Gタンパク質共役受容体でアゴニスト活性を定量化

この手順の目的は、濃度反応曲線を解析することにより、受容体の活性状態に対するアゴニストの相対的親和性定数 KB を推定することです。まず、Gタンパク質共役受容体において反応を誘導する一連のアゴニストの濃度反応曲線を測定します。次に、非線形回帰分析を用いて、これらのアゴニストの eemax および EC 50 値を推定します。

これらの値は、その後に行うオペレーショナルモデルを用いた非線形回帰分析における初期パラメータ推定値の算出に使用されます。最終ステップとして、アゴニストの濃度応答曲線をグローバル非線形回帰分析することで、受容体の活性状態に対するアゴニストの親和性定数の相対的な推定値を得ます。最終的に、オペレーショナルモデルの修正形式を用いることで、あるアゴニストの受容体活性状態に対する親和性定数を別のアゴニストに対する親和性定数との相対値として、濃度応答曲線のグローバル非線形回帰分析を通じて推定することが可能です。

この手法は、アゴニストが特定のシグナル伝達経路に対して選択性を持つかなど、創薬分野における重要な疑問への回答に役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな方は、数学的解析の詳細に苦労することがあります。相対的なアゴニストKB値を推定するには、少なくとも2本のアゴニスト濃度応答曲線のシリーズが必要です。

このような実験における検討事項についての詳細は、記述プロトコルを参照してください。反応曲線を得た後、各アゴニスト濃度の存在下で測定された反応から基底反応を差し引き、濃度反応実験のデータをデータテーブルに入力し始めます。Prismソフトウェアでは、すべてのアゴニスト濃度の対数値（log）をXとラベル付けされた列に入力します。最大反応またはEmax値が最大であると考えられるアゴニストの反応測定値を列Aに入力し、他のアゴニストの測定値は隣接するアルファベット順の列に入力します。

濃度反応曲線の繰り返し測定値を、指定されたアルファベット列のサブ列に入力します。データがプロットされているグラフシートを選択し、「分析（analyze）」を選択して、可変勾配式を用いた非線形回帰分析によりデータを分析します。この際、パラメータbottomをゼロに固定して回帰分析を行ってください。初期パラメータ推定値の算出に使用するため、パラメータtopおよびlog EC 50を記録します。

初期パラメータ推定値を算出するには、log tau K observedに標準アゴニストの負のlog EC 50値を割り当てます。次に、各試験アゴニストのlog RAI値を、試験アゴニストのeemax値と標準アゴニストのEC 50値の積を、標準アゴニストのemax値と試験アゴニストのEEC 50値の積で除した値の対数として算出します。この式において、標準アゴニストのパラメータにはアポストロフィを付して表記します。

次に、テストアゴニストの対数親和性定数を、それぞれのEC値の負の対数として割り当てます。Prismにデータを入力する際は、EMAX値が最大のアゴニストのデータを列Aに入力してください。このアゴニストを標準とし、他のアゴニストをテストアゴニストと定義します。続いて、ユーザー定義方程式 log, RAI をPrismの数行に入力します。

このケースでは、ユーザー定義の方程式に計5種類の作動薬が含まれています。受容体 R の初期パラメータ推定値および試験作動薬の親和性定数を入力してください。M sis には標準作動薬の EMAX 値を、M には 1 の値を割り当てます。

次に、テストアゴニストのlog RAI値の初期パラメータ推定値を入力します。log K1を0に固定し、log GR、m、sis、Mをすべてのデータセットで共通の値に設定して、パラメータ制約を適用します。その後、非線形回帰分析を開始します。

結果から、テストアゴニストの観測値であるlog Kおよびlog RAIが得られ、これによりアゴニストのKB値を逆モル単位の絶対単位で推定することができます。ここでは、構成的受容体活性を示す細胞ベースのin vitroアッセイを使用します。書面によるプロトコルに従ってアゴニストを選択し、実験を設計してください。構成的受容体活性および各アゴニスト濃度への応答は、測定された応答から、ここに示した受容体が導入されていない細胞における基底応答を差し引いて算出します。予備分析として、構成的活性が極めて低いシグナリング経路において、同様の方法で算出した様々なアゴニストへの応答を示します。

まず、構成的活性がない場合の説明に従って、データをPrismに入力し、「Accept」をクリックします。また、構成的受容体活性によって引き起こされる応答を、アゴニスト濃度の対数が-20である行の適切な列に入力します。ここで大きな負の対数を入力するのは、アゴニスト濃度が0である近似値を設定するためです。

構成的活性を除き、以前と同様にデータを解析します。構成的活性については、パラメータbottomを制約し、すべてのデータセットで共有させます。共有パラメータに加えて、各アゴニストのパラメータtopおよびlog ECを記録します。別の実験で標準アゴニストのlog affinity定数を決定した後、各部分アゴニストのlog K observed値の初期推定値を、標準アゴニストと試験アゴニストのemax値の差を、EC 50と標準アゴニストのemax値と構成的反応の差の積で除した式の対数として算出します。

各アゴニストのlog KBの初期推定値と、アゴニストのKB値を推定するためのlog T cisの初期推定値を算出します。データをPrismに入力し、ユーザー定義方程式を入力してください。ここでは2つのアゴニストという条件で示しているように、log KBをPrismの複数行に入力します。

次に、各アゴニストの親和性定数（affinity stance）を入力して、初期パラメータ推定値を設定します。log T sis の推定値、M sis の推定値、および M の推定値を入力し、M sis には標準アゴニストの EMAX 値を、M には 1 の値を割り当てます。最後に、log kb の初期推定値を入力します。

log K1を以前に決定した値に固定し、log Tsis、msis、およびMをすべてのデータセットで共通の値に設定することで、パラメータの制約を適用します。非線形回帰分析を開始します。その結果、標準アゴニストのlog KB、観測されたlog K、および部分アゴニストのlog KBが得られます。

ここに示すオペレーショナルモデルにおけるシステムの最大反応、遊離受容体複合体のlog T cys値、およびトランスデューサー勾配係数は、M3ムスカリン受容体を安定発現させたチャイニーズハムスター卵巣細胞における、ムスカリン作動薬誘発性のホスホイノシチド加水分解です。このアッセイで選択したムスカリン作動薬の濃度反応曲線を測定し、Oxotremremolに対する各作動薬のKB値を推定するため、ここに記載する方法でデータを解析しました。理論曲線は、回帰方程式をデータに最小二乗法で適合させたものです。kabale、arecoline、pilocarpine、およびMcN-Cは、log RAI推定値が示されています。

A 3, 4 3. システムの最大反応およびトランスデューサー勾配係数の対応する推定値を決定した。また、示された各アゴニストについて、観察されたlog K値を算出した。

HC 2 93細胞におけるムスカリン受容体作動薬刺激によるホスホイノシチド加水分解の実験結果を以下に示します。G alpha 15を安定的に発現させた細胞にM threeムスカリン受容体を一過性に発現させると、基底レベルのホスホイノシチド加水分解が増加し、これは受容体の構成的活性によるものと考えられました。これらのデータを解析し、Oxo Tremaine MおよびMacNeil, A 3 43のlog KB値を推定しました。

理論曲線は、データに対する回帰方程式の最小二乗近似を示している。Oxo Tremoring MおよびMcNeil, A 3 43のlog KB推定値が示されている。また、McNeil A 3 43のK observed値の推定値も決定した。

このデータ解析手法を習得すれば、適切に行うことでわずか数分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、Gタンパク質共役受容体のシグナル伝達経路の下流で反応を誘発するアゴニストの濃度反応曲線から、相対的なKB値と実際のKB値の両方を推定する方法を十分に理解できるはずです。