーズをコートします。元のバイアルからM four 50 toil活性化ビーズを1 mL取り、1.5 mLチューブに入れます。すべてのビーズがチューブの壁面に付着するまで、チューブをマグネットスタンドに設置します。次に、チューブをマグネットスタンドに置いたまま、ピペッティングによりビーズバッファーを除去します。その後、チューブをマグネットスタンドから取り出し、バッファー1を1 mL加えます。チューブを繰り返しマグネットスタンドに設置します。チューブをマグネットスタンドに置いたまま、バッファーを除去します。ビーズを1 mLのバッファー1で再び再懸濁します。ここに抗ヒトCD3抗体を40 µL添加します。ビーズと抗体を37 °Cで15分間攪拌します。その後、0.1% w/v BSAを添加し、さらに16時間攪拌を続けます。次に、ビーズを1 mLのバッファー2中で2〜8°Cで5分間インキュベートし、チューブをマグネットスタンドに置いた状態でバッファーを除去する方法で、ビーズをバッファー2で2回洗浄します。その後、同様の無菌条件下でビーズをさらに1回洗浄します。今回は1 mLのバッファー3を用い、細胞あたりに添加するCD3コーティングビーズの数を変化させて抗体コーティングの効率をテストし、最適な比率を決定します。96ウェルプレートの各ウェルに50,000個のPBMCを3連（triplicate）で播種します。37 °Cで72時間培養した後、1 µCiのトリチウム標識チミジンを添加し、さらに16時間インキュベートします。マルチスクリーンハーベストプレートまたは同様のプレートを用いて細胞を回収します。シンチレーション液を加え、ウェルあたりの分当たりカウント数（CPM）を測定します。TopCount® NXTシンチレーションカウンタまたは同等の装置を用い、ビーズと細胞の比率を決定します。当社の経験では、CPMが安定して5,000を超え、かつ15,000未満となる比率が適切です。テストしたすべてのヒト被験者において、通常、細胞1個あたり3個のビーズという比率が、レスポンダー細胞とtreg細胞の両方にとって最適な刺激を与えます。50 mLコニカルチューブにFicoll-Paqueを15 mL満たします。次に、血液のチューブにPBSを250 mL加えることで、50 mLのバフィーコートを1対6に希釈します。層を乱さないように、希釈したバフィーコート25 mLをFicoll-Paqueの上にゆっくりと重層させます。4 °Cで800 ×gにて30分間遠心分離します。ブレーキをオフにした状態で、フィコール液と緩衝液の間の白い中間相であるPBMC層を慎重に回収します。必要に応じて、チューブの壁面から細胞を掻き出してください。数分間待ち、中間相から再度それらを回収します。細胞を新しい50 milliliterチューブに移し、PBSを満たして洗浄し、ペレット化します。PBM cs。洗浄ステップを毎回2回ずつ繰り返します。2つの細胞ペレットを1本のチューブにまとめ、最終的にすべての細胞ペレットを1本の 50 milliliter チューブにまとめます。その後、懸濁細胞 20 microliters を使用して、トリパンブルー染色法により細胞生存率を測定します。生存pbmcを1 mL新しいチューブに移し、テスト用のAPCを調製します。次に、4 mLの培地を加え、細胞に5,000 radsを照射します。残りのPBMCが入ったチューブにはPBSバッファーを満たします。その後、細胞を4°Cで10分間、250×gで遠心分離し、上清を捨てて、同じ混合液4 mLで細胞を再懸濁します。次に、PBMCに200 µLのmax anti CD4 microbeadsを加え、細胞とビーズの混合物を4 °Cで20分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を40 mLのPBSバッファーで洗浄し、細胞をペレット化します。その後、上清を捨て、室温で8 mLの脱気PBSバッファーに細胞を再懸濁します。次に、分画フィルターを使用して細胞懸濁液を分離ろ過します。その後、PBM CSを2本の15 milliliterチューブに分け、各チューブにP BMCsを4 millilitersずつ加えます。2本のカラムをミニマックスセパレーターに固定し、各カラムの下に回収チューブを配置します。次に、各カラムに3 mLのDGAs PBSバッファーを加えます。バッファーがなくなったら、細胞懸濁液が完全に流れ切る前に、各チューブから4 mLの細胞溶液全体をカラムに重層します。さらに、室温のDGAs PBSバッファー3 mLを各カラムに加え、回収チューブへ流し込みます。透明な液体が出てくるまで、さらにバッファーを加えます。DGAsバッファーをLSカラムにさらに5 mLピペッティングし、その後、minimaxセパレーターからLSカラムを取り出します。カラムを新しい滅菌済みの50 mL回収チューブに移します。0.5 mLを流し出した後、残りの約4 mLの容量をゆっくりとプランジャーで押し出します。次に、CD4陽性の2つの画分を合わせます。その後、チューブに最大50 mLのPBSを加え、4 °Cで10分間、400 ×gで遠心分離した後に細胞数をカウントします。細胞を2 mLのPBSバッファーで再懸濁します。表面染色に使用する抗体（anti CD 14、CD 32、CD 16、および必要に応じてanti CD 4）を1本のチューブにまとめます。この混合液の一部を分注し、FLUOROCHROMEマイナスチューブの染色に使用します。チューブ内の細胞懸濁液から5 µLを FACSチューブに移してFMOチューブを調製し、あらかじめ調製した抗体カクテル2 µLで細胞を染色します。次に、セルソーティング用のコンペンセーションコントロールとして使用するため、未染色細胞およびマウスIgGコートビーズをそれぞれ新しい個別のFACSチューブに入れ、単一の蛍光色素で染色します。その後、抗ヒトCD25 PEを50 µLカクテルに加え、そのカクテルを残りの細胞懸濁液に加えます。チューブを4 °Cで30分間インキュベートします。抗体カクテルで細胞をインキュベートした後、細胞にPBSバッファーを加え、遠心してペレット化します。ペレットをPBSバッファーに懸濁し、濃度を10⁷ cells/mLに調整します。FMOチューブを使用して、CD 25陽性T細胞のソーティングのための閾値を設定します。このゲーティング戦略を用いて、まず、この図に示されているように、単球、マクロファージ、およびその他のすべてのCD four陽性非T細胞で構成されるfitz陽性細胞を除外するために、fite陰性細胞の周囲にゲートを設定します。別のプロットで、この図のように、CD 25陰性およびCD 25 low T細胞、およびCD 25 high treg細胞のゲートを描画します。フローサイトメトリーによる細胞サブセットの分取後、回収チューブを遠心してペレット化し、播種までT細胞を氷上に保持する。表に示す通りにU底96ウェルプレートにラベルを貼る。1ウェルあたりレスポンダー細胞1個に対しCD3コートビーズ3個の濃度になるよう計算したCD3コートビーズの50 µL分注量を、10%プールヒトAB血清を含む完全培地で96ウェルプレートに懸濁させ、次いで、あらかじめ照射したAPCを培地で5 × 10⁵ cells/mLの濃度に希釈する。細胞 50 µLを96ウェルプレートに加え、次に2.5 × 10⁴個のCD4陽性CD25陰性またはCD4陽性CD25低発現T細胞を1ウェルあたり3連（triplicate）で加えます。ここに示すように、行Bおよび「tregs only」とラベル付けされたウェルに、共培養の1:10の比率でTregを加えます。その後、プレートを37 °C、5% CO2、飽和湿度のインキュベーター内で72時間培養します。次に、1 µCiのトリチウム標識チミジンで細胞をパルス標識し、共培養の最後の数時間にチミジンが取り込まれた後、さらに37 °Cで16時間培養を継続します。フィルターメイトハーベスターを使用して、マルチスクリーン収穫プレート上の細胞を回収します。次に、あらかじめシンチレーション液を満たしておいた透明プラスチックカバーで収穫プレートを覆います。最後に、ウェルあたりのCPMを測定します。シンチレーションカウンターを用いることで、本システムによりT細胞サブセットを高純度に単離することが可能です。以下のドットプロットの一連の図に示すように、下方のゲートにCD4陽性CD25陰性T細胞が示されています。次の図では、高度に精製されたCD4陽性CD25低発現T細胞が確認できます。これはフローソートされた純粋なCD4陽性細胞集団です。上部のゲートコントロールにCD 25高発現treg細胞が示されています。健常被験者由来のAPCおよびtregの単一細胞種培養では、チミジン取り込み法による測定でバックグラウンド以上の増殖はほとんど認められませんでしたが、ナイーブCD 25陰性T細胞およびin vivo活性化CD 25低発現T細胞は著しい増殖を示し、これらのレスポンダー細胞をtreg細胞と共培養するとその増殖が抑制されました。なお、レスポンダーであるナイーブCD 25陰性T細胞およびin vivo活性化CD 25低発現T細胞に対するtregの抑制能には、わずかな差が観察されました。対照群において有意差は認められませんでした。リスク群被験者由来のAPCおよびTregの単一細胞タイプ培養では、チミジン取り込み法で測定したところ、バックグラウンドに対して増殖はほとんど、あるいは全く認められませんでした。一方で、ナイーブCD25陰性およびInVivo活性化CD25低発現T細胞は、健康対照群と比較して増殖レベルが低いことが示されました。このアッセイは信頼性の高い結果をもたらすため、レスポンダーT細胞はtregおよび共培養によってさらに抑制されました。加えて、低いCPM値はシグナル伝達における潜在的な欠陥を示唆しており、これは別の種類の研究でさらに調査されるべきであると結論付けることができます。しかしながら、リスク群の被験者において、CD 25陰性のレスポンダーT細胞に対するtregの抑制能と、CD 25低発現のレスポンダーT細胞に対する抑制能との間には、有意な差が認められました。このビデオを視聴することで、健康な被験者および、1型糖尿病患者などの免疫系が損なわれた被験者におけるTregsの存在を確認するための、正確で信頼性の高い機能試験に必要なすべての手順を、どのように円滑に連携させて進めるべきかを十分に理解できるはずです。

human-vitro-suppression-as-screening-tool-for-recognition-an-early

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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RNAベースのアプローチを使用して、固形腫瘍組織の定量的免疫プロファイルを決定し、免疫腫瘍学バイオマーカー探索のための臨床コホートを活用することは、分子および情報学的プロトコルを介して記述されています。...

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ヒト腫瘍を有するヒト化マウスモデルにおける癌免疫療法の試験

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ヒトのインビトロ抑制

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