Name: アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナとトマト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶIce-Cap法による96ウェルプレートを用いたArabidopsis thalianaとトマトの根組織非破壊採取と高通量ジェノタイピング。遺伝スクリーニング効率を大幅に向上させる革新的な植物分子育種技術です。

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<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
<li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li>
<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single-nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li>
<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するアイスキャップ法は一日で、個々の植物の数百、または数千、から組織サンプルを収集し、効率的にタイピング反応で使用するために、これらのサンプルからゲノムDNAを抽出するためにある科学者が可能になります。個々の科学者を短期間で苗木の遺伝子型の数千に能力を与えることによって、アイスキャップ方式では、そうでない場合は実行するために実用的ではないと遺伝学的実験の数を容易にする可能性を秘めています。いくつかの例を以下に用意されています。 <ol><li> 遺伝的マッピング 。研究者は、第3染色体に沿って指定された時間内で組換えイベントを識別することができる場合ファインスケールの遺伝子マッピングが速くすることができます。この間隔が非常に短い遺伝的距離が含まれている場合は、その後の組換え現象は​​分離マッピング集団では比較的まれである。このような理由から、それは希望の再を見つけるために、個々の植物の数千をスクリーニングする必要がありますcombinant個人。このプロセスは、アイスキャップの使用により大幅に促進された可能性があります。であってもゲノムワイドな再シーケンシングの時代に、それが直接、特定の変異は、関心の表現型の直接の原因であることを実証するために依然として必要です。これらのケースでは、候補となる変異が実際に原因であることを証明するために、他の密接にリンクされている変異から離れて興味の変異を分離することが必要となります。このような状況では、アイスキャップはしっかりとリンクされている変異のペア間の結合を壊すための効率的な方法を提供するであろう。 </li><li> マルチ変異体 。それは、機能的な冗長性4-6を克服するために、単一の個体に複数の別個の遺伝子座から突然変異対立遺伝子を結合するためにシロイヌナズナを研究する研究者のために一般的になっています。例として、1つは遺伝的交雑を介して単一の植物に4つの異なった遺伝子座から突然変異対立遺伝子を結合した​​い場合を考えます。このプロジェクトでは、それが生成するために必要となる交差スキームの一部として、これらの4つの遺伝子座でヘテロ接合体であるn個の個々の。この四重ヘテロ接合体セットの種子は、四重ホモ接合体は子孫の結果として人口の256人に1人の割合で存在することが期待されているときに。伝統的な方法でこの珍しい個々のスクリーニングはかなりの手間になる。比較することにより、このプロジェクトのためにアイスキャップを使用すると、単一の世代に珍しい四重ホモ接合体を識別するための効率的な戦略と科学者を提供するでしょう。 </li><li> iTILLING。当研究室では最近、 シロイヌナズナ 7で目的の遺伝子の誘発突然変異の存在をスクリーニングするための新しいアプローチを説明した。このメソッドは、化学変異原80〜10で治療した患者の順序付けられた集団での変異を見つけるために使用されている耕起と呼ばれる確立された技術のバリエーションです。それがIND許可ティラーの個別バージョンであるため、我々はiTILLINGたちという名前のメソッドにしている伝統的に大規模な研究チームが完了するために必要としていますが何かを達成するためにividual科学者。後述するように氷のキャップは、iTILLING方法7の不可欠な部分を形成している。 </li></ol> iTILLINGの背後にある考え方は、伝統的な耕作のプロジェクト用に作成された耐久性のある変異体の集団とは対照的に立っている一時的な変異個体を、生成することです。 iTILLINGの場合は、筋肉隆々 M2集団から種子は、50から100アイスキャップのブロックに播種し、そしてDNAはアイスキャップ法を用いて抽出されます。 シロイヌナズナ実生は、4に配置されている° C変異のスクリーニングは、アイスキャップのDNAを使用して実行している間プレップ。トマトの苗を12℃で保存されます。苗運搬所望の変異が特定されたら、彼らはアイスキャッププレートから回収し、土壌に転送されます。 iTILLINGは、画面全体の研究コミュニティのための長期的な変異体集団を提供することを意図されていません。その代わり、iTILLINGはどのによって戦略を提供します。ある科学者は、効率的、かつ比較的低コストで、迅速に遺伝子の一握りの突然変異のためのカスタム変異個体を選別できます。 我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米を栽培し、ジェノタイピングのための効果的な方法であることがアイスキャップを発見した。我々は、植物の他の種がまたアイスキャップに従順であることを期待しています。アイスキャップに収容することができる、様々な種の1つの制限は、種子の大きさです。 96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ唯一の植物は、その現在の構成でアイスキャップと互換性があります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td>スペックス/ CertiPrep、メタチェン、ニュージャージー州</td><td> 2000ジェノ/グラインダー</td><td> DNA抽出のためにルートのプレートを振るための機械</td></tr><tr><td> ABgeneサーモシーラー</td><td> ABgene米国</td><td> AB - 0384 </td><td>組織破壊する前にルートのプレートに使用される手動のヒートシール機</td></tr><tr><td>スイングプレートキャリアを装備した遠心する</td><td>ベックマンコールター</td><td>アレグラ25R </td><td>スイングプレートキャリアを持つ任意の遠心は適して</td></tr><tr><td> MicroFillマイクロプレートディスペンサー</td><td> BioTekの www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td>マイクロプレートを埋めるための自​​動化された液体ディスペンサー</td></tr><tr><td> Bialettiブランド17x11インチ商用大型クッキーシート</td><td>ターゲットデパート</td><td> www.bialetti.com </td><td>この特定のクッキーシートは、アイスキャップのための理想的な深さを持っています</td></tr><tr><td>カスタムはメタルラックメイド</td><td>ハードウェアストア</td><td></td><td>完全な説明のテキストを参照してください。 </td></tr><tr><td> 33リットルのプラスチックの収納ボックス</td><td>ターゲットデパート</td><td> Steriliteブランド</td><td>アイスキャップの泉のため。 17x11インチのクッキーシートを保持するのに十分な大きさのプラスチック収納ボックス</td></tr><tr><td>時間噴水ポンプあたり30ガロン</td><td>デイトナ</td><td> 104506 </td><td>ガーデン用品店で入手可能な小型の水中噴水ポンプ</td></tr><tr><td>噴水ポンプ用ホース</td><td>あらゆるラボ供給会社</td><td></td><td>噴水のポンプと互換性のあるホース</td></tr><tr><td>プラスチック製のクランプ</td><td>ハードウェアストア</td><td></td><td>クッキーにホースを保持するクランプシートの</td></tr><tr><td>ファルコンマイクロテスト平底96ウェルのポリスチレンプレートから透明なプラスチックの蓋</td><td> BDファルコン www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td>アイスキャップの苗木のプレートをカバーするための透明なプラスチックの蓋</td></tr><tr><td> 3M細孔サージカルテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch直径のステンレス鋼ボール</td><td>ハートフォードテクノロジーズ、ロッキーヒル、コネチカット州</td><td> 034から006 - 1K </td><td>収穫後の根の組織を妨害するために使用</td></tr><tr><td> 3インチの弾性ヘアバンド</td><td>地元の食料品店</td><td></td><td>苗のプレートにルートのプレートを固定するために使用</td></tr><tr><td>直径4mmの木製串</td><td>地元の食料品店</td><td></td><td>これらの串は、通常、kabobsを準備するために使用されます。 </td></tr><tr><td>フィッシャーサイエンティフィックヌンクブランド、フリットなし1 mLをフィルタープレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 278012 </td><td> 96ウェル底部の穴と苗のプレート。 </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96ウェルトール-チムニーPCRプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14-230-242 </td><td> 96ウェルルートプレート</td></tr><tr><td>寒天 - 細胞培養テスト済み</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4 Morpholinoethanesulfonic酸（MES） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td>ムラシゲとスクーグ（MS）基底塩の混合物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M - 5524 </td><td></td></tr><tr><td>イージーピールのヒートシールホイル</td><td> ABgene米国</td><td> AB - 0745 </td><td>組織破壊する前にルートのプレートをシールするためのヒートシールフィルム</td></tr><tr><td>ダックのブランドエクストラワイド梱包形態テープ、3.00&quot;X 54.6ヤード</td><td>オフィスマックス www.officemax.com </td><td>項目なし。 21242139 </td><td>接着テープストレージのためのDNA抽出を含むシーリングマイクロプレート用</td></tr><tr><td>シーリングローラー</td><td> Bio - Rad社</td><td> MSR - 0001 </td><td>手は、マイクロプレートの上に粘着シールテープを押圧するための転造工具を開催</td></tr><tr><td> 96ウェル金属サーマルブロック</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 36400〜66 </td><td>組織の収穫のためのルートのプレートを凍結するために使用</td></tr><tr><td>ワットマンろ紙</td><td>ワットマンインターナショナル</td><td> 1002 090 </td><td>表面殺菌の種子のために使用</td></tr><tr><td>使い捨てパスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 13から678 - 6A </td><td> 5 ¾苗プレートに種を転送するために使用される&quot;使い捨てパスツールピペット</td></tr><tr><td>パイレックスグラタン皿（20センチ× 30センチ） </td><td>ターゲットデパート</td><td></td><td>ドライアイス/エタノール浴を構築するために使用。 </td></tr></tbody></table>

アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナ</emハイスループットジェノタイピング用96ウェルプレートで>とトマト

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

それは植物の多数の遺伝子型を必要とするプロジェクトを開発するための植物科学者のために一般的になりつつある。あらゆるジェノタイピングプロジェクトの最初のステップは、個々の植物から組織サンプルを収集することです。このタスクの伝統的なアプローチは、一度に1台ずつの植物をサンプリングすることです。個人の遺伝子型の数百または数千に1つの願いは、しかし、タイピングパイプラインの重要なボトルネックで、この戦略の結果を使用している場合。ここでは説明しているアイスキャップ法は、ある科学者が一日の1,2で数千本の苗木から組織を収集できるようにすることで、この課題へのハイスループットなソリューションを提供します。スループットのこのレベルは、組織はむしろ、一度に1台ずつではなく、96枚ごとの植物から収穫されているという事実によって実現されています。 アイスキャップ方式では、苗の成長、組織の収穫、およびDNAの抽出を行うための統合プラットフォームを提供します。アイスキャップのための基礎はseedliの成長です。96ウェルプレートの積層ペアのNGS。アッパープレートのウェルは、個々の苗が発芽する寒天の増殖培地のプラグが含まれています。ルーツは、寒天培地を下に成長する穴に通し、上部プレートを終了し、水を含む下側プレートに渡します。アッパープレートの苗は、室温でままDNA抽出のために組織を回収するために、ルートの組織を含む下側プレート内の水が急速に凍結されています。アッパープレートを氷と96実行可能な苗とワンプレートで凍結96ルートの組織サンプルを一つのプレートをもたらして、離れて下側プレートから剥離される。それがルートの組織をキャプチャするために氷を使用​​するための手法は、&quot;アイスキャップ&quot;という名前です。苗を含む96ウェルプレートは、ホイルで包み、低温に転送できます。このプロセスは、苗のさらなる成長を中断しますが、彼らの生存率には影響しません。遺伝子型の解析が完了したら、目的の遺伝子型を持つ苗木を96ウェルpから転送することができますさらなる伝播のための土壌に遅れて。我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米の苗を使ってアイスキャップ方式の有用性を実証している。我々は、メソッドはまた、96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ植物の他の種にも適用する必要があることを期待しています。

アイスキャップの方法は1つがそれぞれの苗から96ウェルプレートおよび非破壊的収穫根の組織で植物を育てることができます。このルートの組織から抽出したDNAは、遺伝子型の反応に使用することができます。我々は、アイスキャップがうまく機能することを発見した<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;、トマト、そして稲の苗。

植物科学者が、多数の個体のジェノタイピングを必要とするプロジェクトを立ち上げることが一般的になってきています。あらゆるジェノタイピングにおける最初のステップは...

本実験の目的は、96ウェルプレートで栽培した植物苗から、DNA抽出およびジェノタイピングのための根組織サンプルを分離することです。まず、アガー培地を含み、各ウェルの底に穴が開いた特殊な96ウェルプレートで苗を播種・発芽させます。次に、その苗プレートを、水を満たした標準的な96ウェルプレートの上に重ねて配置します。根が下の96ウェルプレートまで伸びたら、積層したプレートをフリージングブロックに配置し、下のプレート内の水を凍結させます。最後のステップとして、上のプレートを下のプレートから剥がし、下のプレートに凍結された状態で根を切り離します。最終的に、得られた根の組織サンプルを用いて、個々の植物からDNAサンプルを抽出し、遺伝型解析に使用することができます。代替法と比較したice capの主な利点は、1日で数千本の植物からDNAを単離できることです。このレベルの生産性が可能なのは、従来の1本ずつの処理ではなく、ice capでは96本を一度に処理できるためです。icecapの利用例としては、多数の異なるマッピング済み変異を持つ、密接に連鎖したIDE産生植物間の希少な組換え体を特定するために大規模な植物集団をスクリーニングすることや、作物種におけるマーカー補助選抜の実施などが挙げられます。基本的に、ジェノタイピングに費用がかかる実験や、個体数が多い植物の実験では、icecap容器の使用によるメリットを得られる可能性があります。もともとicecapはウサギの膿瘍での使用を目的に開発しましたが、イネやトマトの苗から組織を回収する場合でも成功しています。種子が96穴プレートに収まる十分に小さいサイズであれば、他の種においてもicecapが有効であると考えています。まず、苗用プレートをホイルで包み、同時にオートクレーブで滅菌します。オートクレーブサイクル終了後、苗用プレートの透明プラスチック蓋を95% ethanolに浸し、プレートと蓋をラミナーフローフード内で十分に乾燥させます。プレートが完全に乾燥したら、各苗用プレートの底部にパッキングテープを貼り、ローラーを用いてしっかりと密閉します。次に、マイクロフィル・マイクロプレートディスペンサーまたはマルチチャンネルピペッターを使用して、融解した培地 450 µL を各苗プレートのウェルに分注します。プレートにプラスチック製の蓋をし、培地が室温で凝固するまで待ちます。乾燥させた種子をワトマン濾紙の上に散布し、各種子を 95% ethanol で十分に覆います。その後、種子を十分に風乾させます。次に、加工したガラスピペットの火炎滅菌した先端を寒天培地の表面に触れさせ、種子を苗用プレートに移します。これによりピペットの先端が湿り、種子を1粒ずつ容易に採取して寒天表面へ移すことが可能になります。各ウェルに種子が配置されたら、各苗プレートに透明のプラスチック蓋をし、マイクロポア外科用テープで密封します。重ねたプレートをアルミホイルで包み、4 °Cで4日間保存して、種子の層形成（ストラティフィケーション）と発芽の同期化を行います。4日後、苗プレートを18から20 °Cの蛍光灯下でさらに4日間置きます。発芽を開始させるため、アイスキャップファウンテンの表面に蛍光灯の光が直接当たるように、植物育成室の棚に組み立てて設置します。組み立て手順は以下の通りです。まず、プラスチック製ストレージボックスの中にカスタムラック構造を配置し、その上にクッキーシートを置きます。レベリングナットを使用して、クッキーシートの水準を調整します。次に、貯水箱に水中ポンプを設置し、ポンプからの出力ホースをスプリングクランプでクッキーシートの側面に固定します。その後、蒸留水3に対し水道水1の割合で混合した液をアイスキャップファウンテンに満たします。水中ポンプが水位より数センチメートル下がるまで水を加えます。プラスチック製保存容器の最終水位を、ラボテープとマーカーペンで印付けします。96ウェルルートプレートの各ウェルにステンレスボールを1個ずつ入れ、ルートプレートを準備します。次に、蒸留水3部と水道水1部の混合液を340 µLずつ、ルートプレートの各ウェルに分注します。苗用プレートの底面から粘着フィルムを剥がし、透明プラスチック蓋を取り除きます。各苗プレートを、金属ボールと水が入ったルートプレートに設置し、2本のゴムバンドでペアとなったプレートを固定します。次に、重ねたプレートをアイスキャップファウンテンに入れます。ペアにしたプレートをアイスキャップファウンテンに10〜14日間放置してください。この間、蒸留水を補充して、アイスキャップファウンテンの水位を維持します。大部分の苗の根がルートプレートを貫通したら、根組織を採取する準備として、アイスキャップファウンテンからプレートを取り出します。プレートをアイスキャップファウンテンから取り出した後、積み重ねた苗プレートとルートプレートのウェルの間に3本の竹串を差し込みます。串を使用することで、苗プレートの端（ニップ）を根プレートのウェルから持ち上げます。木製串を挿入して重ね合わせたアイスキャッププレートを、ライトの下で一晩静置してください。このインキュベーションにより、根プレート内の液体がわずかに蒸発し、その後の凍結およびプレート分離工程が容易になります。組織採取日に、凍結バスを準備します。ドライアイスと95%エタノールの混合液を入れたPyrex製ディッシュに、96ウェル金属製サーマルブロックを配置します。サーマルブロックを約20分間放置し、温度を平衡化させます。木製串で固定したアイスキャッププレートのスタックを冷却済みサーマルブロックに載せ、5分間インキュベートします。この間に、ルートプレート内の水が完全に凍結します。凍結バスからアイスキャッププレートのスタックを取り出して室温のラボベンチに置き、スタックされたプレートからゴムバンドと木製串を取り除きます。苗プレートの上部を強く押し込み、プレートを割ります。次に、根プレートと苗プレートを慎重に剥がします。根プレート内の水を室温で解凍させてください。あるいは、サーマルブロックでルートプレートをインキュベートすることで、解凍を早めることができます。ルートプレートを解凍させる間、温度を25 °Cに設定してください。苗プレートを保存用に準備してもかまいません。この操作を行うには、苗プレートの下部を粘着テープで密封します。次に、苗プレートの上に透明なプラスチック製の蓋を被せ、マイクロポアテープで固定します。苗のプレートを重ね合わせ、アルミホイルで包み、シロイヌナズナの苗を4 °Cで保存します。苗はこの温度で数週間保存しても、生存能に影響しません。根のプレート内の水が完全に解凍されていることを確認してください。DNA抽出手順を行う前に、プレートを点検し、平均よりも著しく水量が少ないウェルがないか確認してください。水分が不足しているウェルには、ピペットで蒸留水を加えます。次に、ルートプレートの各ウェルに25 µLの500 mM Tris 50 mM EDTA溶液をピペットで分注します。その後、サーマルシールフォイルとヒートシーラーを用いて、ルートプレートのウェルを封印します。密閉したルートプレートを、プレートの密閉端を下に向けた状態でジェノグラインダーにセットします。ジェノグラインダーを用いて、1,350 strokes/minで3分30秒間、プレートを振盪させます。その後、プレートをマイクロプレート用キャリアを備えた遠心機に移し、4 °Cで3,500 RPM、10分間遠心分離し、粉砕した根組織をペレット化します。マルチチャンネルピペットを使用して、ルートプレートの各ウェルから20 µLの上清を、各ウェルに80 µLのmilli Q水が入った新しい96ウェルプレートに移します。この希釈抽出液には、標準的なプロトコルに従ってジェノタイピングPCR反応に直接使用できるゲノムDNAが含まれています。各苗のジェノタイプが特定されたら、苗のプレートを冷蔵保存庫から取り出し、水飽和土壌混合物を充填したポットを準備します。加圧空気とゴムホースを用い、苗プレートのウェルの小さな穴に緩やかな空気圧をかけて、アガールプラグと苗をプレートからラボベンチ上に押し出します。土壌にアガープラグと同程度の大きさの小さな穴を開けます。次に、アガープラグを土壌に配置し、周囲を湿った土で押さえて苗を土壌に固定します。移植した苗を18から22 °Cの光条件下に置きます。移植後の最初の2日間は、各ポットをプラスチック製の蓋で覆います。その後、蓋を取り外し、標準的な育成条件下で植物を成長させます。この画像は、アイスキャップファウンテンで2週間育成され、組織採取の準備が整ったArabidopsisの苗を示しています。2つのウェルのそれぞれにシロイヌナズナの苗が入っています。ルートプレートの同じ2つのウェルの側面図では、根がウェルの内壁に沿ってねじれている様子が示されています。この手法を用いれば、8時間で最大40枚のIceCapプレートを処理することが可能です。これにより、1人の研究者が1日で3,800株以上の個別の苗からDNA調製を行うことが可能になります。この手順を行う際は、苗が発芽したらすぐに播種プレートをアイスキャップファウンテンに移すことが重要です。適切な移殖のタイミングを逃さないよう、毎日プレートを確認してください。実験の成功をお祈りします。

ice-cap-method-for-growing-arabidopsis-tomato-plants-96-well-plates

Research

JoVE Journal

Biology

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