レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

この手順の全体的な目標は、抑制性ニューロン回路の局所的な機能組織を調査することです。この手順は、マウスの一次体性感覚皮質から生きた脳スライスを準備することから始まります。次のステップは、脳スライス内の標的GFP発現阻害細胞タイプを視覚化し、記録することです。

このグルタミン酸によるレーザー走査型光刺激に続いて、アンケージングを使用して、興奮性または抑制性としてシナプス前ニューロンの小さなクラスターを活性化します。シナプス後電流は、ニューロン間を発現するGFPに記録されます。最後のステップは、光刺激、データ分析を行い、記録されたニューロンへのシナプス入力の定量的マップを生成することです。

最終的に、レーザー走査型光刺激と全細胞記録を組み合わせることで、特定のタイプの抑制性ニューロンへのシナプス入力の詳細なマップの構築が可能になり、局所的な抑制性皮質回路の組織化と機能を決定することができる可能性があります。光刺激ベースの技術は、ラリー・カッツ博士、ネッド・キャロウェイによって開拓され、さらにキャロルズ・ワボダ博士によって開発されました、私のパイ、博士XingZは、ソーク研究所のキャロウェイ博士と一緒に訓練を受け、彼は口腔間回路を研究する多くの研究を主導しました。当グループでは現在、これらの研究を発展・継続し、口腔間回路の検討を進めています。

この手順を開始するには、出生後2〜3週間でトランスジェニックマウスを斬首して犠牲にし、すぐに脳を取り出し、脳を凍結して酸素化された切断溶液に入れます。次に、GFPゴーグルを使用して脳を視覚的にスクリーニングし、GFPの発現を確認します。次に、バイブレーターで一次体性感覚皮質を厚さ400マイクロメートルのセクションにスライスします。

95%O2と5%CO2で32°Cで泡立ったA CSFを含むスクロースでスライスを30分から1時間インキュベートします。その後、スライスを室温で通常のA CSFに移してレーザーを実験の準備をし、レーザー冷却システムと電源をオンにします。次に、走査ミラーシステム、光変調器、電子シャッター、フォトダイオード入力アンプなど、光刺激制御に関連するすべてのハードウェアをオンにします。

次に、マルチクランプ700Bアンプやマイクロマニピュレータなどの電気生理学的機器の電源を入れます。電気生理学的記録、光刺激、およびイメージングは、顕微鏡の電動ステージに取り付けられたスライス灌流チャンバーで行われます。その後、イメージングカメラの電源を入れると、スライスはイメージングシステムを介して赤外線DICおよびエピ蛍光光学系を備えた正立顕微鏡で視覚化されます。

次に、MATLAB ベースの FS ソフトウェアと Q キャプチャ カメラ ソフトウェアをモニターで開きます。実験を実行する前に、レーザー光刺激システムをチェックし、動作状態にあることを確認してください。4 x 顕微鏡対物レンズの下に紙を置き、システムの実行中にレーザースキャンパターンを観察します。

4〜6メガのOM抵抗を持つマイクロ電極を作成するには、ピペットプーラーでガラス電極を引っ張ります。次に、細胞の標識と形態学的同定のために、0.1%ビオチンを含む内部溶液を電極に充填します。次に、加圧灌流システムをオンにして、CSFをチャンバーに送り込みます。

チャンバー内のスライスから2.0ミリメートルの上の一定の液面を確保します。MNI ケージ入りグルタミン酸のストック溶液のアリコートを 25 ミリリットルの循環 A CSF に添加して、0.2 ミリモルのケージ型グルタミン酸の濃度にします。次に、1つの脳スライスを記録チャンバーに移します。

イメージングシステムを実行してスライスの品質を確認し、主要な体性感覚領域を解剖学的に特定します。次に、カスタムメイドのストリング付きプラチナリングでスライスを固定し、録音用の脳領域にアンカーを置かないように注意してください。DIC蛍光顕微鏡下でのGFP発現の可視化に基づく60倍対物レンズで細胞を可視化します。

阻害細胞の種類を同定し、選択します。録音は、赤外線DICによる目視制御の下で行われますので、ご注意ください。ビデオモニタリングやDICモードと蛍光モードの切り替えは、電極をターゲットセルまで下げながらGFPセルの位置を確認するために必要です。

従来のパッチクランプ技術を使用します。まず、電極に正圧をかけます。細胞表面に近づけて、標的の細胞膜に識別可能なくぼみを確立します。

次に、負圧をすばやく加えてギガシールを形成し、ビデオモニターで現在の注入反応を監視しながらセル内で侵入します。侵入後、記録されたニューロン内発現GFPをDICモードと蛍光モードで60倍倍に拡大して画像を撮影し、オンライン検証を行います。光刺激データを収集する前に、過分極電流パルスと脱分極電流パルスを注入して、各細胞の基本的な電気生理学的特性を調べます。

安定すると、通常は20メガオーム未満の良好なアクセス抵抗で全細胞記録が達成され、レーザー走査光刺激のために顕微鏡の対物レンズを60倍から4倍に切り替え、4倍の倍率でスライス画像を取得し、光刺激部位のガイドと登録に使用します。physの設定スイッチモジュールをアクティブにして、光刺激とデータ取得のパラメータを設定します。刺激間隔を1秒にして、約20ミリワットの1ミリ秒のレーザーパルスを使用します。

光刺激マッピングでは、10キロヘルツでサンプリングされた1秒間のデータトレースを取得します。次に、4 x スライス画像を phys の mapper モジュールに読み込みます。体細胞の位置を定義し、80マイクロメートル×80マイクロメートルで16×16のパターンの光刺激サイトを設定します。

細胞位置の周りの間隔で、すべての皮質層をカバーします。次に、電流クランプモードでの光刺激に応答するスパイク位置を調べることにより、記録されたニューロンの励起プロファイルをマッピングします。オンライン表示機能を備えたユーザーフレンドリーなソフトウェアは、マッピング実験を容易にします。

その後、記録されたセルからの興奮性シナプス後電流を検出することにより、局所興奮性回路接続をマッピングします さまざまな場所でレーザースキャンを行い、セルを電圧クランプモードで負の70ミリボルトに保持して、内側への興奮性電流を検出します。次に、光刺激パターンを回転または反転させて、興奮性シナプス後電流マップを2〜3回繰り返します。局所的な抑制性回路の接続をマッピングするには、記録された細胞からの抑制性シナプス後電流を検出します。

この場合、セルをゼロミリボルトに近づけ、電圧クランプモードではマイナス15ミリボルトに保持して、外向きの抑制電流を検出します。すべての生理学的アッセイが完了したら、記録された細胞から電極を静かに取り出します。脳切片をチャンバーから取り出し、4%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、記録された細胞をビオチンに対して染色します。

この実験では、GFP発現、内因性電気生理学、および形態学的特性の組み合わせを使用して、抑制性ニューロンを分類します。表示。以下は、レーザー走査型光刺激を示すための例と生データマップであり、記録された抑制性ニューロンへの局所皮質回路接続の広範なマッピングを可能にします。これは、図Dに示した生のトレースから導き出された色分けされた定量的入力マップの例です。記録されたニューロン間で検出されたシナプスイベントの振幅は、色分けされ、光刺激位置に地形的に重ね合わされています。

セル本体の位置は、スケール バーの赤い白丸で示されます。暖色は強いシナプス入力を示し、寒色は標的細胞への接続が弱いか、まったくないことを示します。同様に、図Eは、サンプリングされたニューロンのアンケージング位置あたりのシナプスイベントの数を示しています。

図Fは、最初に検出されたシナプスイベントの開始時間を、記録された細胞ポストフォト刺激に対してスケールバーで示しています。暖色は入力が短いことを示し、待ち時間は寒色で、シナプスの待ち時間が長いことを示します。したがって、LSPSは、特定のタイプの抑制性ニューロンに影響を与える入力の位置、強度、遅延、および数の詳細なマップの構築を可能にします。

さて、この手順に参加するには、忍耐強く、クリーンな実験条件を作ることが重要ですが、ニューロンを効果的かつ非常に慎重にオブジェクトの高倍率から低修飾に変更することが重要です。その後、ランドソフトウェアの最後の使用は非常にうまくいきました。