小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

この手順は、脊髄損傷後のマウスの後肢骨密度の時間依存的な損失を検出および定量化するために使用される新しい方法を示しています。これは、まず、麻酔をかけたマウスで、無菌およびALAC承認条件下で脊椎離断損傷を行うことによって達成されます。その後、回復期間の後、動物は再麻酔され、右肢と左肢の両方の脛骨と腓骨のX線画像が取得されます。

これは、怪我の40日まで毎週行われます。次に、X線スキャンの画像解析を行います。最後のステップは、切除された後肢の骨密度の死後評価を行うことです。

最終的に、結果は、脊髄損傷がマウスの後肢の骨密度の急速かつ進行性の減少をどのように誘発するかを示しています。この新しい方法は、他のイメージングモダリティで採用されているものよりも低線量のX線を使用して、強力な空間的および時間的解像度を提供します。骨粗鬆症は、脊髄損傷を抱えて生きる人々を苦しめる生命を脅かす状態です。

私たちが提案しているのは、脊髄損傷の動物実験で使用される新しい方法であり、研究者は骨粗鬆症に関連する骨の喪失を長期間にわたって縦断的に追跡することができます。これは 2 つの理由で重要です。1つは、骨粗鬆症の発症を形作るメカニズムを研究する機会を提供することです。

2つ目は、脊髄損傷を患っている患者の骨粗鬆症の発症を予防または逆転させるように設計された新しい介入をテストする方法を提供することです。この方法は、脊髄損傷による骨粗鬆症に関する洞察を提供しますが、閉経後の女性に発生する加齢に伴う骨量減少や、骨折やその他の損傷後の孤立に起因する骨密度の切断による他の外傷誘発性四肢の廃用など、他のシステムにも適用できます治癒過程で大幅な骨量減少につながる可能性があります。全動物縦断的低線量X線イメージングを適用することで、これらの問題を最小限に抑えるか予防するように設計された治療法の開発に新たな道が開かれる可能性がある。

脊髄損傷手術は、サンダーの手順に従って、地域の施設の動物管理および使用委員会のガイドラインに従って実施します。その後、10日目から始まり、脊髄手術後、40日目まで10日間隔で継続します。生きている麻酔切断脊髄損傷動物と無傷の老化マッチコントロールの左右の大腿骨と脛骨をivus Lumina XRシステムを使用してスキャンすることにより評価しますスキャンする前に、内部カメラが摂氏マイナス90°Cの動作温度に達するようにLumina XRデバイスを初期化します。

麻酔をかけた動物をルミナxr内のプラットフォームに置きます。次に、高倍率レンズを挿入して、大腿骨と脛骨の両方の領域に焦点を合わせることができます。被写体が視野内に適切に配置されていることを確認してください。

必要に応じて、ドアを開けて動物の位置を変えます。動物の適切な配置がここに示されている。適切な位置に配置されると、X線機能を実行できます。

エネルギードロップダウンリストから動物に適したものを選択します。次に、コントロールパネルを開きます。X線にチェックマークを付けることでX線機能を有効にし、X線画像を取得します。

ここに示すように、大腿骨と脛骨全体が見えるはずです。生体画像ソフトウェアはデフォルトで変換されたX線画像を表示するため、補正フィルタリングツールメニューに入り、X線吸収の横にあるチェックマークを外して、生のX線画像が表示されることを確認してください。生の画像データは自動的にハードドライブに保存されます。

代表的なTIFFファイルも保存されます。イメージング後、マウスは自宅のケージに戻され、研究者の観察下で回復します。その後、このプロセスが次のマウスで繰り返されます。

まず、表示されるダイアログボックスの生きている画像のアイコンをダブルクリックして、ソフトウェアを開きます。目的のフォルダを選択し、[OK]をクリックします。X線画像をロードするには、参照ボタンをクリックします。

ライブイメージブラウザには、選択したデータとユーザーIDが表示されます。ラベル情報とカメラ設定情報データを開くには、データ行をダブルクリックします。画像とツールパレットが表示されます。

開いているデータは、ブラウザで青色で強調表示されます。次に、[ROIツール]をクリックします。ROI ツールのツール パレットで、型のドロップダウン リストを開き、測定 ROI を選択します。

この実験で使用した 3 つの ROI を読み込むには、四角形のアイコンをクリックして四角形を読み込みます。定規を使用して、大腿骨の長さを測定し、2つの正方形の長さを大腿骨の合計の長さの8分の1になるように調整します。正方形の幅を大腿骨の全長の24分の1になるように調整します。

定規を使用して、大腿骨近位端からの距離の8分の1を測定し、その位置の中心に1つの長方形を配置します。2 番目の長方形を大腿骨遠位端に移動し、膝の小柱領域の中央に配置されるように配置します。次に、脛骨の長さを測定します。

ボックスの長さを脛骨の合計の長さの8分の1に調整します。幅を脛骨の長さの30分の1に調整します。最後に、ボックスが中央に配置され、ここに示すように、近位脛骨端から脛骨距離の全長の8分の1になるようにボックスを配置します。

次に、測定アイコンをクリックすると、ROI強度測定値がX線画像に表示され、ROI測定テーブルが表示されます。このテーブルをドットCSVファイルとして目的の場所にエクスポートします。これにより、Excel を使用してテーブルを開くことができます。

分析するすべての保存された画像でこの手順を繰り返します。最後に、すべてのデータを 1 つの Excel シートに統合します。統計的有意性は、Microsoft ExcelやSigma Plot 11.0ソフトウェアなどのソフトウェアを使用して学生のT検定によって決定され、必要に応じて、結果は、この方法の標準プロトコルを利用して、二重エネルギーX線吸収幾何学を使用した骨密度の死後分析から得られたものと比較することができます。

脊髄損傷後のマウス、脛骨、大腿骨の相対的な骨密度損失は、ナイーブマウスと比較した場合、上記の方法を使用して検出できます。この図は、脊髄損傷後の骨密度低下を、損傷後10日、20日、30日、40日後の近位脛骨で示しています。年齢を合わせたナイーブと比較して、わずか10日後に脛骨の骨密度が12%大幅に減少し、40日後には最大15%の骨密度が失われます。

ここでは、損傷後10日、20日、30日、および40日後の大腿骨近位部の脊髄損傷後の骨密度低下が見られます。年齢一致のナイーブと比較して、損傷後 40 日目に大腿骨近位部の骨密度損失が 7% 減少することが観察されました。このグラフは、脊髄損傷後の大腿骨遠位端の損傷後10日、20日、30日、および40日後の骨密度の低下を示しています。

年齢を重ねたナイーブコントロールと比較して、遠位大腿骨の骨密度の低下は、損傷後10日という早い時期に観察でき、実験の残りの部分を通じて持続しました。この代表的な画像は、デュアルエネルギーX線アボール形状データの画像で、骨ミネラル含有量と骨ミネラル密度出力を示しています。切除された大腿骨は、脊髄損傷の40日後に分析されました。

このプロトコルで実証された方法の有効性を現在利用可能な他の方法と比較するために、この図は、脊髄損傷の大腿骨の骨ミネラル含有量のグラム単位の二重エネルギーX線アボール幾何学分析を示しています。手術後40日のマウスと年齢一致のナイーブ。ナイーブと比較して、脊髄損傷マウスの骨ミネラル含有量の有意な12%の損失が観察されました。

ここでは、デュアルエネルギー、ミリグラム単位の骨ミネラル密度のエクストラアボール幾何学的分析、損傷時の脊髄大腿骨のセンチメートル二乗、損傷後40日のマウスとHマッチナイーブマウスを示しています。骨ミネラル密度の損失は大きく変化しませんでしたが、一度マスターすると骨ミネラル含有量と同様の傾向をたどりました。これは20〜30分で達成できますが、後肢を適切に配置することが重要であることを忘れないでください。

このビデオを観察すると、Caliper Instruments Lumina XRデバイスを使用して、脊髄損傷後の骨密度の生きた動物の縦断的評価を行う方法が理解できるはずです。