アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産

本手順の全体的な目的は、品質を維持しながら製造時間とコストを削減し、高タイターの組換えパルボウイルス（rec PVs）を産生することである。これは、まずrec PVプラスミドとアデノウイルス5型由来のベクターをHEK 293T細胞にトランスフェクションし、初期のrec PVウイルスストックを作製することで達成される。HEK 293T細胞にアデノウイルスのゲノム要素を導入することで、rec PVsの産生量は10倍以上に増加するためである。

既存のプロトコルと比較して、組換えパルボウイルス産生を増強するために必要なアデノウイルスゲノム要素と、パルボウイルスVP遺伝子ユニットの両方を含む新しいAD VPヘルパーが作製されました。次のステップは、標準的なプロトコルに従って、この新しいADD VPヘルパーを産生し、精製することです。

本手順の最終ステップは、NB three 20 4K細胞にrec PVとAD ADPウイルスを共感染させ、rec PVSを増幅させることです。この戦略により、rec PVの産生効率は100倍以上に向上します。この方法は、トランスフェクションによって少量のrec PVSが産生された後にのみ排他的に使用可能です。最終的に、産生されたウイルスストックのタイター測定には、定量リアルタイムPCRまたは形質導入アッセイが用いられます。

さらに、製造工程中に意図しない複製能を持つウイルスが生成されていないことを確認するために、プラークアッセイを実施します。プラスミドを用いた従来の組み換えパルボウイルス製造法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、アデノウイルスVPヘルパーを用いて組み換えパルボウイルスの初期ストックを一度作製すれば、その後の製造は完全にウイルス感染に依存することです。これにより、パルボウイルスの優れた産生細胞であるが、トランスフェクションが困難なNBK細胞を利用することが可能になります。

このようにして、組換えウイルスの増幅が可能となり、ウイルスが持つ一般的な感染力を100倍以上に高めることで、製造時間とコストを削減できます。本手順の実演は、この新しいプロトコルを共同で開発したウイルス製造ユニットの責任者であるBarbara Loicが行います。このビデオがお役に立ち、皆様の実験が成功することを願っております。

トランスフェクションによる組換えパルボウイルス（rec PV）の作製は、その後の感染によるrec PVS作製において、接種源として使用する最小限のrec PVSを生産するために必要です。トランスフェクションの1日前には、rec PVSの作製にバイオセーフティレベル2の実験室が必要となります。10 cmプレートに200万個のHEC 293T細胞を播種し、細胞コンフルエンスが50%になるようにします。

トランスフェクション当日に向けて、10% FBS、L-グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイジンを添加した10 mLのDMEM中で細胞を培養し、37°C、5% CO₂、92%湿度の条件下で一晩インキュベートします。トランスフェクション当日に、1.5 mLチューブを用いてウイルス作製混合液を調製します。目的のトランスジェンを組み込んだrec PVベクター3 µgを、1:2:1のモル比で以下の試薬と共に添加します。

パルボウイルスキャプシド遺伝子ユニットを組み込んだベクターP-C-M-V-V-Pを6 µgと、アデノウイルス由来ヘルパープラスミドを8 µg用意する。プラスミド混合液を無血清培地で850 µLまで希釈し、最終濃度を20 ng/µLにする。次に、FU gene HDトランスフェクション試薬を、試薬とDNAの比率が2.5:1となるように42.5 µL添加する。

FU遺伝子試薬がチューブの壁面に触れないように注意し、5〜10秒間緩やかにボルテックスした後、トランスフェクション混合物を室温で30分間インキュベートします。トランスフェクション混合物を細胞に滴下して加えます。プレートを緩やかに揺すり、混合物を均一に分散させてください。

プレートを37°C、5% 二酸化炭素、92% 湿度の条件下で72時間インキュベートします。この期間に、パルボウイルスプラスミドから子孫パルボウイルス粒子が形成され、ウイルスを回収できるようになります。まず、培地とともに細胞をスクレイパーで回収し、その後、プレートから懸濁液を吸引して15 mLプラスチックチューブに移します。

チューブを250 Gで5分間遠心分離します。室温にて、上清の95%を除去し、約0.5 millilitersを残します。チューブを軽くボルテックスしてペレットを残り上清に再懸濁させ、1.5 milliliterのエッペンドルフチューブに移します。

懸濁液を液体窒素バスで凍結させ、その後37 °Cの温水で融解します。チューブを15秒間激しくボルテックスします。この凍結融解サイクルをさらに2回繰り返します。

チューブを 4 °C、16,000 G で 15 分間遠心分離し、上清を新しいチューブに回収します。この段階の上清には粗ウイルス抽出液が含まれており、感染による rec PVS の生産のための接種源として使用できます。Power virus gain。

Aレプリケーションは、増殖細胞で発現する細胞因子に依存しています。したがって、組換えパワーウイルスの作製に使用する細胞が最適な状態で、本プロトコルで示す適切な密度で播種されていることが重要です。感染の前日に、1,000万個のMB three 20 4K細胞をT 1 75フラスコに播種し、翌日に細胞コンフルエンシーが60〜80%になるようにします。

コントロールとして、同数の細胞を含む2つ目のフラスコを用意します。感染当日の朝、各T 1 75フラスコの最終容量が20 millilitersのMEM（5% FBS、L-glutamine、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加）となるようにしてください。2 milliliterのプラスチックチューブにウイルス混合液を調製します。

これらの試薬を加える。VPヘルパーを加える。MOI 0.5でrec PVSを感染多重度10で加え、MEMを1.5 millilitersまで加える。

ウイルス混合液の全量をT 175フラスコ1本に添加します。37 °C、湿度92%、5% CO2の条件下で、15分ごとに緩やかに振盪しながら2時間インキュベートします。その後、さらに37 °C、湿度92%、5% CO2の条件下で20～24時間インキュベートします。

20～24時間後、培養液を新鮮な培地と交換し、効率的なウイルス産生を促すため、同じ条件下で48時間インキュベートします。ウイルス感染細胞を含むフラスコでは、明らかな細胞毒性の兆候が観察されるはずです。感染後36～48時間から始まり、48時間後、フラスコから培地上清を吸引し、50 milliliterの遠心チューブに移します。

細胞を1.5 mLのPBSで2回洗浄し、トリプシンで3〜5分間処理します。その後、細胞懸濁液を回収した培地に加え、室温で5,000 Gにて5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットに1 mLのTEバッファーを加えます。チューブを緩やかにボルテックスして細胞を再懸濁させてください。次に、細胞懸濁液を液体窒素バスで凍結し、37 °Cの温水で融解させます。

チューブを15秒間激しくボルテックスします。凍結融解サイクルを3回繰り返します。次に、ゲノム細胞および非パッケージ化されたウイルスDNAを消化させるため、細胞懸濁液をBen Naseヌクレアーゼで37°Cで30分間処理します。

30分後、チューブを5,000 Gで20分間、4°Cで遠心分離します。最後に、上清を新しいチューブに回収します。この段階の上清には、粗ウイルス抽出液が含まれています。

本プロトコルに従って産生される組換えPV GFPの標準的な収量は、1～10 × 10⁸ viral infectious unitsの範囲内であるはずです。ここでは、アデノウイルスベースのプラスミドによる組換えPV産生の促進例を示します。GFP遺伝子を保持する、あるいは保持しないPHH one GFP erect PVを含む粗ウイルス抽出液です。

アデノウイルスベースのPXXプラスミドをNBKインジケーター細胞に適用したところ、これらの顕微鏡写真で観察されるように、PXX sixの存在下でGFP陽性細胞が増加しました。GFP形質導入アッセイを実施したところ、Pxx sixの存在下でrec PVの産生が明らかに増加しました。産生量は、従来のプロトコルで得られた細胞あたり0.3 GFP形質導入ユニット（TU）から、本プロトコルで得られた細胞あたり約5 TUへと増加しました。

GFP導入アッセイの結果は、PXX6に含まれるアデノウイルスE2a、E4、およびVA RNA遺伝子がパルボウイルスの産生を増強できることを示しています。次の図は、感染によるrec PV産生の代表的な例を示しています。NB 3204K細胞に精製したADPヘルパーウイルスを感染させ、次いで2種類の組換えパルボウイルスのいずれかを重複感染させました。

粗細胞抽出物を用いてトランスダクションアッセイによりウイルス力価を測定したところ、AD VPヘルパーによってrec PVの産生がさらに促進され、細胞あたり70 T以上に達することが示されました。最後に、ADPの存在下または不在下で産生されたウイルスバッチについて、MB three 20 4Kインジケーター細胞を用いたプラークアッセイにより、複製能を有するウイルス粒子の含有量を分析しました。その結果、ADPヘルパーは、開発後の好ましくない複製能を有するウイルス粒子の発生を増加させることなく、rec PVの産生を促進することが示されました。

この技術により、がんおよび遺伝子治療分野の研究者は、組換えウイルスベクターの製造をさらにスケールアップすることが可能になります。バイオリアクターを用いることで、臨床現場で必要とされる大量の変異体を製造できます。