半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

この手術モデルと画像解析法の全体的な目標は、前臨床の骨粗鬆症関連の椎体圧迫骨折モデルに対する治療の影響を観察することです。この方法は、骨粗鬆症関連の椎体圧迫骨折の効果的な治療法は何か、そのような治療法が骨再生にどのように役立つかなど、このグリア再生医療分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、裸のラットを対象としているため、免疫拒絶反応の心配なしに新しい治療法をin vivoでテストできることです。

さらに、骨の再生は、ここで紹介するこの方法の基礎となる半自動化されているため、以前に公開された方法よりも正確でユーザー依存が少なくなっています。その手順を実演するのは、当研究室の研究員であるワファ・タワッコリ博士です。まず、100%酸素中の5%イソフルランを使用して骨粗鬆症ラットに麻酔を誘発し、次に2〜3%イソフルランでノーズコーンに移して維持します。

電気シェーバーを使用して腹部を剃ります。0.5%グルコン酸クロルヘキシジンにヨウ素ベースの消毒剤を入れ、続いて70%エタノールで拭きます。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。

つま先をつま先つまむ刺激を加えて、適切な麻酔面を確保します。応答が示されない場合は、手順を開始します。麻酔をかけたラットを摂氏37度に設定された加熱パッドに背側横臥位に置き、磁気固定器引き込みシステムを使用して手足を伸ばします。

外科的処置を開始する前に、ラットにカルプロフェンを皮下注射します。.剣状突起の1センチメートル下から正中線を通って皮膚を5〜8センチメートル切開した後、手術用ハサミを使用して、腹腔にアクセスするために白筋線を介して腱膜を切開します。リトラクターを使用して腹腔を露出させます。

ラットの右側に腸をそらして、腹部大動脈と左腎臓を露出させます。脱水症状を避けるために、滅菌された浸したガーゼを使用して内臓を包みます。必要に応じて追加のリトラクターを使用して、大動脈を露出させます。

腰椎を触診してから、露出させます。熱焼灼を使用して、腰椎体L4〜5の前面を露出させ、周囲の結合組織や筋肉からそれらを分離します。綿棒を使用して、L4椎骨から血液と残留組織を取り除きます。

次に、直径2センチメートルの滅菌ドリルビットを使用して、椎体の露出した前面の中央に5ミリメートルの深さの骨欠損をドリルで穴を開けます。最小限の圧力で、腹側皮質とその下にある海綿骨のみをドリルで穴を開けます。背側皮質を穴を開けることは避けてください。

次に、同じ方法でL個の5つの椎骨をドリルして、ラットごとに2つの欠陥を作成します。穴あけが完了したら、腸を腹腔に戻し、リトラクターを取り外します。次に、ビクリル合成吸収性外科用縫合糸を連続パターンで使用して、腱膜を縫合します。

4-0モノフィラメントナイロン非吸収性縫合糸を使用して、単純な中断パターンで皮膚を閉じます。次に、皮膚縫合糸の上部と間に100マイクロリットルの局所皮膚接着剤を塗布して、皮膚が完全に閉じるようにします。ラットに低体温症と脱水症を防ぐための摂氏37度の授乳リンガー溶液を注射し、術後の痛みを和らげるためのブプレノルフィンを注射した後、動物が加熱パッドの麻酔から回復するのを待ちます。

外科的処置の翌日には、以前と同様にイソフルランで麻酔を誘発します。in vivo micro-CTスキャナーを使用してラットをスキャンします。スキャンして麻酔から回復した後、ラットをホームケージに戻します。

解析のために椎骨データを分離するには、micro-CT評価プログラムをクリックし、メニューからサンプルを選択します。次に、マウスを使用して、スライス上の個々の椎骨の輪郭を描きます。Zバーを使用して次のスライスに移動し、同じ方法で個々の椎骨を輪郭に描きます。

ファイルをクリックして輪郭のある椎骨を別のファイルとして保存し、スライスごとにGOBJを保存します。次に、参照椎骨を設定した後、それをマイクロCT環境にインポートします。参照椎骨に定義されたVOIを、micro-CT評価プログラム、ファイル、ロードGOBJをクリックし、以前に作成したGOBJを選択することで、登録した対象椎骨に適用します。

最後に、マイクロCT評価プログラムを使用してVOIを評価用に送信します。この正面3D画像は、欠損発生の1日後の代表的な椎骨欠損画像を示しています。ボイド内の骨形成は赤で示されます。

これは、同じ領域の矢状2D画像であり、最後に軸方向の2D画像です。ここに見られるように、骨形成は時間の経過とともに起こり、縦断的イメージングで検出されます。骨容積密度と見かけ密度を計算し、反復測定の二元配置ANOVAとボンフェローニ補正を使用して多重比較を行い、比較しました。

ここで見られるように、骨の体積密度と見かけの密度は、椎骨欠損の作成後2週間から大幅に増加します。この手順に続いて、組織学や免疫組織化学などの他の方法を実行して、どの細胞が存在するか、どのタンパク質が欠陥に発現しているかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、ヌードラットに複数の脊椎欠損を作成する方法と、これらの欠損の経時的な骨再生を分析する方法についてよく理解できるはずです。