半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折
September 28th, 2017
このプロトコルの目的は、長手方向評価できる生体内で半自動マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいて定量的構造解析を用いた裸ラット骨粗鬆症による脊椎圧迫骨折モデルを生成することです。
この手術モデルと画像解析法の全体的な目標は、前臨床の骨粗鬆症関連の椎体圧迫骨折モデルに対する治療の影響を観察することです。この方法は、骨粗鬆症関連の椎体圧迫骨折の効果的な治療法は何か、そのような治療法が骨再生にどのように役立つかなど、このグリア再生医療分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、裸のラットを対象としているため、免疫拒絶反応の心配なしに新しい治療法をin vivoでテストできることです。
さらに、骨の再生は、ここで紹介するこの方法の基礎となる半自動化されているため、以前に公開された方法よりも正確でユーザー依存が少なくなっています。その手順を実演するのは、当研究室の研究員であるワファ・タワッコリ博士です。まず、100%酸素中の5%イソフルランを使用して骨粗鬆症ラットに麻酔を誘発し、次に2〜3%イソフルランでノーズコーンに移して維持します。
電気シェーバーを使用して腹部を剃ります。0.5%グルコン酸クロルヘキシジンにヨウ素ベースの消毒剤を入れ、続いて70%エタノールで拭きます。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
つま先をつま先つまむ刺激を加えて、適切な麻酔面を確保します。応答が示されない場合は、手順を開始します。麻酔をかけたラットを摂氏37度に設定された加熱パッドに背側横臥位に置き、磁気固定器引き込みシステムを使用して手足を伸ばします。
外科的処置を開始する前に、ラットにカルプロフェンを皮下注射します。.剣状突起の1センチメートル下から正中線を通って皮膚を5〜8センチメートル切開した後、手術用ハサミを使用して、腹腔にアクセスするために白筋線を介して腱膜を切開します。リトラクターを使用して腹腔を露出させます。
ラットの右側に腸をそらして、腹部大動脈と左腎臓を露出させます。脱水症状を避けるために、滅菌された浸したガーゼを使用して内臓を包みます。必要に応じて追加のリトラクターを使用して、大動脈を露出させます。
腰椎を触診してから、露出させます。熱焼灼を使用して、腰椎体L4〜5の前面を露出させ、周囲の結合組織や筋肉からそれらを分離します。綿棒を使用して、L4椎骨から血液と残留組織を取り除きます。
次に、直径2センチメートルの滅菌ドリルビットを使用して、椎体の露出した前面の中央に5ミリメートルの深さの骨欠損をドリルで穴を開けます。最小限の圧力で、腹側皮質とその下にある海綿骨のみをドリルで穴を開けます。背側皮質を穴を開けることは避けてください。
次に、同じ方法でL個の5つの椎骨をドリルして、ラットごとに2つの欠陥を作成します。穴あけが完了したら、腸を腹腔に戻し、リトラクターを取り外します。次に、ビクリル合成吸収性外科用縫合糸を連続パターンで使用して、腱膜を縫合します。
4-0モノフィラメントナイロン非吸収性縫合糸を使用して、単純な中断パターンで皮膚を閉じます。次に、皮膚縫合糸の上部と間に100マイクロリットルの局所皮膚接着剤を塗布して、皮膚が完全に閉じるようにします。ラットに低体温症と脱水症を防ぐための摂氏37度の授乳リンガー溶液を注射し、術後の痛みを和らげるためのブプレノルフィンを注射した後、動物が加熱パッドの麻酔から回復するのを待ちます。
外科的処置の翌日には、以前と同様にイソフルランで麻酔を誘発します。in vivo micro-CTスキャナーを使用してラットをスキャンします。スキャンして麻酔から回復した後、ラットをホームケージに戻します。
解析のために椎骨データを分離するには、micro-CT評価プログラムをクリックし、メニューからサンプルを選択します。次に、マウスを使用して、スライス上の個々の椎骨の輪郭を描きます。Zバーを使用して次のスライスに移動し、同じ方法で個々の椎骨を輪郭に描きます。
ファイルをクリックして輪郭のある椎骨を別のファイルとして保存し、スライスごとにGOBJを保存します。次に、参照椎骨を設定した後、それをマイクロCT環境にインポートします。参照椎骨に定義されたVOIを、micro-CT評価プログラム、ファイル、ロードGOBJをクリックし、以前に作成したGOBJを選択することで、登録した対象椎骨に適用します。
最後に、マイクロCT評価プログラムを使用してVOIを評価用に送信します。この正面3D画像は、欠損発生の1日後の代表的な椎骨欠損画像を示しています。ボイド内の骨形成は赤で示されます。
これは、同じ領域の矢状2D画像であり、最後に軸方向の2D画像です。ここに見られるように、骨形成は時間の経過とともに起こり、縦断的イメージングで検出されます。骨容積密度と見かけ密度を計算し、反復測定の二元配置ANOVAとボンフェローニ補正を使用して多重比較を行い、比較しました。
ここで見られるように、骨の体積密度と見かけの密度は、椎骨欠損の作成後2週間から大幅に増加します。この手順に続いて、組織学や免疫組織化学などの他の方法を実行して、どの細胞が存在するか、どのタンパク質が欠陥に発現しているかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、ヌードラットに複数の脊椎欠損を作成する方法と、これらの欠損の経時的な骨再生を分析する方法についてよく理解できるはずです。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
このプロトコルは、骨粗鬆症関連の椎体圧迫骨折の裸ネズミモデルを作成し、半自動マイクロコンピュータ断層撮影法を用いた生体内評価を可能にする手法を概説しています。このアプローチにより、骨粗鬆症の状態における骨再生の潜在的治療法の研究が容易になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 骨再生
- 骨粗鬆症研究
背景
- 骨粗鬆症は、特に椎骨において骨折リスクを高めます。
- 裸ネズミは治療研究において免疫拒絶反応を避けるために使用されます。
- マイクロコンピュータ断層撮影法は骨の詳細な構造解析を提供します。
- 骨再生メカニズムの理解は、効果的な治療法の開発に不可欠です。
研究目的
- 骨粗鬆症関連骨折を研究するための信頼できるモデルを確立すること。
- 骨再生に対する新しい治療法の有効性を評価すること。
- 半自動化された方法によって構造解析の精度を向上させること。
使用方法
- 酸素中のイソフルランを用いた麻酔の誘導。
- 裸ネズミにおける椎体圧迫骨折の作成。
- マイクロコンピュータ断層撮影法を用いた骨治癒の長期評価。
- 骨再生に対する治療効果の評価。
主要な結果
- モデルにおける椎体圧迫骨折の成功した誘導。
- 構造評価のための半自動化解析の実現可能性の証明。
- 骨再生を促進する可能性のある治療法の有望性。
- 骨粗鬆症治療の効果理解に貢献する知見。
結論
- 裸ネズミモデルは骨粗鬆症関連骨折の研究に効果的です。
- 半自動化されたマイクロコンピュータ断層撮影法は解析精度を向上させます。
- この研究は骨粗鬆症の新しい治療法の開発をサポートします。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Longitudinal semiautomated microcomputed tomography (μCT) enables precise, reproducible quantification of bone regeneration in preclinical osteoporosis-related vertebral fracture models. This approach supports predictive confidence in evaluating novel bone regenerative therapies and de-risks translational advancement by standardizing structural outcome measures. The method is positioned to inform early discovery, target validation, and preclinical decision-making for osteoporosis and bone tissue engineering portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of bone regeneration hypotheses in a controlled, immunodeficient in vivo system.
- Supports functional target validation by quantifying new bone formation over time in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating treatment effects from immune confounders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, semiautomated workflow for generating and analyzing vertebral defects across cohorts.
- Delivers reproducible, quantitative μCT outputs suitable for comparative screening of regenerative compounds or biomaterials.
- Enables high-content, longitudinal assessment of bone volume and density changes, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints for osteoporosis and vertebral fracture repair.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by using clinically relevant imaging and analysis metrics.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates with demonstrated in vivo efficacy in a reproducible model.
Pipeline & Workflow Integration
This semiautomated μCT-based analysis integrates from early discovery through preclinical evaluation, enabling seamless transition of candidates from hypothesis testing to lead identification and translational validation.
- Discovery Biology: Quantitative imaging supports hypothesis-driven assessment of bone regeneration mechanisms.
- Screening: Standardized defect creation and imaging facilitate reproducible, scalable compound evaluation.
- Analytics: Automated registration and volume-of-interest analysis yield robust, comparable structural metrics.
- Translational Research: Longitudinal imaging aligns with clinical endpoints and supports biomarker development.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other longitudinal imaging-based bone and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone regeneration studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of in vivo imaging analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, μCT imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to in vivo μCT scanners and compatible analysis software for automated registration and VOI definition.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to other bone or tissue defect models where longitudinal imaging is beneficial.
- Dependent on animal model suitability and imaging infrastructure availability.
