小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

本手順では、脊髄損傷後のマウスにおける後肢骨密度の時間依存的な低下を検出し、定量化するための新しい手法を示します。まず、滅菌状態かつALAC承認条件の下で、麻酔をかけたマウスに脊髄横断損傷を処置します。その後、回復期間を経て、動物を再度麻酔し、左右両後肢の脛骨および腓骨のX線画像を取得します。

これは、受傷後40日まで毎週実施します。次に、X線スキャンの画像解析を行います。最後のステップとして、摘出した後肢骨の骨密度の死後評価を行います。

最終的に、結果から、脊髄損傷がマウスの後肢において急速かつ進行的な骨密度の低下を誘発することが示されます。この新しい手法は、他の画像診断法で用いられるよりも低線量のX線を使用して、高い空間分解能と時間分解能を提供します。骨粗鬆症は、脊髄損傷と共に生きる人々を苦しめる、生命を脅かす疾患です。

我々が提案するのは、脊髄損傷の動物モデル研究において、骨粗鬆症に伴う骨量減少を長期間にわたって縦断的に追跡することを可能にする新しい手法です。これは2つの理由から重要です。ひとつは、骨粗鬆症の発症機序を研究する機会が得られることです。

第二に、脊髄損傷を抱える患者における骨粗鬆症の発症を予防、あるいは改善するために設計された新しい介入策を試験する手段を提供できる点です。この手法は、脊髄損傷誘発性骨粗鬆症に関する知見を提供しますが、閉経後の女性に見られる加齢に伴う骨量減少や、その他の外傷による骨密度低下、あるいは骨折後の固定やその他の損傷に起因する四肢の不使用による骨量減少など、他の系にも適用可能です。これらの疾患は治癒過程において大幅な骨損失をもたらす可能性があります。個体レベルでの縦断的な低線量X線イメージングを適用することで、これらの問題を最小限に抑える、あるいは予防するための治療法開発に向けた新たな道が開かれると考えられます。

Sanderの手法に従い、また地域の機関動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに準拠して、脊髄損傷手術を実施します。その後、脊髄手術後の10日目から開始し、40日目まで10日おきに継続します。麻酔下にある生体内の脊髄切断損傷動物および、年齢を合わせた非損傷コントロール群の左右の大腿骨および脛骨を、ivus Lumina XRシステムを用いてスキャンし、評価します。スキャン前にLumina XRデバイスを初期化し、内部カメラが動作温度である-90°Cに達するようにしてください。

麻酔をかけた動物をLumina xr内のプラットフォーム上に配置します。次に、大腿骨と脛骨の両方の領域に焦点を合わせられるよう、高倍率レンズを挿入します。被験体が視野内に適切に配置されているか確認してください。

必要に応じてドアを開け、動物の位置を調整してください。動物の適切な配置をここに示します。正しく配置された後、X線撮影機能を実行できます。

エネルギーのドロップダウンリストから、動物に適したものを選択してください。次に、コントロールパネルを開きます。「x-ray」にチェックを入れてX線機能を有効にし、X線画像を撮影します。

ここに見えるように、大腿骨と脛骨の全体が表示されている必要があります。生体イメージングソフトではデフォルトで補正後のX線画像が表示されるため、「corrections filtering tools」メニューに入り、「x-ray absorption」のチェックを外して、生のX線画像が表示されるようにしてください。生の画像データはハードドライブに自動的に保存されます。

代表的なTIFFファイルも保存します。イメージング後、マウスをホームケージに戻し、研究者の観察下で回復させます。その後、次のマウスで同様の工程を繰り返します。

まず、表示されたダイアログボックス内のliving imageアイコンをダブルクリックして、ソフトウェアを開きます。目的のフォルダを選択し、OKをクリックします。閲覧ボタンをクリックして、X線画像を読み込みます。

リビングイメージブラウザには、ユーザーIDとともに選択されたデータが表示されます。ラベル情報およびカメラ構成情報も表示されます。データを開くには、データ行をダブルクリックしてください。画像とツールパレットが表示されます。

オープンデータはブラウザ上で青色にハイライトされます。次に、ROIツールをクリックします。ROIツールのツールパレットにあるタイプドロップダウンリストを開き、measurement ROIを選択します。

本実験で使用する3つのROIをロードするには、正方形アイコンをクリックして正方形をロードします。定規を用いて大腿骨の長さを測定し、2つの正方形の長さを大腿骨全長の1/8に調整します。正方形の幅を大腿骨全長の1/24に調整します。

次に定規を使用して、大腿骨近位端からの距離の8分の1を測定し、その位置に中心が来るように1つ目の長方形を配置します。2つ目の長方形を大腿骨遠位端に移動させ、膝の海綿骨領域の中央に位置するように配置します。その後、脛骨の長さを測定します。

ボックスの長さを脛骨全長の1/8に調整します。幅を脛骨全長の1/30に調整します。最後に、ここに見えるように、ボックスを中央に配置し、脛骨近位端から脛骨全長の1/8の距離に設定します。

次に、計測アイコンをクリックすると、X線画像にROI強度の測定値が表示され、ROI測定テーブルが現れます。このテーブルを、ドット形式のCSVファイルとして任意の場所にエクスポートしてください。これにより、Excelでテーブルを開くことができます。

解析対象となるすべての保存済み画像について、このステップを繰り返します。最後に、すべてのデータを1つのExcelシートにまとめます。統計的有意性は、Microsoft ExcelやSigma Plot 11.0などのソフトウェアを用いたt検定によって判定します。必要に応じて、この方法の標準プロトコルを用いて二重エネルギーX線吸収法による骨密度の死後解析から得られた結果と比較してください。

上記の方法を用いることで、脊髄損傷後のマウスの脛骨および大腿骨における、未処置マウスと比較した相対的な骨密度の減少を検出できます。この図は、脊髄損傷後10日、20日、30日、および40日における近位脛骨の骨密度減少を示しています。同齢の未処置群と比較して、損傷後わずか10日で脛骨の骨密度が12%有意に減少し、40日後には最大15%の骨密度減少が認められます。

ここでは、脊髄損傷後10日、20日、30日、および40日における大腿骨近位部の骨密度低下を示しています。年齢を合わせた対照群（naives）と比較して、損傷後40日目に大腿骨近位部の骨密度が7%低下したことが観察されました。このグラフは、脊髄損傷後10日、20日、30日、および40日における大腿骨遠位部の骨密度低下を示しています。

年齢を合わせたナイーブコントロールと比較して、大腿骨遠位部における骨密度の低下は受傷後10日という早い段階で観察され、実験の残りの期間を通じて維持されました。このデュアルエナジーX線吸収法（DEXA）幾何学的データの代表的な画像は、骨ミネラル量および骨密度を示しています。摘出した大腿骨は、脊髄損傷から40日後に解析されました。

本プロトコルで示した手法の有効性を、現在利用可能な他の手法と比較するため、この図では、脊髄損傷後のマウス（術後40日）と年齢を合わせた対照群（naive）の大腿骨における骨ミネラル量（g）の二重エネルギーX線吸収法（DXA）による解析結果を示しています。対照群と比較して、脊髄損傷マウスでは骨ミネラル量が12%有意に減少していることが観察されました。

ここでは、脊髄損傷後40日のマウスと対照群の正常マウスにおける、大腿骨の骨密度（mg/cm²）のデュアルエナジーX線吸収法（DXA）による解析結果を示しています。骨密度の減少に有意な差は見られませんでしたが、骨量（BMC）と同様の傾向が認められました。この操作に習熟すれば20〜30分で完了しますが、後肢を適切に配置することが重要であることに留意してください。

このビデオを視聴することで、Caliper Instruments社のLumina XR装置を用いて、脊髄損傷後の骨密度の生体動物縦断的評価を行う方法を理解できるはずです。