遺伝子型アプローチを用いた配列解析によるHIV-1コレセプター使用（指向性）の予測

本実験の全体的な目的は、新しいクラスの抗レトロウイルス薬を投与するために、HIV-1の共受容体使用状況を予測することです。これは、患者の血液からウイルスゲノム核酸（ウイルスRNAまたはプロウイルスDNA）を単離し、エンベロープ領域を増幅させることで達成されます。向性の主要な決定因子であるウイルスのV3領域を、ネステッドPCR法により増幅します。

次に、fastaファイルを作成するために、異なるプライマーを用いてV3アンプリコンのシーケンシングを行います。オンライン解析ツール「geno to pheno coreceptor」によって得られた偽陽性率（FPR）に基づき、ウイルスの向性および共受容体アンタゴニストへの感受性に関する結果が得られます。共受容体の利用状況に応じて、HIVウイルスはR5またはX4に分類されます。

マラビロクはCCR5受容体に結合し、標的細胞へのR5ウイルス进入を阻害します。疾患の経過中にX4ウイルスが出現し、R5ウイルスを凌駕することがあります。したがって、EMAおよびFDAが要求している通り、マラビロク投与前に受容体使用能（トロピズム）の判定を行うことが必須となります。

この手法の主な利点は、他の抗レトロウイルス薬クラスに対する耐性を非常に容易に並行して判定できることです。また、トロピズムの結果におけるカットオフ値を患者のニーズに応じて調整できるため、より個別化された医療が可能になります。私たちは、HIV株の細胞培養増殖の差や、患者における疾患進行の分子生物学的根拠を明らかにしたいと考えた1990年代初頭に、この手法を考案しました。本手順の実演は、プロトコルの開始前に当グループの技術者が行います。

臨床施設でEDTA採血を行い、サンプルを回収して研究室へ送付する。その後、メーカーの指示に従い、mag pure compact systemおよび核酸抽出キットを用いて、1000 µLの全血血清または血漿からHIV核酸の分離を開始する。得られたRNAまたはDNAは、50 µLのTEバッファーに溶解させる。次のステップとして、本文に記載の通り、RNAの場合は逆転写PCR、DNAの場合は通常のPCRにより、核酸のエンベロープ領域を増幅させる。この反応により、エンベロープタンパク質領域の大部分を含む1,245 bpの産物が生成されるはずである。エンベロープタンパク質のV3領域を増幅させるには、最初のPCR反応液 5 µLをテンプレートとして用い、ネステッドPCRを行う。

本文に記載されているネステッド院内PCR用マスターミックスを用いて反応液を調製します。ネステッドPCRのランニングパラメータについても、同様に本文に概説されています。V3領域の増幅後、シーケンシングを行う前に、ゲル電気泳動によってPCR産物を解析し、期待される902 base pairの長さの産物が得られているかを確認してください。

記述されたプロトコルに従ってPCR産物を精製します。PCR産物の精製後、本文に記載されている通りにシーケンシング反応を行い、反応終了後に処理します。記述された手順の指示に従い、cidex G 50 superfineおよびduraporeメンブレンを備えたマルチスクリーンフィルタープレートを用いてシーケンシングサンプルを精製します。精製した産物のシーケンシングを行う前に、ポリマーの確認とバッファーの交換を行い、シーケンサーを準備してください。

次にサンプルをロードし、条件を設定してランを開始します。シーケンシングランの後、DNA STAR laser geneプログラムを使用して、配列のアライメントおよび編集を行うことができます。

V3アンプリコンは、少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを用いてシーケンスされます。Lasergeneを用いて、シーケンサーから得られたABIファイルをリファレンス配列にアライメントします。V3、consensus B、およびenvelope Lasergeneを使用して、リファレンスではなく利用可能なすべての生データを用いて解析サンプルのコンセンサス配列を作成し、FASTAファイルとして保存します。

FASTAファイルは、サンプルの名称を含むヘッダーとヌクレオチド配列で構成されるテキストファイルです。データの解析および向性の予測を開始するには、ウェブベースの解析システムにFASTAファイルをアップロードしてください。Geno Tono共受容体において、ウイルスがR5に分類される上限となるFPRカットオフ値を選択します。

ドイツのガイドラインに基づき、ウイルスはR5に分類されます。FPRが20%以上の場合、およびFPRが12.5%未満の場合はX4として分類されます。利用可能な追加の臨床パラメータを選択し、「align and predict」を選択します。このサーバーは、ヌクレオチド配列をアミノ酸に翻訳し、V3コンセンサスB配列とアライメントを行い、サブタイプの分類を提示します。さらに、FPRとして的に表現される共受容体使用率の予測を生成します。

出力結果は、共受容体使用の可能性に応じた段階的な解釈を示します。FPR値が高い場合は、ウイルスがX fourではないことが確実であり、FPR値が低く、解釈、テキスト、背景色が緑色の場合は、ウイルスの状態が不透明であることを意味します。緑色はRavi Rockの安全な投与を示し、黄色はRavi Rock使用による低リスクの可能性を示唆し、赤色はRavi Rockを処方すべきではないことを示しています。

さらに、サーバーは印刷して医師に送付可能なPDFレポートを生成します。患者名や採血日などの追加データは、PDFライタープログラムを使用して手動で含めることができます。また、ユーザーのコンピューター上のプライベートな環境で、特定のコメントを追加することも可能です。

このビデオを視聴後、geno pheno receptorツールを用いてウイルスのトロピズムを決定する方法について十分に理解できているはずです。この手順を実施する際は、定期的に品質管理を行うことが重要です。HIVの取り扱いは極めて危険であるため、常に予防策を講じ、認可された生物学的安全レベルを備えた研究施設（BSL）を使用することを忘れないでください。