ヒトのインビトロ抑制

本手順の全体的な目的は、in vitroヒト抑制アッセイを用いてtreg機能を測定し、将来的な機能喪失を予測することです。これは、まず細胞刺激剤として使用するコード化ビーズを調製し、テストすることで達成されます。次のステップでは、純粋なナイーブCD4陽性CD25陰性T細胞、in vivo活性化CD4陽性CD25 low T細胞、および調節性CD4陽性CD25 high T細胞を単離し、抗原提示細胞（APC）として使用するための放射線照射PP BMCを準備します。

次に、レスポンダーとしてナイーブT細胞または活性化T細胞を用い、APCとしてP BMCsを用いる単独培養、あるいは同様の条件下でtregsを1:10の比率で添加した共培養を行います。最終ステップとして細胞を回収し、トリチウム標識チミジンの取り込み量によって増殖能を測定します。最終的に得られた結果から、ナイーブT細胞応答とin vivoで活性化されたT細胞応答における抑制能の違いを実証することができます。

私はジェフ・ウッドクリフです。制御性T細胞には、固有の細胞表面マーカーが存在しません。そのため、その機能を正確に測定するには、最大限の分離能を持つ手法を用いて単離する必要があります。

max isolationなどの他の手法と比較して、蛍光活性化細胞分取（FACS）を用いる最大の利点は、極めて純度の高い細胞集団を得られることです。これにより、本手法で示したように、in vitro抑制アッセイにおいて細胞機能を信頼性高く検証することが可能になります。この方法は、健康な被験者および1型糖尿病に関連する被験者におけるTreg機能の知見を提供できますが、ヒトの関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症などの他の自己免疫疾患にも適用可能です。次に、抗ヒトCD3抗体でT cell activation beadsをコートします。

元のバイアルからM four 50 toil活性化ビーズを1 mL、1.5 mLチューブに分注し、すべてのビーズがチューブの壁面に吸着するまでチューブをマグネットスタンドに置きます。次に、チューブをマグネットスタンドに置いたまま、ピペッティングでビーズバッファーを除去します。その後、チューブをマグネットスタンドから取り出し、バッファー1を1 mL加えます。

チューブを再度マグネットスタンドに設置します。チューブをマグネットスタンドに置いたまま、バッファーを除去します。1 mLのバッファー1でビーズを再度再懸濁します。

ここに抗ヒトCD3を40 µL添加します。ビーズと抗体を37 °Cで15分間撹拌します。その後、0.1% w/v BSAを加え、さらに16時間撹拌を続けます。

次に、1 mLの緩衝液2にビーズを2～8 °Cで5分間静置して、ビーズを緩衝液2で2回洗浄します。その後、チューブをマグネットスタンドに置いたまま緩衝液を除去します。さらに、同様の無菌条件下でビーズをもう1回洗浄します。

今回は1 mLのバッファー3を用い、1ウェルあたり50,000個、20,000個、5,000個のPBMCを96ウェルプレートに3連で分注し、細胞1個あたりのCD3コートビーズ数を変えて添加することで、抗体コーティングの効率を試験し、最適な比率を決定します。37 °Cで72時間培養した後、1 µCiのトリチウム標識チミジンを添加し、さらに16時間インキュベートします。マルチスクリーンハーベストプレートまたは同様のプレートを用いて細胞を回収します。

シンチレーション液を添加し、ウェルあたりの1分間あたりのカウント数（CPM）を測定します。TopCount NXTシンチレーションカウンターまたは同等の装置を使用し、ビーズ対細胞の比率を決定します。我々の経験では、CPMが安定して5,000を超え、かつ15,000未満となる比率が適切です。テストしたすべてのヒト被験者において、通常、細胞1個あたり3個のビーズという比率が、レスポンダー細胞とtreg細胞の両方にとって最適な刺激を与えます。

50 mLのコニカルチューブに15 mLのFicoll-Paqueを入れます。次に、血液のチューブに250 mLのPBSを加え、50 mLのバフィーコートを1/6に希釈します。層を乱さないように、希釈したバフィーコート25 mLをFicoll-Paqueの上にゆっくりと重層させます。

4°Cで800 ×gにて30分間遠心分離します。ブレーキをオフにした状態で、フィコールと緩衝液の間にある白い中間相であるPBMC層を慎重に回収します。必要に応じて、チューブの壁面から細胞を掻き出します。

数分間待機し、再び中間相からそれらを回収します。細胞を新しい 50 milliliter チューブに移し、PBS を満たして洗浄してペレット化します。PBM cs。

洗浄工程を毎回2回ずつ繰り返します。2つの細胞ペレットを1本のチューブにまとめ、最終的にすべての細胞ペレットを1本の50 milliliterチューブにまとめます。その後、懸濁した細胞を20 microliters用い、トリパンブルー排除法により細胞生存率を測定します。

生存しているpbmcを1 mL新しいチューブに移し、テスト用APCを調製します。次に、培地を4 mL加え、細胞に5,000 radsを照射します。残りのP BMCsが入ったチューブにPBSバッファーを充填します。その後、細胞を4 °Cで10分間、250 ×gで遠心分離し、上清を捨てて、同じ混合液4 mLで細胞を再懸濁します。

次に、200 µLのmax anti CD4 microbeadsをpbmcに加え、細胞とビーズの混合物を4 °Cで20分間インキュベートします。インキュベーション後、40 mLのPBSバッファーで細胞を洗浄し、細胞をペレット化します。その後、上清を捨て、室温で8 mLの脱気PBSバッファーで細胞を再懸濁します。

次に、分離フィルターを用いて細胞懸濁液をろ過し、分離させます。その後、PBM CSを2本の15 milliliterチューブに等分します。各チューブにP BMCsを4 millilitersずつ加えます。

2本のカラムをミニマックスセパレーターに固定し、各カラムの下に回収チューブを配置します。次に、各カラムに3 mLのDGAs PBS緩衝液を加えます。緩衝液がなくなったら、各チューブから4 mLの細胞溶液全体を、細胞懸濁液が完全に流れ切る前にカラムに重層します。各カラムに3 mLの室温DGAs PBS緩衝液を加え、緩衝液が回収チューブに流れ切るまで待ちます。

透明になるまでバッファーを追加します。DGAsバッファーをさらに5 mL、LSカラムにピペッティングし、その後、minimaxセパレーターからLSカラムを取り出します。カラムを新しい滅菌済みの50 mL回収チューブに移します。

0.5 mLを流し出した後、残りの約4 mLの容量をゆっくりと押し出します。次に、CD4陽性の2つの画分を合わせます。その後、チューブに最大50 mLのPBSを加え、4 °Cで10分間、400 ×gで遠心分離した後に細胞数をカウントします。

細胞を2 mLのPBSバッファーで再懸濁します。FACT染色のに使用する抗体（anti CD 14、CD 32、CD 16、および必要に応じてanti CD 4）を1本のチューブにまとめます。FLUOROCHROMEマイナスチューブの染色用に、この混合液の一部を分注します。

チューブ1 mLあたりの細胞懸濁液から5 µLを FACSチューブに分注してFMOチューブを準備し、あらかじめ調製した抗体カクテル2 µLで細胞を染色します。次に、単一のフルオロクロムで染色し、セルソーティングのコンペンセーションコントロールとして使用するための、未染色細胞およびマウスIgGコートビーズを、それぞれ新しい個別のFACSチューブに加えます。その後、抗ヒトCD 25 PEを50 µLカクテルに添加し、そのカクテルを残りの細胞懸濁液に加えます。

チューブを4 °Cで30分間インキュベートします。抗体カクテルで細胞をインキュベートした後、PBSバッファーを細胞に加え、遠心分離してペレット化します。ペレットをPBSバッファーに懸濁し、濃度を10⁷ cells/mLに調整します。

FMOチューブを使用して、CD 25陽性T細胞をソートするための閾値を設定します。このゲーティング戦略を用いて、まず、この図に示されているように、単球、マクロファージ、およびその他のすべてのCD 4陽性非T細胞であるfitz陽性細胞を除外するために、fite陰性細胞を囲むゲートを設定します。別のプロットで、この図のように、CD 25陰性T細胞、CD 25 low T細胞、およびCD 25 high treg細胞のゲートを描きます。

フローサイトメトリーによる細胞サブセットの分取後、回収チューブを遠心してペレットとし、プレートへの播種までT細胞を氷上で保持します。表に従ってU底96ウェルプレートにラベルを貼ります。1ウェルあたり応答細胞1個に対して3個のビーズとなるように計算したCD3コートビーズの50 µL分注量を、10%プールヒトAB血清を含む完全培地で96ウェルプレート中に懸濁させます。次に、あらかじめ照射したAPCを培地で5×10⁵ cells/mLの濃度に希釈します。

96ウェルプレートに細胞を50 µLずつ加え、次に各ウェルに2.5 × 10⁴個のCD4陽性CD25陰性またはCD4陽性CD25低発現T細胞を3連で加えます。ここに示すように、B列およびtregsのみと表記されたウェルに、1:10の比率でTregを共培養用に加えます。その後、プレートを37 °C、5% CO₂、飽和湿度のインキュベーター内で72時間培養します。次に、1 µCiのトリチウム標識チミジンで細胞をパルス標識し、共培養の最後の数時間にチミジンを取り込ませるため、さらに37 °Cで16時間培養を継続します。

フィルターメイトハーベスターを使用して、マルチスクリーンハーベストプレート上の細胞を回収します。次に、あらかじめシンチレーション液を満たしておいた透明プラスチックカバーで回収プレートを覆います。最後に、ウェルごとのCPMを測定します。

シンチレーションカウンターを用いることで、以下の一連のドットプロットに示すように、本システムによりT細胞サブセットを高純度で単離できます。下部のゲートには、CD4陽性CD25陰性T細胞が示されています。次の図では、高度に精製されたCD4陽性CD25低発現T細胞が確認できます。これはフローソートされた純粋なCD4陽性細胞集団です。

上部のゲートコントロールにCD 25高発現treg細胞が示されています。健常被験者由来のAPCおよびtregの単一細胞種培養では、チミジン取り込み法で測定した結果、バックグラウンドに対して増殖がほとんど認められませんでしたが、一方でナイーブCD 25陰性およびin vivo活性化CD 25低発現T細胞は顕著な増殖を示し、これらのレスポンダー細胞をtreg細胞と共培養するとその増殖が抑制されました。なお、tregがナイーブCD 25陰性およびin vivo活性化CD 25低発現T細胞というレスポンダー細胞を抑制する能力には、わずかな差が観察されました。

コントロール群では有意な差は見られませんでした。リスクのある被験者から得られたAPCおよびTregの単一細胞型培養では、チミジン取り込み法で測定した結果、バックグラウンドをわずかに上回るか、あるいはほとんど増殖が見られませんでした。一方で、ナイーブCD 25陰性細胞およびInVivo活性化CD 25 low T細胞は、健常コントロールと比較して増殖レベルが低いことが示されました。

このアッセイは信頼性の高い結果を導き出すため、レスポンダーT細胞はtregsおよび共培養によってさらに抑制されました。さらに、低いCPM値はシグナル伝達に潜在的な欠損があることを示唆しており、別の種類の研究でさらに調査すべきであると結論付けることができます。しかしながら、リスクのある被験者において、CD 25陰性のレスポンダーT細胞に対するtregsの抑制能と、CD 25低発現のレスポンダーT細胞に対する抑制能との間には、有意な差が認められました。

このビデオを視聴することで、健康な被験者および、1型糖尿病などの免疫不全状態にある被験者を対象に、Tregsの存在を判定するための信頼性の高い機能試験を成功させるために必要な全工程を、どのようにスムーズに連携させるかについて深く理解することができます。