Name: 半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学ぶ半自動マイクロCTを用いた裸ラットの骨粗鬆症性椎体骨折モデルの構造解析法。免疫拒絶反応なしで新規治療法の有効性を評価し、骨再生メカニズムの解明に貢献します。

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研究は、再生医学 (CIRM) (TR2-01780) カリフォルニア研究所からの助成金によって支えられました。

機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイの医療センター (プロトコル # 3609) によって承認されたプロトコルの下ですべての動物実験を行った。すべてのイメージングおよび外科手術の麻酔を投与されました。すべての動物は、承認された IACUC プロトコルに従って収容された。
 注: このプロトコルの実験的なデザインは、 図 1 に示します。6 週齢のラットの卵巣を摘出手術餌を 0.01% 0.77% カルシウムとリン酸から成る LCD を購入します。液晶ディスプレイの 4 ヶ月の期間の後、第 4 と第 5 腰椎椎体 (L4-L5) の臨界サイズ椎体欠陥をドリルします。術後、1 日目と欠陥設立後 2、4、8、12 週間のラットをイメージします。1 日目のスキャンの欠陥余白を見つけて標準の位置、向きを変える興味 (VOI) の円柱形状ボリュームを定義します。(すなわち 2、4、8、12 週間) 対応する 1 日目スキャン用に定義された標準的な位置にそれぞれのラットのそれに続く µCT スキャンを自動的に登録します。登録スキャンする定義済み VOI の 1 日を適用します。骨体積密度と、ヴォイスの見掛け密度を評価します。
 1 骨粗鬆症誘導 <ol><li>0.01% 0.77% カルシウムとリン酸から成る液晶ディスプレイの 4 ヶ月で 6 週齢無胸腺卵巣摘出ラットを置く。</li>。
	<li>スイッチは、通常の食事に戻る 。
	注: これらのラットと呼ばれるに &#34; 骨粗鬆症ラット &#34; 以下</li>。
</ol> 2。椎骨の欠陥モデル 注: タイミングは動物ごとの 40-50 分。
<ol><li>オートクレーブすべて手術は手術する前にツールします</li>。
	<li>複数手術の場合すべての手術器具を滅菌.
	<ol><li>道具を洗って 5 分置いて 250 ° C、20 s. 許可する熱いビーズ滅菌セットで 5 分間クールダウンするためのツールのため、超音波発生装置のお風呂には置いて</li>
	</ol></li> <li>誘発麻酔。
	<ol><li>場所誘導室で骨粗鬆症のラットは、中央清掃システムと麻酔器に接続されています。100% 酸素で 5% イソフルランを用いた麻酔を誘導し、2-3% イソフルランにノーズコーンを介して維持します。獣医軟膏を目に麻酔中の乾燥を防ぐために使用します</li>。
		<li>には、麻酔の十分な平面を確保するためつま先ピンチ刺激が適用されます。応答が認められなかった場合は、手順を開始します</li>。
	</ol></li> <li>背臥床加熱パッド (37 ° C) の上の麻酔下ラットを置き、磁気創固定器のリトラクション システム ( 図 2 a) を使って手足を伸ばす 。
	メモ: 麻酔したラットは、体温を調節することができるので加熱パッドの温度と低体温症の予防のために重要です</li>。
	<li>は、電気シェーバーを使用して腹部領域を剃る。ヨウ素系消毒剤およびクロルヘキシジン グルコン酸 70% エタノール 0.5% でそれを綿棒します</li>。
	<li>注入ラット カルプロフェン (5 mg/kg 体重 (BW) 皮下 (SQ)) 手術の手順を開始する前にします</li>。
	<li>は、生殖不能のメスを使って皮膚をカットできます。剣状突起下 1 cm の切開を開始し、正中線 (5 ~ 8 cm) ( 図 2 b) をカットします</li>。
	<li>外科はさみを使用して、リネアを通じて腱膜の切開腹腔内 ( 図 2) にアクセスするアルバ</li>。
	<li>リトラクター ( 図 2 D) を用いた腹部キャビティを公開します</li>。
	<li>は、腹部大動脈と左腎 ( 図 2 e) を公開するラットの右に腸をそらします。それを公開する前に腰椎を触診します。脱水症状を避けるためには、滅菌の浸したガーゼを滅菌生理食塩液を内臓をラップする使用します</li>。
	<li>層の L4 5 腰椎の椎体の前方の面を公開し、周囲の結合組織や筋肉から分離する使用 thermocautery ( 図 2F -G). 
	注意: Thermocautery は解剖時の出血を制御する使用する必要があります</li>。
	<li>は、L4 脊椎骨から血と残留組織を除去するのに滅菌生理食塩水で飽和した滅菌綿棒を使用します。滅菌トレフィン ドリル バール (~ 2 mm 径) を使用して椎体の露出の前方の面の中心に 5 mm の深い骨をドリル (図 2 H-私). 
	注: は、腹側皮質と基になる海綿骨のみにドリルスルーする最小限の圧力を適用します。背側皮質のドリルスルーは避けてください。骨粗鬆症ラットの骨は非常に壊れやすいことに注意してください。欠陥をきれいに存在する場合、出血を止めるための圧力を適用し綿棒を使用します</li>。
	<li>ラット ( 図 2 j) あたり 2 欠陥の合計を作成する L5 の椎骨に 2.11 手順繰り返します</li>。
	<li>腹腔内に腸を返します</li>。
	<li>、Vicryl 合成手術用縫合糸を使用して (3-0 vicryl 非染め色 27 &#34; SH テーパ) ( 図 2 K) 腱膜を縫合する連続的なパターンで</li>。
	<li>単純な中断パターン ( 図 2 L) に 4-0 モノフィラメント ナイロンの非吸収性縫合糸を使用して皮膚を閉じます</li>。
	<li>局所皮膚接着剤皮膚縫合糸の上に、皮膚の完全な閉鎖を確実にそれらの間の適用 100 μ L.</li>
	<li>注入ラット (37 ° C) 暖かい一日リンガー &#39; 低体温症と脱水症を防ぐために s ソリューション (1 cc/100 g BW、SQ).</li>
	<li>必要に応じて、ブプレノルフィン (0.5 mg/kg BW、SQ 前に手術と術後鎮痛のためのすべての 8-12 h とラットの挿入します</li>。
	<li>放置しないでください動物までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。また、それは完全に回復するまで他の動物の会社に手術を受けた動物を返すありません</li>。
	<li>加熱パッドの上に動物が回復後、ケージに戻す 。
	注: 個別にラットの家 (すなわち、 別のケージ) 縫合糸のラット-ラット傷を防ぐために、創傷します</li>。
	<li>ラット食品に到達を支援するいくつかの日後 op のケージの床にシャーレに水に浸したチョウを配置します</li>。
	<li>必要に応じて、痛みを軽減するすべての 24 h のカルプロフェン (5 mg/kg BW、SQ) 24 h 後手術を管理します</li>。
	<li>動物は 2% の下、皮膚縫合を削除イソフルラン麻酔 10-14 日後操作します</li>。
</ol> 3。:Microct スキャン 注: タイミングは動物ごとの 30-40 分。
<ol><li>手術の翌日には、中央清掃システムと麻酔マシンに接続された誘導室で骨粗鬆症のラットを置きます。100% 酸素で 5% イソフルランを用いた麻酔を誘導し、2-3% イソフルランにノーズコーンを介して維持します</li>。
	<li>は、ラット 体内 µCT スキャナーを使用してスキャンします。骨再生の縦断的分析のスキャンを繰り返します 。
	注: すべての動物に (すなわち、 x 線エネルギー、メディア、強度、ボクセル サイズ、および画像の解像度をスキャン) の同じ設定を使用してスキャンすることを確認しもr 向き。たとえば: x 線エネルギー、55 kVP;現在、145 μ A;ボクセル サイズ、35 μ m です。115 μ m 単位積分時間、200 ms;PBS のサンプル。Bouxtein ら を参照してください。詳しい説明と齧歯動物の µCT 骨微細構造の評価のためのスキャンに関連する考慮事項の 34。理想的には、利用可能な最高のスキャン解像度はすべてのスキャンに使用されます。高解像度スキャン タイミング、大規模なデータ セットを生成しより多くの電離放射線に動物を公開します。後者減少骨折治癒など、望ましくない影響が生じる。したがって、追加のデータとスキャン時間の間のトレードオフを注意深く検討されるべき</li>。
</ol> 4。脊椎分離 注: タイミングは 1 サンプルあたり 20-30 分。
<ol><li> 図 3 a に示すように、興味の椎骨を輪郭-I. 隣接する椎骨に属するパーツを排除しながら、椎体のすべての部分を含めることを確認してください。
	<ol><li>をクリックして &#34; µCT 評価プログラム &#34; メニューからサンプルを選択します</li>。
		<li>マウスを使用して各スライスを輪郭</li>。
		<li>使用の &#34; Z &#34; に次のスライスに行くバー</li>。
	</ol></li> <li>凸凹のある椎骨を付けて保存別のファイル ( 図 3J -K) をクリックして &#34; ファイル &#34; &#8594; &#34; 保存 GOBJ &#34; スライスのすべてのカップル</li></ol>。
 5 縦の定量的評価のためのボイの定義 注: スキャンが (参照椎) の手術後 1 日目や 2 回目以降ポイント (からかどうかに依存する次の手順。脊椎を対象).
<ol><li>参照椎骨 。
	注: タイミングは 1 サンプルあたり 20-30 分です。
	<ol><li>Z 回転の欠陥の中心から XY スライスを使用して余白の角度の測定 ( 図 4 a -B)。
		<ol><li>椎体の欠陥がほとんどはっきりと画面キャプチャを椎体の領域に移動 Z 平面上</li>。
			<li>プレゼンテーション ソフトウェアに欠陥が収まる四角形のオブジェクトを準備します</li>。
			<li>欠陥を上向きに直面するように椎体のイメージを回転させる欠陥余白が四角形の辺に平行と</li>。
			<li>回転の角度の測定 (画像を右クリックして &#8594; &#34; 図の書式設定 &#34; &#8594; &#34; サイズ &#34;).</li>
			<li>は、測定角度を使用 ( 図 4) 椎体を回転させる。
			<ol><li>DECterm 新しいウィンドウを開く (&#34; セッション マネージャー &#34; &#8594; &#34; アプリケーション &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;) です</li>。
				<li>実行 &#34; ipl &#34;:</li>
				<li>Ipl &#62; turn3d</li>
				<li>-入力 [で] &#62;</li>
				<li>-[出力] &#62;</li>
				<li>-turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] &#62; 90 90 0</li>
				<li>-turnangle [0.000] &#62; 測定角度</li>
				<li>-img_interpol_option [1] &#62;</li></ol>
			</li></ol></li> <li>X 回転、欠陥の中心から YZ スライスを使用して余白の角度の測定 ( 図 4 -E)。測定角度を使用すると、( 図 4 階) 椎体を回転させる。
		<ol><li>をクリックして &#34; YZ &#34; で &#34; uCT 評価プログラム &#34; と 5.1.1.1-5.1.1.5.2 の手順を繰り返します</li>。
			<li>Ipl &#62; isq</li>
			<li>-[で] aim_name &#62;</li>
			<li>isq_filename [default_file_name] &#62; ISQ ファイル ディレクトリを挿入 (例えば、 &#34; DK0: [:MICROCT。データ。GAZIT。MAXIM.80.DAY1]Z2102970。ISQ &#34;)</li> <li>-pos [0 0 0] &#62;</li> <li>-薄暗い [-1-1-1] &#62;</li></ol></li> <li>ZX 平面に XY 平面を変更することによって回転の椎骨を反転します。
		<ol><li>DECterm 新しいウィンドウを開く (&#34; セッション マネージャー &#34; &#8594; &#34; アプリケーション &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;) です</li>。
			<li>実行 &#34; ipl &#34;:</li>
			<li>Ipl &#62; 反転</li>
			<li>-[入力] 入力 &#62; を</li>
			<li>-入力 [out] &#62; out2</li>
			<li>-new_xydir [yz] &#62; zx</li></ol>
		</li> <li>、ボイを定義します。
		欠陥の中心からの円形の輪郭のアイコンを選択してスライスを使用して欠陥の <ol><li>円形を描く輪郭 &#34; uCT 評価プログラム &#34; ( 図 6 a)。輪郭や欠損 ( 図 6 b) すべてのスライスに貼り付けてコピーします 。
			注: 以来、すべての欠陥は、同じ手順を使用して作成された、スライスと、その後すべてのサンプルの総体積 (テレビ) の同じ数を分析します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>対象椎骨 。
	注: タイミングは 1 サンプルあたり 10 〜 20 分です。
	ターゲットの画像解析ソフトのメイン ウィンドウへの参照椎 <ol><li>ロード、DICOM ファイル 。
		注: グレースケール値の変更を避けるために、同じ定義ロード メニューにオリジナルの DICOM ファイルとしてデータ型を出力します</li>。
		<li>レジスタ参照する椎骨。
		<ol><li>発売、&#34; 3次元ボクセル登録 &#34; モジュールとして参照椎骨を入力し、&#34; ベース ボリューム &#34; とターゲット バーティブラ、&#34; マッチ ボリューム &#34; をクリック &#34; 登録 &#34; 椎骨を登録する (。図 5).</li>
		</ol></li> <li>同じデータ型および µCT 環境にインポートを使って登録されているファイルを保存します</li>。
		<li>、ボイが適用されます。
		クリックして登録された対象椎骨の参照椎骨に対して定義されている <ol><li>適用、VOI &#34; uCT 評価プログラム &#34; &#8594; &#34; ファイル &#34; &#8594; &#34; ロード GOBJ &#34; し、以前に作成した GOBJ を選択します。ボイと欠陥が同心円であることを確認します</li>。
		</ol></li></ol></li></ol> 6。:Microct 分析 注: タイミングはサンプルごとの 10-20 分。
<ol><li>送信 µCT 評価プログラム ( 図 6) を使用して評価のボイ 。
	注: すべてのヴォイスを分析する際に、同じパラメーターを使用するを確認します。しきい値が骨の損失を最小限にバック グラウンド ノイズを省略するには十分に高く設定されていることを確認します。放射線不透過性の生体材料を使用すると、骨形成を分析するさまざまな方法が使えます。生体材料と骨の組織の密度の違いがある場合、生体材料は 35 , 36 を分割可能性があります。それ以外の場合、調査官の骨形成実験群間の違い定性的評価でした</li>。
</ol> 7。安楽死 <ol><li>PPlace 誘導室で骨粗鬆症のラットは、麻酔器に接続されています。100% 酸素による 5% イソフルラン麻酔</li>。
	<li>鼻の円錐形によって麻酔を維持し、安楽死を実施両側気胸 37 を生成する胸腔内を切開しています</li>。
</ol>

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</ol>

本研究は、再生医学 (CIRM) (TR2-01780) カリフォルニア研究所からの助成金によって支えられました。

骨粗しょう症は、脊椎の椎体の崩壊、その結果負荷の増大による脊椎圧迫骨折の最も一般的な原因です。ただし、本物と同様の脊椎骨崩壊を複製する齧歯動物で傷害を生成する実質的に不可能です。研究者が OVCFs16,17,18,19,20,21,24を模倣する椎体の中央に円筒空洞を作成する代わりに、,38,39. 重要なサイズの欠陥が自然に治癒しない完全に 3 ヵ月後のオペアンプ16,</sup...

世界中で以上 2 億人は骨粗鬆症1に苦しんでいます。骨密度 (BMD) の低下基礎となる病理学的、変更された骨微細構造骨の脆弱性と、その結果、破壊2の相対リスクを増やします。骨粗鬆症は横行し、誰がそれを主要な公衆衛生問題に定義の健康に有害です。さらに、世界の人口を年齢どおり、骨粗しょう症がより一般的になると予想されます。
骨粗鬆症性椎体圧迫骨折が最も一般的な脆弱性骨折は、米国で年間 750,000 以上と推定です。9 倍より高い死亡率率は3として重要な罹患率と同じくらいに関連付けられます。臨床試験で現在亀背形成術、椎体形成術などの利用可能な外科的介入がないのより効果的なよりも偽治療4、5、これらの患者に利用できるだけ痛みの管理を離れることが判明。現在の OVCF 治療法が限られているので障害6,7、8をレプリケートすることができます動物のモデルを開発することが不可欠です。このような動物のモデルは、現在の治療法の研究と臨床に変換する新規治療法の開発を促進できます。骨粗鬆症を誘発されており卵巣1,9,10、11,と組み合わせて低カルシウム飼料 (LCD) の投与によるモデル動物で持続的な12,13,14,15. さらにモデルで OVCFs に関連付けられている骨は、椎体骨欠損は骨粗鬆症免疫ラット16,17,18,19、設立されました。 20,21,22,23,24。この作品は、モデル化された骨粗しょう症免疫不全ラットの椎骨の欠陥モデルが表示されます。この小説のモデルは、様々 なソースや OVCFs などの挑戦的な骨折の修復の種由来幹細胞を含む細胞ベースの治療を評価するために使用できます。
骨イメージングは、骨折や骨の病気の評価の重要な部分です。高度なイメージング法は、骨の構造変化と再生戦略25の正確な評価のため開発されました。その中でも、µCT イメージングは、高解像度の 3 D 画像を提供する非侵襲的な使いやすい、安価な方法として浮上しています。µCT イメージングには、高解像度 3 D 骨定量的分析できますマイクロアーキテクチャー26骨粗鬆症患者の評価に他の治療法にいくつかの利点があります。後者は、提案された治療法の治療効果を比較するし使用できます。確かに、µCT 画像生体内では、脊椎骨欠損再生1,16,27を監視のためのゴールド スタンダードです。ただし、いくつかの出版物28,29,30,31ユーザー依存関係、補間バイアス、および µCT の精度誤差を最小限に抑える自動登録ツールを採用しています。イメージングによる解析。最近では、登録手順を使用してこのプロトコル32で説明したように void、標準化された骨における骨再生の分析を向上させる最初ができました。
ここで説明する方法は OVCFs のための新しい細胞療法の効果を研究するため、異種または同種細胞を拒絶するかもしれない T 細胞応答のホストによって妨げられていません。骨粗しょう症は、幼若ラット卵巣摘出 (OVX) と LCD の 4 ヶ月間で誘導されます。LCD と組み合わせて OVX のラットの若い年齢の許可、不可逆的な骨の損失へ導くことによって閉経後骨粗鬆症を模倣した低ピーク骨量に到達します。これは部分的という事実によって、モデリングを改造する骨からラット転移の年齢の約 3 ヵ月、液晶中に腰椎33、上、骨粗しょう症を維持する可能性が高まる相説明できます。時間。若い動物を使用してこのモデルを作るよりコスト効率の高い、低コストに。それにもかかわらず、それは本質的にいない高齢動物の生物学的変化の会計によって制限されます。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン</td><td>MWI動物の健康、パサデナ、カリフォルニア州</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>BetadineSolution</td><td>MWI動物の健康、パサデナ、CA</td><td>4677</td><td></td></tr><tr><td>クロルヘキシジングルコン酸2%スクラブ</td><td>MWI動物の健康、パサデナ、カリフォルニア州 510083</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール70%クォート</td><td>MWI動物の健康、パサデナ、カリフォルニア州</td><td>501044</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MWI動物の健康、パサデナ、CA</td><td>26357</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン 0.3 mg/mL</td><td>MWI アニマルヘルス、パサデナ、CA</td><td>56163</td><td></td></tr><tr><td>卵巣摘出術 Athymic ヌードラット</td><td>Harlan Laboratories、インディアナポリス、インディアナ州</td><td>Hsd:RH-Foxn1 rnu</td><td></td></tr><tr><td>低カルシウム食品</td><td>Newco Distributors, Inc., CA</td><td>1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies Corporation</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>Dermabond</td><td>J & J ETHICON</td><td>DHVM12</td><td></td></tr><tr><td>麻酔器</td><td>パターソン・サイエンティフィック</td><td>TEC 3EX</td><td></td></tr><tr><td>スライドトップ インダクションチャンバー</td><td>パターソン・サイエンティフィック</td><td>78917833</td><td></td></tr><tr><td>プロステーション ヒーテッド・ワークステーション</td><td>パターソン・サイエンティフィック</td>・<td>78914731</td><td></td></tr><tr><td>サージカル・ドレープ</td><td>HALYARD HEALTH INC</td><td>89101</td><td></td></tr><tr><td>磁気固定具引き込みシステム</td><td>Fine Science Tools、Inc.、CA</td><td>18200-50</td><td></td></tr>解<tr><td>剖はさみ、10 cm、湾曲、SS</td><td>World Precision Instruments、FL</td><td>14394</td><td></td></tr>アイ<tr><td>リスはさみ、11.5 cm、45 &deg;アングル、鋸歯状、シャープ/シャープ</td><td>ワールド精密機器、FL</td><td>503225</td><td></td></tr><tr><td>鉗子、no.5</td><td>ワールド精密機器、FL</td><td>555048FT</td><td></td></tr><tr><td>マイクロモスキート止血鉗子</td><td>ワールド精密機器、FL</td><td>503360</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>綿ガーゼ</td><td>メドトロニック、ミネアポリス、ミネソタ州</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>吸収槍-マウント/滅菌</td><td>ファインサイエンスツール、CA</td><td>18105-01</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、1 mL</td><td>TERUMO TERUMO MED</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>針、25 ゲージ</td><td>BD MED SYS インジェクション システム</td><td></td><td></td></tr> 305127 <tr><td>層流フード</td><td>Baker</td><td>SterilGARD e3-Class II Type A2 バイオセーフティ キャビネット</td><td></td></tr><tr><td>サーマル 焼灼ユニット</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>501292</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Drill OmniDrill115/230V</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter</td><td>Fine Science Tools, CA</td><td>18004-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl 未染色 27インチSHテーパー</td><td>J AND J ETHICON</td><td>1663G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 エチロンブラック 18インチPC3 従来の切断</td><td>J AND J ETHICON</td><td>1954G</td><td></td></tr><tr><td>Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40)</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>SCANCO Medical microCT systems software suite</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>Analyze software Biomedical</td><td>Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN</td><td>Analyze 12</td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Veterenery eye ointment</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

骨粗鬆症による脊椎圧迫骨折 (OVCFs) は、世界の人口年齢として有病率の増加とともに共通と臨床的に満たされていない必要です。動物の OVCF モデルは、並進ティッシュ エンジニア リング戦略の前臨床開発に不可欠です。モデルの数が現在存在している間このプロトコルは単一の裸ラットで複数の再現性の高い椎体欠陥を誘導するための最適化手法について説明します。新規縦半自動マイクロ断層レントゲン写真撮影 (µCT)-椎体欠陥に基づいて定量的構造解析はまた、詳細な。簡単に言えば、手術後に複数の時間ポイントでラットをイメージしました。1 日目のスキャンが標準位置に向きを変えると関心の標準的な量を定義しました。各ラットのそれに続く µCT スキャンは、関心の同じボリュームを新しい骨の形成の評価を分析したので 1 日目スキャンに自動的に登録されました。この柔軟なアプローチは、様々 な他のモデルの正確な 3 D 半自動線形から縦断的イメージングによる解析を恩恵に合わせることができます。一緒に取られて、このプロトコルでは、骨粗しょう症や骨の研究のための容易に定量化できると簡単に再現できるシステムをについて説明します。提案されたプロトコルは、2.7 と 4 h 生成、イメージ、および組織のサイズおよび装置によって 2 つの椎体欠陥を分析して裸の卵巣摘出ラットにおける骨粗鬆症を誘発する 4 ヶ月かかります。

このプロトコルを使用して、1 つはイメージでき、n の再生を定量化する異なる時間ポイント間 8 モデル骨粗鬆症性椎体欠陥を =。登録手続きによって得られる解剖学的な一致はすべての時点で同じ VOI の分析のためできます。元の不具合の余白を認識しないときにも、非常に正確な縦 3 D 組織計量解析でこの結果します。骨再生 (図 7) の縦断的評価の例として (1 日目、2 週目、4 週目、8 週目、12 週) の 5 つの時間ポイントを使用しました。2D 断面の例のように図 7Aの) 3 D 画像の定性的評価と骨量 (BVD) と品質 (AD) (図 7 b) の量的な比較によって、再生を評価できます。新たに形成された骨の次の形態計測学的指標を定めることができる: (i) テレビ、骨と軟部組織のボリューム (テレビ、mm3); を含む(ii) 量の石灰化組織 (BV、mm<su...

このプロトコルの目的は、長手方向評価できる生体内で半自動マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいて定量的構造解析を用いた裸ラット骨粗鬆症による脊椎圧迫骨折モデルを生成することです。

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

この外科的モデルおよび画像解析法の全体的な目的は、前臨床の骨粗鬆症関連椎体圧迫骨折モデルを用いて、治療が及ぼす影響を観察することです。この手法は、骨粗鬆症関連椎体圧迫骨折に対する効果的な治療法とは何か、また、そのような治療がどのように骨再生を促進するかといった、グリア再生医療分野における主要な課題への回答を得るのに役立ちます。本手法の主な利点は、ヌードラットを使用するため、免疫拒絶反応を懸念することなく、新しい治療法をin vivoで検証できる点にあります。さらに、本手法の基礎となる骨再生の手順は半自動化されており、既報の手法よりも正確で、ユーザー間の誤差が少なくなっています。本手順のデモンストレーションは、当研究室の研究員であるWafa Tawackoli博士が行います。まず、100% oxygen中で5% isofluraneを用いて骨粗鬆症ラットに麻酔を導入し、その後、維持のために2〜3% isofluraneのノーズコーンへ移します。電気シェーバーを使用して腹部を剃毛します。0.5% chlorhexidine gluconateを含むヨウ素系消毒剤でスワブし、続いて70% ethanolで消毒します。麻酔中の乾燥を防ぐため、眼に動物用眼軟膏を塗布します。足指をつまんで刺激を与え、十分な麻酔深度にあることを確認します。反応が見られない場合、処置を開始してください。麻酔をかけたラットを37°Cに設定したヒートパッド上の背臥位に置き、磁気固定リトラクションシステムを用いて四肢を伸展させます。外科的手順を開始する前に、ラットの皮下にカロプロフェンを注射します。剣状突起の1cm下から正中線に沿って皮膚を5〜8cm切開した後、外科用ハサミを用いて白線を通って腱膜を切開し、腹腔にアクセスします。リトラクターを使用して腹腔を露出させます。ラットの腸を右側に寄せ、腹大動脈と左腎臓を露出させます。脱水を防ぐため、滅菌済みの湿らせたガーゼで内臓を包みます。必要に応じてさらにリトラクターを使用し、大動脈を露出させます。腰椎を触診し、その後、露出させます。電気焼灼器を用いて腰椎第4・第5腰椎体の前面を露出し、周囲の結合組織および筋肉から分離します。綿棒を使用して、第4腰椎から血液および残留組織を除去します。次に、滅菌済みの直径2 cmのドリルビットを使用して、露出した椎体前方の中心部に深さ5 mmの骨欠損を作成します。腹側皮質およびその下の海綿骨のみを穿孔するように、最小限の圧力をかけてドリルを使用してください。背側皮質まで穿孔しないように注意してください。次に、同様の方法でL5椎を穿孔し、ラット1匹あたり2か所の欠損部位を作成します。穿孔が完了したら、腸を腹腔内に戻し、リトラクターを取り除きます。続いて、バイクリル合成吸収性外科用縫合糸を用い、連続縫合で腱膜を縫合します。4-0モノフィラメントナイロン非吸収性縫合糸を用い、単純結節縫合で皮膚を閉鎖します。次に、皮膚の完全な閉鎖を確実にするため、皮膚縫合の上および間に100 µLの局所用皮膚接着剤を塗布します。低体温症と脱水を防ぐための37 °Cの乳酸リンガー液および術後疼痛緩和のためのブプレノルフィンをラットに注射した後、電気毛布（ヒーティングパッド）の上で動物を麻酔から回復させます。手術翌日に、前回と同様にアイソフルランで麻酔を導入します。in vivoマイクロCTスキャナーを用いてラットをスキャンします。スキャン後、麻酔から回復したら、ラットをホームケージに戻します。解析のために椎骨データを分離するには、micro-CT評価プログラムをクリックし、メニューからサンプルを選択します。次に、マウスを使用してスライス上の個々の椎骨を輪郭抽出します。Zバーを使用して次のスライスに移動し、同様の手順で個々の椎骨を輪郭抽出します。「ファイル」、「保存 GOBJ」をクリックし、数スライスごとに輪郭抽出した椎骨を別ファイルとして保存します。次に、参照椎骨を設定した後、それをmicro-CT環境にインポートします。micro-CT評価プログラムの「ファイル」、「GOBJ読み込み」をクリックし、 previously作成したGOBJを選択して、参照椎骨で定義したVOIをレジストレーション済みのターゲット椎骨に適用します。最後に、micro-CT評価プログラムを用いて評価のためにVOIを送信します。この正面からの3D画像は、欠損作成から1日後の代表的な椎体欠損画像を示しています。空隙内の骨形成は赤色で示されています。これは同一領域のサジタル2D画像であり、最後はアキシャル2D画像です。ここで見られるように、骨形成は時間の経過とともに進行し、縦断的イメージングによって検出されます。骨量密度および見かけの密度を算出し、多重比較のためのボンフェローニ補正を伴う反復測定二元配置分散分析（two-way ANOVA）を用いて比較しました。ここで示されているように、椎体欠損の作成から2週間後より、骨体積密度および見かけの密度が有意に増加します。本手順に続き、組織学的検査や免疫組織化学などの他の手法を行うことで、欠損部位にどのような細胞が存在し、どのようなタンパク質が発現しているかといった追加の疑問を明らかにすることが可能です。このビデオを視聴することで、ヌードラットに複数の椎体欠損を作成し、それらの欠損部位における骨再生を経時的に分析する方法について十分に理解できるはずです。

semiautomated-longitudinal-microcomputed-tomography-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

成体マウスの大腿骨と脛骨の骨の損失の長手方向の検討は、連続した低線量X線スキャンを使用して、脊髄損傷後実施した。大腿骨の骨量の減少が40日後の傷害まで検出されていないときに脛骨の骨の損失は、試験期間を通じて検出された。...

小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

本稿は、マイクロで計算された断層レントゲン写真撮影 (µCT) スキャナー体内のユーザー麻酔、正しく位置および脛骨の高分解能イメージング中に最小限の動きでラットの後肢を抑制する方法を指示します。結果は骨のマイクロ...

適切なポジショニングと骨のマイクロ アーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束

セグメント化および定量化 ImageJ プラグインを使用して骨の外側の境界に基づく 2 D と 3 D...

外側境界セグメンテーションと Imagej のプラグインで海綿骨の定量化を支援

マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)は、前臨床試験で骨構造を評価するのに役立つ非破壊イメージングツールですが、骨治癒カルスを分析するためのμCT手順についてはコンセンサスがありません。この研究は、骨折治癒のモニタリングを可能にする段階的なμCTプロトコルを提供します。...

マイクロCTを用いた骨折治癒の評価

このプロトコルはヘマトキシリンEosin (HE)の汚損およびマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)の技術の結合によって骨粗しょう症のマウス...

骨粗鬆症マウスモデルにおける海綿骨マイクロアーキテクチャ評価

このプロトコルは、弾性治療テープを使用して、ステロイド誘発性大腿骨頭骨壊死のためのシンプルで費用対効果の高いラット体重負荷トレーニングモデルの構築を示しています。...

ラットにおけるステロイド誘発性大腿骨頭骨壊死の張力フリー体重負荷モデル

このプロトコルでは、マイクロコンピュータ断層撮影法を使用して、小動物の骨格筋や内臓組織、脂肪組織、骨格組織などの除脂肪体重を費用対効果の高い定量化を可能にします。痩せた組織と脂肪組織を区別し、生物医学研究、特に小動物でのトランスレーショナル研究に大きな利点をもたらします。...

マイクロコンピュータ断層撮影法を用いた小動物における非侵襲的骨格筋定量化

クリティカルサイズの骨欠損におけるユーザー定義の関心領域に対する縦断的マイクロコンピュータ断層撮影画像解析

骨再生をさまざまな階層レベルで評価するためのプロトコルを提案します。このマルチモーダル手法により、異なる長さスケールでの構造解析が可能となり、試料準備の課題に効果的に対処できます。また、骨再生促進におけるバイオマテリアルの効果を評価する信頼性の高いワークフローも提供しています。...

骨再生と足場性能を評価するマルチモーダルアプローチ

細胞構造を正常化する接着剤微細パターンは、薬剤の効果の検出感度を向上させる再現性を改善し、自動画像収集と分析を簡素化するために使用できます。そのような技術は、従来の細胞培養担体上で実行し、結果的に過剰な細胞間のばらつきを患っている薬剤/...

マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

学ぶ半自動マイクロCTを用いた裸ラットの骨粗鬆症性椎体骨折モデルの構造解析法。免疫拒絶反応なしで新規治療法の有効性を評価し、骨再生メカニズムの解明に貢献します。

半自動縦マイクロトモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

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半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

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