小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

この手順では、脊髄損傷後のマウスにおける後肢骨密度の時間依存的な減少を検出および定量するための新しい手法を提示します。まず、無菌状態でALAC（動物ケアおよび利用委員会）の承認を得た条件下で、麻酔下にあるマウスに脊髄切断術を施します。その後、回復期間を経て、動物を再度麻酔し、左右両後肢の脛骨および腓骨のX線画像を撮影します。

これは受傷後40日まで毎週実施します。次に、X線スキャンの画像解析を行います。最後のステップとして、摘出した後肢骨の骨密度について死後評価を行います。

最終的に、結果は脊髄損傷がいかにしてマウスの後肢における骨密度の急速かつ進行的な喪失を誘発するかを示しています。この新しい手法は、他の画像診断法で用いられるよりも低線量のX線を使用して、強力な空間的および時間的解像度を提供します。骨粗鬆症は、脊髄損傷と共に生きる人々を苦しめる、生命を脅かす疾患です。

我々が提案するのは、脊髄損傷の動物研究において、骨粗鬆症に伴う骨量減少を長期的に追跡することを可能にする新しい手法です。これが重要である理由は2点あります。1点目は、これにより骨粗鬆症の発症メカニズムを研究する機会が得られることです。

第二に、脊髄損傷患者における骨粗鬆症の発症を予防、あるいは改善することを目的とした新しい介入策を検証する手段を提供することです。この手法は、脊髄損傷に起因する骨粗鬆症への知見を得られるだけでなく、閉経後女性に起こる加齢に伴う骨量減少や、その他の外傷による骨密度低下などの他の系にも適用可能です。例えば、骨折やその他の損傷後の固定による肢の不使用は、治癒過程において大幅な骨量減少を招くことがあります。個体全体の縦断的な低線量X線イメージングを適用することで、これらの問題を最小限に抑える、あるいは予防するための治療法の開発に新たな道が開かれる可能性があります。

Sanderの手技に従い、かつ地域の施設動物ケアおよび使用委員会（IACUC）のガイドラインに準拠して、脊髄損傷手術を行う。その後、脊髄手術後10日目から開始し、40日目まで10日おきに評価を行う。麻酔下にある生体脊髄切断損傷動物および年齢を合わせた非損傷対照群の左右大腿骨および脛骨を、ivus Lumina XRシステムを用いてスキャンし評価する。スキャンを開始する前に、Lumina XRデバイスを初期化し、内部カメラを作動温度である-90°Cまで到達させておく。

麻酔をかけた動物をLumina xr内のプラットフォームに置きます。次に、大腿骨と脛骨の両方の領域に焦点を合わせられるよう、高倍率レンズを挿入します。被験体が視野内に適切に配置されていることを確認してください。

必要に応じてドアを開け、動物を再配置します。動物の適切な配置をここに示します。正しく配置された後、X線機能を実行できます。

エネルギーのドロップダウンリストから動物に適したものを選択します。次に、コントロールパネルを開きます。x-rayにチェックを入れてx-ray機能を有効にし、x-ray画像を撮像します。

ここに見られるように、大腿骨と脛骨の全体が見えている必要があります。ライブイメージングソフトウェアはデフォルトで変換後のX線画像を表示するため、「corrections filtering tools」メニューに入り、「x-ray absorption」のチェックを外して、生のX線画像が表示されるようにしてください。生の画像データはハードドライブに自動的に保存されます。

代表的なTIFFファイルも保存します。イメージング後、マウスをホームケージに戻し、研究者の観察下で回復させます。その後、次のマウスで同様の手順を繰り返します。

まず、表示されたダイアログボックス内のLiving Imageアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを開きます。目的のフォルダを選択し、OKをクリックします。参照ボタンをクリックしてX線画像を読み込みます。

リビングイメージブラウザには、選択されたデータがユーザーIDと共に表示されます。ラベル情報およびカメラ設定情報が含まれます。データを開くには、データ行をダブルクリックしてください。画像とツールパレットが表示されます。

ブラウザ上でオープンデータが青色で強調表示されます。次に、ROIツールをクリックします。ROIツールのツールパレットにあるタイプドロップダウンリストを開き、measurement ROIを選択します。

本実験で使用する3つのROIをロードするには、四角形のアイコンをクリックして四角形をロードします。定規を用いて大腿骨の長さを測定し、2つの四角形の長さを大腿骨全長の1/8に調整します。四角形の幅を大腿骨全長の1/24に調整します。

次に定規を使用して、大腿骨近位端からの距離の8分の1を測定し、その位置を中心とするように長方形を1つ配置します。2つ目の長方形を大腿骨遠位端に移動させ、膝の海綿骨領域の中央に位置するように配置します。その後、脛骨の長さを測定します。

ボックスの長さを脛骨全長の1/8に調整します。幅を脛骨全長の1/30に調整します。最後に、ここに見られるように、ボックスを中央に配置し、脛骨近位端から脛骨全長の1/8の距離に設置します。

次に、計測アイコンをクリックすると、X線画像にROI強度の計測値が表示され、ROI計測テーブルが現れます。このテーブルを、ドット形式のCSVファイルとして任意の場所にエクスポートしてください。これにより、Excelでテーブルを開くことができます。

解析対象となるすべての保存済み画像に対して、この手順を繰り返します。最後に、すべてのデータを1つのExcelシートにまとめます。統計的有意性は、Microsoft ExcelやSigma Plot 11.0などのソフトウェアを用いたStudentのt検定によって決定します。必要に応じて、この手法の標準プロトコルを用いて、二重エネルギーX線吸収法による骨密度の死後解析から得られた結果と比較することができます。

上記の手法を用いて、脊髄損傷後のマウスの脛骨および大腿骨における、未処置マウスと比較した相対的な骨密度減少を検出できます。この図は、脊髄損傷後10、20、30、および40日目における近位脛骨の骨密度減少を示しています。年齢を一致させた未処置群と比較して、損傷からわずか10日後には脛骨の骨密度が12%有意に減少し、40日後には最大15%の骨密度減少が認められます。

ここでは、脊髄損傷後10、20、30、および40日目における大腿骨近位部の骨密度低下を示しています。年齢を合わせた非処置群と比較して、損傷後40日目に大腿骨近位部で7%の骨密度低下が観察されました。このグラフは、脊髄損傷後10、20、30、および40日目における大腿骨遠位部の骨密度低下を示しています。

年齢を合わせたナイーブコントロール群と比較して、大腿骨遠位部における骨密度の低下は、受傷後わずか10日という早い段階で観察され、その後、実験期間の終了まで持続しました。この二重エネルギーX線吸収法（DXA）データの代表的な画像は、骨ミネラル含量および骨ミネラル密度の算出結果を示しています。摘出した大腿骨は、脊髄損傷から40日後に解析されました。

本プロトコルで示した手法の有効性を現在利用可能な他の手法と比較するため、この図では、脊髄損傷マウス（術後40日）と年齢を一致させたナイーブマウスの大腿骨における骨ミネラル含量（g）のデュアルエナジーX線吸収法（DXA）による解析結果を示しています。ナイーブマウスと比較して、脊髄損傷マウスでは骨ミネラル含量の12%という有意な減少が観察されました。

ここでは、脊髄損傷後40日のマウスと、それに対応する対照群の正常マウスにおける、大腿骨の骨密度（mg/cm²）のデュアルエナジーX線吸収法（DXA）による解析結果を示しています。骨密度の低下に有意な差は見られませんでしたが、骨量（bone mineral content）と同様の傾向が認められました。習熟すればこの操作は20〜30分で完了しますが、後肢を適切に配置することが重要である点に注意してください。

このビデオを視聴することで、Caliper Instruments社製Lumina XR装置を用いて、脊髄損傷後の骨密度の生体動物縦断的評価を行う方法について理解できるはずです。