ラット皮質ニューロンにおける糸状アクチンプンクタの定量化

ラットの一次皮質ニューロンをポリマーでコーティングされたガラス底皿に入れます。

ニューロンをパラホルムアルデヒドで固定して、細胞構造を維持します。

余分なパラホルムアルデヒドを洗い流します。

非イオン性界面活性剤を加えて細胞を透過処理します。

構造タンパク質糸状アクチン(F-アクチン)を標的とする緑色の蛍光染色で細胞を処理します。

余分な汚れを取り除きます。

ブロッキング剤を塗布して、非特異的抗体の結合を防ぎます。

樹状タンパク質を標的とする一次抗体とインキュベートします。

結合していない抗体を除去します。

赤色蛍光色素結合二次抗体を添加して、一次抗体に結合します。余分な抗体を洗い流します。

蛍光色素を塗布して核を染色します。結合していない染料を取り除きます。

蛍光色素の光退色を防ぐために、退色防止試薬を追加します。

蛍光顕微鏡を使用して、ニューロンの画像をキャプチャします。

標識樹状突起内のF-アクチンに富む領域を特定します。

ソフトウェアを使用して、F-アクチンの涙点またはスポットを数え、樹状突起の長さを手動でトレースしてF-アクチン密度を計算します。

細胞を室温で15分間4%パラホルムアルデヒドで固定し、続いてPBS洗浄を2回行います。次に、PBS中の0.1%Triton X-100で細胞を5分間透過処理し、室温でF-アクチン特異的染色剤で標識します。20分後、細胞をPBSで2回すすぎ、10%正常なヤギ血清で非特異的細胞表面染色をブロックします。

インキュベーションの最後に、細胞をチキンポリクローナル抗MAP2抗体で摂氏4度で一晩標識します。翌朝、細胞をPBSで2回すすぎ、適切な二次抗体で標識します。

室温で2時間後、細胞を再びPBSですすぎ、室温で3分間10マイクロリットルのヘクストで標識します。次に、細胞をPBSで最後に2回洗浄し、100マイクロリットルの退色防止試薬で保存します。

染色後3日以内に、蛍光顕微鏡の電源を入れ、20倍対物レンズを選択します。次に、顕微鏡ソフトウェアで、ピクセル画像サイズを1,600×1,200に設定し、ピクセルあたり0.17ミクロン画像の解像度を1倍ズームに設定します。細胞のディッシュを顕微鏡ステージに移し、緑色と赤色の蛍光チャネルの下で共標識されたF-アクチンMAP2ニューロンの画像を取得します。

すべての画像が得られたら、明確に定義された樹状突起アーバーを持つ緑、赤、青のチャネル内の個々のニューロンの5つの画像を選択し、連続MAP2免疫蛍光を使用して、2次樹状突起セグメントのF-アクチンに富む構造を同定します。選択した画像領域を水平に回転し、その領域を新しい画像としてコピーして貼り付けます。

次に、画像の背景蛍光を差し引き、ソフトウェアを使用して明るい緑色のF-アクチン涙点の数をカウントします。トレーニングされた独