Name: アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学ぶ アデノウイルス5由来ヘルパーベクターを用いた組換えパルボウイルスの効率的生産法。HEK293T細胞を用いたトランスフェクションと感染法により、従来法より10倍以上の高効率なウイルス産生を実現し、遺伝子治療研究の生産コストと時間を大幅に削減する。

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我々は、特定のマーカス·ミュラー、シルビアミュンスターマン、バーバラLiebetrau、とマンディロッシャーで、DKFZウイルスの生産と開発部のチームに感謝しています。本研究では、部分的に教育研究（BMBF）とドイツKrebsforschungszentrum /Cancéropôleデュグランドエスト応用腫瘍ウイルスの共同プログラムの枠組みの中で、ヘルムホルツ協会の連邦省からの補助金によって支えられてきた。

バイオセーフティーレベル2実験室、組換えパルボウイルス（recPV）の生産に必要とされることに注意してください。 プロトコルは、主に2つの部分に分割されます。最初の部分（トランスフェクションを介してrecPVの生産）プロトコルの2番目の部分（感染症を介してrecPVsの生産）に接種としてrecPVs最小限の量を生成する必要があります。一度recPVs少量のプロトコルの最初の部分は省略することができ、生成され、組換えパルボウイルスは、アデノウイルスヘルパーを介してパルボウイルスキャプシドタンパク質（下記参照）をコードする遺伝子を提供する感染症を介して増幅することができます。 1。トランスフェクションを介したrecPVsの生産 1.1ウイルスDNAトランスフェクションこれは、いずれかのカチオン性脂質またはリン酸カルシウムに基づくプロトコルのこのセクション内の任意の確立されたDNAトランスフェクション法を使用することが可能です。我々は一般的にトランスフェクションHを使用Dトランスフェクション試薬。トランスフェクション効率を制御するために、我々は、発現プラスミド強化緑色蛍光タンパク質（ 例えば、pEGFPを-N1、Clontech社製）で追加のプレートをトランスフェクトすることをお勧めします。細胞集団の少なくとも50％がEGFP陽性トランスフェクション24時間後の結果時にトランスフェクション効率とウイルス産生のための最適と考えられている。 <ol><li>トランスフェクションの前に1日、10 cmのプレートでシード200万HEK293T細胞、トランスフェクションの日で50％コンフルエントの細胞を取得する。 10％ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、mlペニシリン100 Uおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10mlの細胞を成長させる。 </li><li> 1.5 mlチューブでウイルス意思混合物（モル比1時02分01秒）を準備<ol class="lalpha"><li> recPVベクトル3μgのは、関心のある遺伝子（EI PHH-1-GFP 6）を保有する。 </li><li>ベクターpCMV / VP 5保有するパルボウイルスキャプシド遺伝子単位の6μgの</li><li> 8μgのOFアデノウイルス由来のヘルパープラスミドpXX6 7。 </li></ol></li><li> 850μL（20 ng /μlに最終濃度）の無血清培地を有するプラスミドミックスを希釈する。 </li><li> 42.5μlのトランスフェクションのHD（：μgのDNA 2.5:1の比率添加トランスフェクション）を追加します。媒体へのトランスフェクションを追加するときにチューブの側面に触れないでください。 </li><li> 5〜10秒間静かに渦。 </li><li>室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>細胞にトランスフェクション混合物の滴下を追加します。均等に全体に混合物を配布するために静かにプレートを横に振る。 </li></ol> 1.2ウイルス産生<ol><li>収穫前に72時間、92％湿度、5％CO 2で37℃でプレートをインキュベートします。この期間の間に子孫パルボウイルス粒子は、パルボウイルスプラスミドから形成される。 </li></ol> 1.3ウイルスの収穫<ol><li>組織培養フードには、それらの培地内で細胞をこすり、15にプレートから懸濁液を吸引し、転送mlのプラスチックチューブ。 </li><li>室温で5分間250×gでチューブを遠心します。 </li><li>上清の95％を削除します。 </li><li>ボルテックスチューブは穏やかに残りの上清（約0.5 ml）にペレットを再懸濁します。 </li><li> -80チューブを凍結℃にこの段階では生産を停止するか、またはプロトコルを続行することが可能です。 </li><li>懸濁液を解凍し、室温でそれを持って来る。 </li><li> 37℃温水で液体窒素浴融解℃で懸濁液を凍結ボルテックス15秒精力的にチューブとさらに2回の凍結融解サイクルを繰り返します。 </li><li> 4℃で15分間16,000 xgでチューブを遠心℃、 </li><li>新しいチューブに上清を収集します。この段階では、チューブは、粗製ウイルス抽出の準備を含んでいます。 </li><li>ウイルス滴定（下記参照）に進みます。 GFP遺伝子を運ぶrecPVについては、典型的な生産量は約1に対応する1から3×10 7のウイルス感染単位を与えるべきである-3×10 10ウイルスゲノムは、粒子を含有する。 </li></ol> 1.4ウイルスストレージ<ol><li>長期保存のために-80℃で原油ウイルス抽出物を含有するチューブを凍結℃にプロトコルの第二部に接種として粗ウイルスの抽出物を使用することが可能です。 </li></ol> 2。感染経由recPVsの生産感染症を介してrecPVの生産を開始する前に、標準プロトコル8に従ってパルボウイルスVP遺伝子（AD-VPヘルパー、5で説明）を運ぶアデノウイルス5を生産し、精製する。それはまた、興味のある遺伝子（ 例えば 、上述したようにトランスフェクションを介して生成）を運ぶrecPVsの最小量を持っていることが必要である。 以下では、175cm 2のフラスコ（T175）形式でrecPV生産を説明します。この方法で産生されたウイルス株のさらに増幅は10多層CellSTACK培養室（コーニング）で行うことができる提案プロトコルのマイナー調整を加えたものである。 2.1感染症<ol><li>感染症の日に60から80パーセントの細胞密集度を得るためのT175フラスコ内の感染症、プレート千万NB324K細胞の前に1日。コントロール（非感染細胞）と同じ数のセルを含む第2のフラスコを準備します。各T175は5％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、ML Penicilin当たり100U、100μg/ mlのストレプトマイシンを補充し、最終容量として最小必須培地（MEM）20 mlを持っている必要があります。 </li><li>翌朝は、以下から構成される2 mlのプラスチックチューブでウイルス混合物を準備します。 <ol class="lalpha"><li>感染多重度（MOI、感染単位/細胞）で広告-VP-ヘルパー5 = 10（1×10 8感染単位に相当する）。 </li><li> MOI = 0.5（5×10 6感染単位に相当）でrecPVs。 MEMで1.5ミリリットルに完了します。 </li></ol></li><li> T175フラスコのいずれかで、全体のウ​​イルスの混合物を適用します。 </li><li>インキュベート37℃で2時間フラスコ°C、92％湿度、5％CO 2静かに15分毎に揺れ。 </li><li> 37℃でさらに20〜24時間インキュベート°C、92％湿度、5％CO 2。 </li><li>新鮮な培地で文化的な培地を交換してください。 </li></ol> 2.2ウイルス産生 48時間92％湿度、5％CO 2で37℃でフラスコをインキュベートします。効率的なウイルス産生の指標として、細胞毒性の明確な兆候は36から48時間後に感染を開始し、ウイルス感染細胞を含むフラスコに観察する必要があります。 2.3ウイルスの収穫<ol><li>組織培養フード内で、50 mlの遠心チューブにフラスコから培地上清を吸引し、転送します。 </li><li> 1.5ミリリットルをPBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li> 0.25パーセントTrysin-EDTA 1.5 mlで細胞をトリプシン処理。除去培地に細胞懸濁液を追加します。 </li><li>部屋の温度で5分間5000×gで細胞と上清を遠心分離ature。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li>細胞ペレットを、ゆっくりとボルテックス細胞を再懸濁するためのチューブにTE緩衝液1ml（1 mMのトリス-HCl、0.1mMのEDTA、pHは8.7）を追加します。 </li><li> 37℃温水で液体窒素浴融解℃で細胞懸濁液を凍結15秒間激しくボルテックスチューブと凍結融解サイクルを3回繰り返します。 </li><li>細胞ゲノムと非パッケージ化ウイルスDNAを消化するために、37℃で30分間50 U / mlのベンゾナーゼヌクレアーゼ°Cで細胞懸濁液を扱います。 </li><li> 4℃で20分間5000×gでチューブを遠心℃、 </li><li>新しいチューブに上清を収集します。この段階で上澄み液は、粗製ウイルス抽出の準備を含んでいます。このプロトコルは、次の生産recPV-GFPの典型的な収量は1〜10×10 8ウイルス感染単位の範囲でなければなりません。 </li></ol> 2.4ウイルスストレージ<ol><li> 4℃で短期間保存用（最大2ヶ月）、ストアウイルス</li><li> LONのためにグラム長期保存（2ヶ月以上）、-80ストアウイルス℃、 </li></ol> 3。 RecPV精製<ol><li>粗ライセートからrecPVsの精製の ​​ために、我々はZolotukhin らによるとイオジキサノール不連続勾配を実行することをお勧めします。9。我々は効率的なウイルス精製用原油のウイルスエキス（5 T175フラスコでの生産から得られる）を5mlの最小値を使用することをお勧めします。 </li></ol> 4。組換えパルボウイルス滴定<ol><li>エルAndaloussi らに記載されrecPV滴定を行います。5 </li></ol> 5。品質コントロール<ol><li>エルAndaloussi らに記述されたプロトコルを使用しています。5 NB324Kインジケーター細胞にパルボウイルスのプラークアッセイを実施する望ましくない複製コンピテントウイルス（RCV）の存在を確認する。 </li></ol> 6。代表的な結果 recPVs productioの例nはアデノウイルスゲノムの要素の存在下または非存在下でトランスフェクションを介して図3に示します。細胞はPHH-1-GFP（recPVは、GFP遺伝子を有する）、またはPHH-1-ルシフェラーゼ（recPVは、 ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有する）と一緒のpCMV / VP（VPパルボウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を運ぶプラスミド）をトランスフェクトした、と（+ pXX6）の有無にかかわらず（-pXX6）プラスミドpXX6（アデノウイルスE2A、E4（ORF6）とVA RNA遺伝子を運ぶ）。粗細胞抽出物の等量エルAndaloussi らに報告されている細胞とGFP形質導入またはルシフェラーゼアッセイを行った。5 NB324Kに適用されました。 recPVs生産の明確な増加は、提案手法（ 図3A、B）後に得られる約5 TU /セルに、従来のプロトコルに従って生産が0.3 GFP达ユニット（TU）/セルから増加に伴ってpXX6の存在下で得られた。 recPV productiの大幅な増加（24倍程度）上でも、PHH-1-ルシフェラーゼ（ 図3C）の場合に観察された。これらの結果は、pXX6に含まれる遺伝物質は、パルボウイルスの産生を高めることができることを示しています。 感染経由recPVs生産の代表例を図4に示します。 NB324K細胞は、様々なrecPVs（図に示される）およびAd-VP-ヘルパー（PV VPキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を保有する）と共感染させた。アップシードセルあたり&gt; 70 TU（ 図4A）するには、Ad-VPヘルパーさらに強化recPV生産望ましくない複製コンピテントウイルス粒子（ 図4B）の発生を増加させずに。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。自律的なパルボウイルスに基づくベクター。 （A）トップ：導入遺伝子は、VP-コードする遺伝子の一部を置き換え、ウイルスプロモーターP38の制御下にある。 NS1 / 2の遺伝子が再されている慣らしとその発現は、ウイルスプロモーターP4によって制御されます。ベクターゲノムは複製と組換えゲノムのパッケージングに必要なシス作用性要素が含まれているパルボウイルスITRは、に挟まれています。底部：プラスミド（ 例えば 、CMV）のいずれか異種、または自家（ 例えば、P38）プロモーター（PX）の下にVP-遺伝子を担持する構造遺伝子の破壊を補償するために、組換えパルボウイルスの生産時にトランスに供給されている組換えゲノムインチITR、逆方向末端反復。図4から適応。recPVsの製造に使用される古典的なプロトコルの（B）の模式図。 HEK293T細胞は一過性ウイルスDNA（ベクターとヘルパープラスミド）をトランスフェクトされ、三日後、細胞を採取し、ウイルスが収穫されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2。とrecPVsの生産広告-VPのに役立ちます。 recPVおよびAd-VPゲノムの（A）の回路図にマップされます。 recPVはVP領域の一部を置き換え、異種遺伝子を含んでいます。広告-VPは、パルボウイルスVP遺伝子を抱いている。本稿で説明されたプロトコルの（B）の回路図ビューでは、。 NB324K細胞はrecPVおよびAd-VPウイルスと共感染している。三日後に細胞を回収しており、recPV粒子が細胞溶解物から回収した。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。アデノウイルスベースのプラスミドpXX6によってrecPV生産の刺激 。 10cmディッシュに播種したHEK293T細胞は、recPVsを生成するためにPHH-1-GFP（AおよびB）またはPHH-1-ルシフェラーゼ（C）との組み合わせでのpCMV / VPでトランスフェクトした。同時に、細胞が示すように、アデノウイルス由来のヘルパープラスミドpXX6かどうか、と共トランスフェクトした。三日間、トランスフェクション後、細胞を3回の凍結融解サイクルにより回収し、溶解した。クラッドの等量eのウイルス抽出物をインジケータセルをNBKに適用され、伝達アッセイを行った。（）コンフルエントNB324K単層内でGFP陽性細胞を示す代表的な顕微鏡写真を示す。（B）GFPトランスダクションアッセイの定量は、シードのセルごとに伝達ユニット（TU）で表される（C）ルシフェラーゼ活性の定量化は、相対ルシフェラーゼ単位（RLU）で表されます。エルAndaloussi らで説明したようにルシフェラーゼアッセイを行った。5。列は、3からの平均値が標準偏差バーを複製する表しています。 + pXX6列の先頭の数は、（A、BおよびC）では、pXX6の対せず存在下で得られたrecPVウイルス価の倍の増加を、示しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。組換え広告-VPヘルパーウイルスによるrecPV生産の刺激。 （A）NB324K細胞は、感染したその後、MOI 10で精製した広告-VPヘルパーウイルス（AD-Xユニット/細胞、アデノ-X迅速タイターキットを用いて滴定）とテッド、次の組換えパルボウイルスカイ-HH-1-EGFP 11（0.1のどちらかとsuperinfected TU /セル）またはH-1-GFP（0.5 TU /セル）5。一日感染後、培地を変更しました2日後、細胞を採取し、3回の凍結と融解を介して溶解した。粗細胞抽出物は、エル·Andaloussi らによると伝達アッセイによりウイルス力価を決定するために使用された5。 TU、伝達ユニットは、（B）AD-VPの不在の存在下で産生さウイルスバッチはNB324Kインジケーター細胞上のプラークアッセイにより複製コンピテントウイルス粒子（RCV）の、その内容について分析した。

<ol><li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus.+Res%22%5BJournal%5D)">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).</li>
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<li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851(2003).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

我々はrecPV生産はアデノウイルスゲノムの要素の存在によって増強することができることを示している。私達はでrecPVとの組み合わせでトランスフェクションを介してアデノウイルスゲノムの要素を提供することによって、およびAd-VP-ヘルパーと100以上の倍の共感染細胞による10以上の倍（0.3から5 TU /セルから）でrecPV収率を増加している従来のプロトコルとの比較。ここで説明するプロトコルは、アデノウイルスゲノムの要素と感染症に使用される広告-VPヘルパーの最適濃度の配信のために最も適切なタイミングを決定することにより、さらに最適化することができます。 大規模遺伝子（1,600以上の拠点）とRecPVsが少なく効率的に生産されています。これはおそらく、導入遺伝子を挿入することにより、PV、適切なウイルスDNAのパッケージングに必要なシス作用性要素が削除された事実によるものである。その生産に影響を与えることなく、PVのゲノムに挿入することができ、導入遺伝子の最適なサイズは、700拠点までですの6。また、挿入遺伝子の並べ替えはrecPV生産（ 例えば...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>シグマ</td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td>シグマ</td><td> M4655 </td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td>トランスフェクション</td><td>ロシュ社</td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300062 </td></tr><tr><td>ベンゾナーゼヌクレアーゼ</td><td>シグマ</td><td>操作するもの</td></tr><tr><td>アデノ-X迅速タイターキット</td><td>クロンテック</td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

例えばラットH-1PVとMVMなどの齧歯類パルボウイルスは、（PV）、小さな正二十面体、一本鎖のDNAウイルスである。それらのゲノムは、それぞれ1非構造（NS1とNS2）とカプシド蛋白（VP1およびVP2）の発現を調節する2つのプロモーターP4とP38が含まれています。人間の2の非病原性でありながら、彼らは腫瘍溶解性とoncosuppressive能力のための抗癌剤として高い関心を集めている。 NS1は、ウイルスの細胞毒性3の主要なエフェクターである。さらに彼らの自然な抗腫瘍活性を高めるために、これらのベクトルからの誘導体は、治療遺伝子（ 例えば、細胞毒性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍抑制遺伝子等）4とキャプシド蛋白質をコードする遺伝子を置換することによって生成されました。組換えパルボウイルス（recPVs）ベクターはウイルスDNAの増幅およびパッケージングするために必要なNS1 / 2コード配列とPVゲノムのテロメアを維持します。の生産recPVsはVPタンパク質（ 図1）4をコードする遺伝子を発現する第二のベクター（のpCMV-VP）で細胞を共トランスフェクトすることにより、プロデューサー細胞（一般にHEK293T）でのみ発生します。この方法で生成されたrecPVベクターは、複製欠損である。 recPVsは、それらが生成された元の親ウイルスに対する強化されたoncotoxic活性を有することがわかっていますが、それらの生産が主要な課題であると強く抗がん剤の臨床応用におけるこれらの薬剤の使用を妨げます。 我々は、使用中の他のプロトコルと比較してより10倍recPVsの生産を向上させたHEK293TにE2A、E4（ORF6）とVA RNA遺伝子（ 例えば pXX6プラスミド）を含むAD-5由来ベクターの導入は見つかりました。この知見に基づいて、我々はrecPVs生産などparvovirを強化するために必要なゲノムのアデノウイルスの要素を含む小説広告-VP-ヘルパーを構築した私達VP遺伝子ユニット5。広告-VP-ヘルパーの使用は、可能な限り（ 例えば NB324K）トランスフェクションが困難な細胞株を利用して、ウイルス感染の手順（のようなプラスミドトランスフェクションとは対照的に）に完全に依存するプロトコルを使用して、REC-PVの生産を可能にする（ 図2）。我々は非常に最終製品の5の品質に影響を与えることなく、生産時間とコストの両方を削減し、産生された組換えウイルスの量を向上させる手法を提案する。さらに、recPVの大規模生産は（浮遊細胞とバイオリアクター）で現在考えられる。

ここでは、使用中の他のプロトコルに比べて100倍以上の組換えパルボウイルスの生産効率を向上させる細胞の感染に基づいて、プロトコルを記述します。このプロトコルは、パルボウイルスのVP転写ユニット（AD-VP）を含む新規のアデノウイルス5ベースのヘルパーの使用に依存しています。

ラットH-1PVやMVMなどの齧歯類パルボウイルス（PV）は、小型の正二十面体構造を持つ一本鎖DNAウイルスである。そのゲノムには、2つのプロモーターP4およびP38が含まれている...

本手順の全体的な目的は、品質を維持しながら製造時間とコストを削減し、高タイターの組換えパルボウイルス（rec PVs）を産生することである。これは、まずrec PVプラスミドとアデノウイルス5型由来のベクターをHEK 293T細胞にトランスフェクションし、初期のrec PVウイルスストックを作製することで達成される。HEK 293T細胞にアデノウイルスのゲノム要素を導入することで、rec PVsの産生量は10倍以上に増加するためである。既存のプロトコルと比較して、組換えパルボウイルス産生を増強するために必要なアデノウイルスゲノム要素と、パルボウイルスVP遺伝子ユニットの両方を含む新しいAD VPヘルパーが作製されました。次のステップは、標準的なプロトコルに従って、この新しいADD VPヘルパーを産生し、精製することです。本手順の最終ステップは、NB three 20 4K細胞にrec PVとAD ADPウイルスを共感染させ、rec PVSを増幅させることです。この戦略により、rec PVの産生効率は100倍以上に向上します。この方法は、トランスフェクションによって少量のrec PVSが産生された後にのみ排他的に使用可能です。最終的に、産生されたウイルスストックのタイター測定には、定量リアルタイムPCRまたは形質導入アッセイが用いられます。さらに、製造工程中に意図しない複製能を持つウイルスが生成されていないことを確認するために、プラークアッセイを実施します。プラスミドを用いた従来の組み換えパルボウイルス製造法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、アデノウイルスVPヘルパーを用いて組み換えパルボウイルスの初期ストックを一度作製すれば、その後の製造は完全にウイルス感染に依存することです。これにより、パルボウイルスの優れた産生細胞であるが、トランスフェクションが困難なNBK細胞を利用することが可能になります。このようにして、組換えウイルスの増幅が可能となり、ウイルスが持つ一般的な感染力を100倍以上に高めることで、製造時間とコストを削減できます。本手順の実演は、この新しいプロトコルを共同で開発したウイルス製造ユニットの責任者であるBarbara Loicが行います。このビデオがお役に立ち、皆様の実験が成功することを願っております。トランスフェクションによる組換えパルボウイルス（rec PV）の作製は、その後の感染によるrec PVS作製において、接種源として使用する最小限のrec PVSを生産するために必要です。トランスフェクションの1日前には、rec PVSの作製にバイオセーフティレベル2の実験室が必要となります。10 cmプレートに200万個のHEC 293T細胞を播種し、細胞コンフルエンスが50%になるようにします。トランスフェクション当日に向けて、10% FBS、L-グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイジンを添加した10 mLのDMEM中で細胞を培養し、37°C、5% CO₂、92%湿度の条件下で一晩インキュベートします。トランスフェクション当日に、1.5 mLチューブを用いてウイルス作製混合液を調製します。目的のトランスジェンを組み込んだrec PVベクター3 µgを、1:2:1のモル比で以下の試薬と共に添加します。パルボウイルスキャプシド遺伝子ユニットを組み込んだベクターP-C-M-V-V-Pを6 µgと、アデノウイルス由来ヘルパープラスミドを8 µg用意する。プラスミド混合液を無血清培地で850 µLまで希釈し、最終濃度を20 ng/µLにする。次に、FU gene HDトランスフェクション試薬を、試薬とDNAの比率が2.5:1となるように42.5 µL添加する。FU遺伝子試薬がチューブの壁面に触れないように注意し、5〜10秒間緩やかにボルテックスした後、トランスフェクション混合物を室温で30分間インキュベートします。トランスフェクション混合物を細胞に滴下して加えます。プレートを緩やかに揺すり、混合物を均一に分散させてください。プレートを37°C、5% 二酸化炭素、92% 湿度の条件下で72時間インキュベートします。この期間に、パルボウイルスプラスミドから子孫パルボウイルス粒子が形成され、ウイルスを回収できるようになります。まず、培地とともに細胞をスクレイパーで回収し、その後、プレートから懸濁液を吸引して15 mLプラスチックチューブに移します。チューブを250 Gで5分間遠心分離します。室温にて、上清の95%を除去し、約0.5 millilitersを残します。チューブを軽くボルテックスしてペレットを残り上清に再懸濁させ、1.5 milliliterのエッペンドルフチューブに移します。懸濁液を液体窒素バスで凍結させ、その後37 °Cの温水で融解します。チューブを15秒間激しくボルテックスします。この凍結融解サイクルをさらに2回繰り返します。チューブを 4 °C、16,000 G で 15 分間遠心分離し、上清を新しいチューブに回収します。この段階の上清には粗ウイルス抽出液が含まれており、感染による rec PVS の生産のための接種源として使用できます。Power virus gain。Aレプリケーションは、増殖細胞で発現する細胞因子に依存しています。したがって、組換えパワーウイルスの作製に使用する細胞が最適な状態で、本プロトコルで示す適切な密度で播種されていることが重要です。感染の前日に、1,000万個のMB three 20 4K細胞をT 1 75フラスコに播種し、翌日に細胞コンフルエンシーが60〜80%になるようにします。コントロールとして、同数の細胞を含む2つ目のフラスコを用意します。感染当日の朝、各T 1 75フラスコの最終容量が20 millilitersのMEM（5% FBS、L-glutamine、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加）となるようにしてください。2 milliliterのプラスチックチューブにウイルス混合液を調製します。これらの試薬を加える。VPヘルパーを加える。MOI 0.5でrec PVSを感染多重度10で加え、MEMを1.5 millilitersまで加える。ウイルス混合液の全量をT 175フラスコ1本に添加します。37 °C、湿度92%、5% CO2の条件下で、15分ごとに緩やかに振盪しながら2時間インキュベートします。その後、さらに37 °C、湿度92%、5% CO2の条件下で20～24時間インキュベートします。20～24時間後、培養液を新鮮な培地と交換し、効率的なウイルス産生を促すため、同じ条件下で48時間インキュベートします。ウイルス感染細胞を含むフラスコでは、明らかな細胞毒性の兆候が観察されるはずです。感染後36～48時間から始まり、48時間後、フラスコから培地上清を吸引し、50 milliliterの遠心チューブに移します。細胞を1.5 mLのPBSで2回洗浄し、トリプシンで3〜5分間処理します。その後、細胞懸濁液を回収した培地に加え、室温で5,000 Gにて5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットに1 mLのTEバッファーを加えます。チューブを緩やかにボルテックスして細胞を再懸濁させてください。次に、細胞懸濁液を液体窒素バスで凍結し、37 °Cの温水で融解させます。チューブを15秒間激しくボルテックスします。凍結融解サイクルを3回繰り返します。次に、ゲノム細胞および非パッケージ化されたウイルスDNAを消化させるため、細胞懸濁液をBen Naseヌクレアーゼで37°Cで30分間処理します。30分後、チューブを5,000 Gで20分間、4°Cで遠心分離します。最後に、上清を新しいチューブに回収します。この段階の上清には、粗ウイルス抽出液が含まれています。本プロトコルに従って産生される組換えPV GFPの標準的な収量は、1～10 × 10⁸ viral infectious unitsの範囲内であるはずです。ここでは、アデノウイルスベースのプラスミドによる組換えPV産生の促進例を示します。GFP遺伝子を保持する、あるいは保持しないPHH one GFP erect PVを含む粗ウイルス抽出液です。アデノウイルスベースのPXXプラスミドをNBKインジケーター細胞に適用したところ、これらの顕微鏡写真で観察されるように、PXX sixの存在下でGFP陽性細胞が増加しました。GFP形質導入アッセイを実施したところ、Pxx sixの存在下でrec PVの産生が明らかに増加しました。産生量は、従来のプロトコルで得られた細胞あたり0.3 GFP形質導入ユニット（TU）から、本プロトコルで得られた細胞あたり約5 TUへと増加しました。GFP導入アッセイの結果は、PXX6に含まれるアデノウイルスE2a、E4、およびVA RNA遺伝子がパルボウイルスの産生を増強できることを示しています。次の図は、感染によるrec PV産生の代表的な例を示しています。NB 3204K細胞に精製したADPヘルパーウイルスを感染させ、次いで2種類の組換えパルボウイルスのいずれかを重複感染させました。粗細胞抽出物を用いてトランスダクションアッセイによりウイルス力価を測定したところ、AD VPヘルパーによってrec PVの産生がさらに促進され、細胞あたり70 T以上に達することが示されました。最後に、ADPの存在下または不在下で産生されたウイルスバッチについて、MB three 20 4Kインジケーター細胞を用いたプラークアッセイにより、複製能を有するウイルス粒子の含有量を分析しました。その結果、ADPヘルパーは、開発後の好ましくない複製能を有するウイルス粒子の発生を増加させることなく、rec PVの産生を促進することが示されました。この技術により、がんおよび遺伝子治療分野の研究者は、組換えウイルスベクターの製造をさらにスケールアップすることが可能になります。バイオリアクターを用いることで、臨床現場で必要とされる大量の変異体を製造できます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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水系でのウイルス産生率を予測

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アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産

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