Name: 用いて、化合物の生理活性をスクリーニングするためのペアNanoinjectionと電気生理学的アッセイキイロショウジョウバエジャイアントファイバシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶナノインジェクションと電気生理学的アッセイを用いて、Drosophila melanogasterのジャイアントファイバーシステムで神経調節化合物の生理活性をスクリーニングする方法。この技術は神経回路への化合物効果をリアルタイムで評価します。

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我々はコメントを、特定のアリーン米沢では、マリラボとGodenschwegeラボのメンバーを認識し、このプロトコルを支援したいと思います。この作品は、神経疾患のための国立研究所とFMとTAGのストローク助成R21NS06637によって賄われていた。ABは、国立科学財団賞を受賞番号082925、URMによって資金を供給された：将来の研究者のための統合生物学。

1。電気生理学リグのセットアップ<ol><li>電気生理学リグセットアップに必要な機器は、オーギュらによって詳細に記載されている。このジャーナル14インチ必要に応じて電気機器の詳細な説明については、この資料を参照してください。 </li><li>ナノインジェクタを保持する第六マイクロマニピュレータを追加することによって、前述した電気生理学リグのセット、最大14に変更します 。 図2に示すように、動物の頭に簡単にアクセスできるようにそれは2つの刺激電極のマニピュレーターとの間に配置する必要があります。 </li><li>実験を開始する前に、すべてのマニピュレーターを持つ全ての回転軸上の快適な範囲を持っていることを確認し、全ての電極と同様にインジェクションピペット（ステップ2を参照）動物に達することができる。 </li></ol> 2。 Nanoinjectionセットアップ<ol><li> nanoinjectionセットアップがNanoliter2000（世界Precisiが必要です。楽器、サラソタ、フロリダ州、米国）またはナノリットル量で制御された注射することができますインジェクタの類似したタイプ。 </li><li>電極プラーで80から100MΩの抵抗にそれらを引いて、インジェクター付属のガラスマイクロピペットを用いて注射針を準備します。 </li><li>滑らかな注射のためには、45度の角度（ 図3）で11から17μmの開口部にベベルにマイクロピペットを必要とされています。 </li><li>ゆっくりに気泡が存在しないことを確認し、Nanoliter2000マニュアルの指示に従ってハミルトンシリンジを用いて合成油を注入ピペットのバックフィル。 </li><li>慎重にナノインジェクタ上のマイクロピペットを確保し、Nanoliter2000マニュアルで指示された余分な油を空にして化合物をロードするための準備をします。 </li><li>マニピュレータにインジェクターを配置し、Nanoliter2000マニュアルで指示された化合物をロードします。マイクロピペットの先端がこの中に壊れないことを確認してください手順。 </li><li> Nanoliter2000マニュアルによって指示されるようにインジェクタのコントロールボックス内に注入されるナノリットルの所望量を設定します。注入された合計金額が100 NLを超えてはならないことに注意してください。我々は生理食塩水コントロールソリューションの大きな数量がGFS回路の機能に影響を与える可能性があることがわかった。 </li><li>ナノインジェクタの電源はバックグラウンドノイズ（ 図4）として表示され録音、妨げので、それは、インジェクタが注入自体の例外を除いて記録取得時にコントロールボックスから外れていることが重要です。それを再設定しますしかし、コントロールボックスの電源を切断しないでください。 </li></ol> （3） キイロショウジョウバエの準備<ol><li> CO 2、または前述の14,15として氷上に2から6日齢のハエを麻酔。 </li><li>かつて不動の、小さなプレートwiに動物を転送するためにピンセットを使用その足からそれを拾うことによって目の柔らかい歯のワックス。男性のミバエは、約1.0 mgの重さと女性のミバエは、1.2 mgの重さは約、したがって、化合物対体重比は男性対女性のハエで異なっていることに注意してください。したがって、それは実験のためにのみ性別を使用することをお勧めします。 </li><li>以前は14,15に記述されているように 、慎重にフライ背側をマウントし、胸部と頭部が体の周囲に配置ソフトデンタルワックスで固定していることを確認します。注意深く彼らは胸部（ 図2、C）に対して垂直に置くように翼を広げて。フライは、できるだけ少ないダメージなどでマウントする必要があります。 </li></ol> 4。ペアNanoinjection /電気生理学<ol><li>刺激電極に向かって、その頭を電気生理学的リグに取り付けられたフライを置きます。 </li><li>前述した14,15（Fとして対応する刺激、地面と記録電極と動物を突き立てるigure 2、C）。そうでなければ望まない限り、DLMとTTM筋肉に他に1記録電極を配置します。 DLM筋前部背中央毛、ハエの正中線との間の胸部に位置しています。 TTM筋肉はフライ7の後部と前部のスープラ·エイラーの毛の間に翼の添付ファイル、近くに位置しています。 </li><li>頭部の内側後部に位置するが（ 図2、C）はまだ注入しないでください3単眼の中心を有する化合物を含有する注射剤のマイクロピペットを合わせます。 </li><li>化合物の注入は、脳の刺激を介して巨大な光ファイバシステム（GFS、 図1）の経路をDLMにTTMとGFにGFのベースラインの記録を入手してください。前これを行うには、10の刺激の10列車（40〜50 mV）で電車14,15（ 図4）の間に1秒の遅延が100 Hzで0.03ミリ秒の持続時間のために与えられたそれぞれの持つ巨大な繊維（GFS）アクティブにします。野生型では、shを飛ぶウルドは、DLMとTTM経路の両方の刺激のこのレートで一対一に従うことができる。 TTM経路にDLMとGFにGFが1:1比で100 Hzの刺激に従わない場合、フライを破棄します。 </li><li> 1 Hzの（ 図4）での単一パルスでGFの連続的な刺激に切り替えます。 </li><li>迅速にコントロールボックスにインジェクタを差し込みます。バックグラウンドノイズが1 Hzの刺激の録音を妨害するにもかかわらず、それを中止しないでください。 </li><li>慎重にだけcuticule以下ハエの頭部カプセルに注入ピペットを挿入し、1 Hzの刺激（ 図4）を維持しながら、フライの体液中に化合物の所望の量を注入します。フライのオープン循環系のために、全体の神経系は、数秒以内に化合物にさらされる。特定の注射部位は、体液中に化合物を提供することが重要ではありませんが、我々は、ローカライズされている単眼の領域を見つける頭部カプセルの中で最も背側で内側のdは、化合物の迅速かつ均一な分布につながる簡単な注入を可能にする便利なサイトになる。 </li><li>注射後1分（ 図4）に1 HzのGFの刺激を続けながら、すぐに注射部位から注入ピペットを削除し、コントロールボックスからインジェクターを外してください。 </li><li> GFSに対する化合物のより微妙な効果を明らかにするために、列車の間に1秒の遅延では100 Hzで10刺激の10列車と巨大繊維（GFS）を強調する。最大15分（ 図4）にこのパラダイム5分ごとにGF経路の機能をテストし続けています。しかし、短い間隔またはより長い監視期間も可能です。 </li><li>化合物は、GFSの神経筋接合部（NMJs）で効果があり、おそらく化合物の影響を絞るかどうかをテストするためには、運動ニューロンを活性化する方向に進んでくださいTLY胸部刺激による。このためには、目から刺激電極を除去し、100 Hzで10刺激の10列車と運動ニューロンを刺激するために胸部の前方側にそれらを交換してください。 </li></ol> 注：ビデオに示すように、電気トレースは、純粋な色素注入の効果に対応していません。 5。代表的な結果ジャイアント·ファイバーシステムのシナプスをDLMにPSIに拮抗薬の効果 Methyllycaconitineクエン酸（MLA）はα7nAChRのサブタイプに特異的であるのnAChR拮抗薬である。 Dα7のnAChRサブタイプの遺伝子の除去はGF-TTM経路5,6に影響を与えませんしながらGF-DLM経路でシナプスをDLMnするPSIは、適切に機能するためのDα7のnAChRサブタイプに依存しています。我々のアッセイの特異性と感度を実証するために我々は、異なる濃度（0、0.02、0.04、0でMLAを注入した。生理食塩水治療のためにはn = 15）08、0.12 ngの/ mgで、46 nlは、動物の頭部（N = 10の化合物の治療ごとに）注入した。男性のみハエは（10E野生野生型の遺伝子型）を用いた、化合物の効果は注射後15分の合計をモニターした。 図5は、ベースラインの注入前に取得したレコーディングやMLAと生理食塩水制御ソリューションに対応して注入した後得られたものの違いを示しています。我々は、MLAのその注射がGF-TTM経路が影響を受けないままであっ脳内のGFSの刺激によって100 Hzで一対一に従うGF-DLM経路の無力をもたらしました。 （ 図5、トップとミドルのトレース、データはノンパラメトリック[テスト正常と分散が等しい]でない限り、生理食塩水コントロールの[0 / NG MG]と各時点でのMLAの異なる濃度との間で行われるt-検定、そうでなければ、使用マンホイットニー順位和検定* p &lt;0.001）であった。しかし、一対一のR運動ニューロンは、DLMとTTMのNMJ機能がMLAによって影響されないことを示している（ 図5、下のトレース）を直接刺激したときにDLMのesponseが観察された。 MLAは、それ以上の有意な変化は試験期間の次の15分の間には認められなかったとして、0.04、0.08、0.12 ngの/注入MLA mgのための注射後に最大の効果を1分に到達するために登場しました。強い応答が0.12 ngの/ mgの高用量で観察されなかったので、また、化合物は、0.08 ngの/ mgで最大の効果を達成しました。 <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。ジャイアント·ファイバー·システム（GFS）の巨大ファイバシステム図。ジャイアント繊維（GFS、赤で表示）シナプスと電気的（ギャップジャンクション）と同様に化学的に（コリン）周辺Synapsing介在ニューロンへ（PSI、緑で示されている）とTergo Trochanteral筋肉ニューロン（TTMn、黄色で示されている）5。 PS私はDLMn（青で示さ背縦走筋の神経細胞）の接続にDα7のnAChRサブタイプ6に依存しています。最後にジャンプ（TTM、紫で示されている）と飛翔筋へTTMnとDLMn（DLM、紫で示されている）の神経筋接合部（NMJ）はグルタミン酸作動性である。 注：PSI接続へのGFは、電気的および化学的でもあります。しかし、shakB変異体（ギャップ結合を欠いている）で、応答は電気的な接続がない場合の化学成分は、アクションの可能性を呼び起こすのに十分でないことを実証し、脳内のGFSの刺激にDLMから記録することができませんPSI 5,16-18。 PSI接続にGFがギャップジャンクション依存しているため、この数字は単純の理由により、シナプスにおける唯一のギャップジャンクションを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 マニピュレーターのらアップ。 <ol class="ualpha"><li>以前に発行されたプロトコル14の変更されたセットアップは、同時nanoinjectionsと組み合わせるGFSの録音のための注入マイクロマニピュレータに適合するために使用されます。マウントされたハエの準備は、実験者に向かってハエの頭部を持つ指向です。注射マニピュレーター（＃1）タングステン刺激電極（2＃、＃3）の2つのマニピュレータの間に、実験の前に置かれています。ガラスの記録電極（＃4、＃5）の2つのマニピュレーターは、それぞれ左側と右側に配置されます。タングステンの接地電極（＃6）のマニピュレータは、左側（ここに示されている）または右側のいずれか後ろに遠くに配置されます。 </li><li>各種電極と注入ピペットの準備の上からクローズアップビュー。 </li><li>正しくマウントD.ショウジョウバエは、電極と注射の準備注射マイクロピペットで刺し。動物の体のことに注意してください水平に胸部を搭載し、その翼は広げられている。ワックスがしっかりと動くから動物を防ぐため、その体の周りにラップされています。さらに、接地電極（＃6、腹部）、ガラスの記録電極（＃4、＃5、胸部で、暗いアウトラインでハイライト表示）し、刺激電極（＃2と＃3は、各目の1以前に14を説明したように）、代わりに突き刺されています。インジェクションピペット（＃1）が正しく3単眼（円内）の中央に揃えて配置されます。インジェクションピペットの挿入は、この領域に配置する必要があります。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。ベベルインジェクションピペット。適切に面取りマイクロピペットの図がここに示されています。電極の開口部は45度の角度で面取りと11から17μmの間に開口部を持っている必要があります。適切な面取りインジェクションピペットには、最小限のdとスムーズに注入するために重要ですフライにamage。 <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 nanoinjection /電気生理学プロトコルの全体的なスキーム。nanoinjection /電気生理学プロトコルの全体的なスキームの代表的な図を示します。 10刺激ごとに（1つだけの列車がここに示されている）の10列車と100 Hzの巨大繊維（GFS）を刺激することによって、ベースラインの記録を取得することによって開始します。注射の前に、1 Hzの刺激間隔2番目のいずれかを開始します。噴射時間（インジェクタがコントロールボックスに接続されている間）中に、重要なバックグラウンドノイズを観察しますが、録音を中止していません。注射（とインジェクタがコントロールボックスから外れている）の後、約1分間以上の1 Hzの刺激を続けます。最後に、最大15分5分ごとに100 Hzで10刺激の10列車とGFSを強調し、このパラダイムでGF経路の機能をテストするために継続して進みます。注：録音ワットEREは、全体的なスキームを作成するために操作して得られた特定の結果を表すものではありません。スケールではなく、すべてのトレースが表示されません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3597/3597fig4large.jpg">拡大するにはここをクリック</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。 GFSにおけるMLAの効果。 <ol class="ualpha"><li>異なる濃度でミバエ（0、0.02、0.04、0.08、0.12 ngの/ mgのGF-DLM経路上のα7nAChRの拮抗Methyllycaconitineクエン酸（MLA）の影響をグラフィカルにnの化合物の治療当たり= 10;生理食塩水治療のためにはn = 15）。注入後わずか1分、重要かつ即時の効果は、MLAの0.04 ngの/ mgで見られた。有意な効果は、GFSの100Hzの刺激で0.8ng/mgとMLAの0.12ng/mgが見られた。有意差は生理食塩水コントロールとMLAの0.02 ngの/ mgの間には認められなかった。さらに、iを変更しないnの効果は（15分）テスト期間中に1分後の注射後に認められた。 t-検定は、生理食塩水コントロール（0 / NG mg）と各時点でのMLAの異なる濃度との間で行われた。 SEM、* P &lt;0.001 - レベルは+ /を意味するとして報告されます。 </li><li> 100 Hzの刺激でDLM応答のサンプルトレース。上のトレースは、脳内のGFの刺激によりMLA注入する前に筋肉の応答を示しています。筋肉は、各刺激は100 Hzで一対一に対応することがあることに注意してください。中央のトレースは、MLA注入（0.12 ngの/ mg）をした後にDLMの応答を表示します。筋肉は100 Hzで各刺激に1対1で対応することができないことに注意してください。 （アスタリスク）。下のトレースは、胸郭の運動神経の直接刺激を受けて、同準備（0.12 ngの/ mg）のDLMの応答を示しています。 DLMは、胸部刺激と100 Hzで1対1で応答するため、脳の刺激と応答の失敗は、コリン作動性PSI-DLMn接続に起因することができます。 </li><li> GF-TTM経路上の別のMLAの濃度（0、0.02、0.04、0.08、0.12 ngの/ mg）を備えたエフェクトをグラフィカルに描写。有意な影響は、任意の時点で生理食塩水（0 / NG mg）および化合物の注入の間に見られなかった。 t-検定は、* P &lt;0.001、生理食塩水コントロール（0 / NG mg）と各時点でのMLAの異なる濃度との間で行われた。 </li><li> 100 Hzの刺激で、TTM応答のサンプルトレース。上のトレースは、脳内の刺激とGFの活性化時にMLA注入前の筋肉の反応を示しています。筋肉は100 Hzで、すべての刺激に応答することができることに注意してください。中央のトレースは、MLA注入（0.12 ngの/ mg）をした後DLMの応答を示しています。 TTM筋肉から脳内のGFの刺激に対する応答は、一対一のままになります。下のトレースは、胸郭の運動ニューロン（0.12 ngの/ mg）を100 Hzの刺激に同製剤のTTMの応答を示しています。 </li></ol>

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここに提示nanoinjection /電気生理学的アッセイは、ショウジョウバエの神経系の化合物の迅速なスクリーニングが可能になります。これは、よく特徴付けられた神経回路内での分子標的のさまざまな効果を引き出すために化合物の少量を必要とするin vivoでの技術の小説です。このメソッドは、未知の毒素から市販されている薬剤に応じて、異なる化合物の生物活性をテストするために使用することができます。 ここでは、ショウジョウバエの巨大ファイバシステム（GFS）（ 図5）に影響を与えたMLAを使用して、我々のアッセイの機能を実証した。我々はそれが選択的にTTM経路にGFをDLM経路にGFを破壊しませんことがわかった。 DLM経路にGFに欠陥が神経筋接合部（NMJ）の機能不全によるものではなかったが、それは敵対的な実効と一致していたことが明らかに胸の刺激を介して直接運動ニューロンを活性化PSI-DLMnシナプス（ 図1）に存在するDα7のnAChRサブタイプでのMLAのt。 TTMn接続にG...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>録音ガラス電極：ホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>世界の精密機器</td><td> 1B100F-4 </td><td> 1.0ミリメートルOD、0.58ミリメートルID </td></tr><tr><td>刺激</td><td>草·インスツルメンツ</td><td>モデルS48 </td><td></td></tr><tr><td>アンプ</td><td>インスツル株式会社の取得</td><td>モデル5A </td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェア：Digidata </td><td>モレキュラーデバイス</td><td>モデル1440A </td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェア：pCLAMP </td><td>モレキュラーデバイス</td><td>バージョン10 </td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡ワットi番目の光ファイバ顕微鏡リング照明</td><td> AmScope </td><td> SM-4T モデルHL250-AR </td><td></td></tr><tr><td>取り付けの範囲を解剖</td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td>カイトマニュアルマニピュレーター＆チルトベース</td><td>世界の精密機器</td><td>モデル＃M3301 カイト：モデル＃KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> キイロショウジョウバエの野生10Eの遺伝子型（野生型株） </td><td>ブルーミントンストックセンター</td><td> STOCK＃3892 </td><td></td></tr><tr><td>垂直ピペットプラー</td><td>デビッド·Kopfは楽器</td><td> 700Cモデル</td><td></td></tr><tr><td>注入のガラスマイクロピペット：ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>世界の精密機器</td><td>カタログ＃4878 </tD&gt; <td> 1.14ミリメートルOD、0.5ミリメートルID </td></tr><tr><td>シリコン油</td><td>フィッシャー</td><td>カタログ＃S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Beveler </td><td>サッター計器（株） </td><td> KTブラウンタイプ モデル番号BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td>世界の精密機器</td><td>カタログ＃B203XVY </td><td></td></tr><tr><td>青い食品着色料</td><td>マコーミック</td><td> N / A </td><td>成分：水、プロピレングリコール、FD＆Cブルー1、および0.1％プロピルパラベン（防腐剤）。 </td></tr><tr><td> Methyllycaconitineクエン酸（MLA） </td><td>バイオTocris </td><td>カタログ＃1029 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチックワックススティック</td><td> 衛生的·コーポレーション （アクロンアメリカオハイオ州） </td><td></td><td></td></tr></tboDY&gt; </table>

用いて、化合物の生理活性をスクリーニングするためのペアnanoinjectionと電気生理学的アッセイキイロショウジョウバエジャイアントファイバシステム

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

in vivo活性のスクリーニング化合物は薬理学的作用物質1,2に開発することができる候補者を識別するための最初のステップとして使用することができます。我々は、仲介キイロショウジョウバエ 3,4のエスケープ応答を神経回路の機能に対する化合物の生理活性調節作用の検出を可能にする新たなnanoinjection /電気アッセイを開発しました。私たちの（GFS、 図1）ショウジョウバエの巨大な光ファイバシステムを使用してin vivoでのアッセイでは、このような小分子またはペプチドなどの化合物、さまざまな種類のスクリーニングを可能にし、最小限の量が効果を引き出すために必要になります。さらに、ショウジョウバエGFSは、ニューロンや筋肉の潜在的な標的分子の多種多様を提供しています。ジャイアント繊維（GFS）周辺Synapsing介在ニューロン（PSI）とTergo Trochanteral筋ニューロン（TTMn 5）上に化学的に電気シナプス（ギャップジャンクション）と同様に（コリン） </&gt; supの。 DLMn（背縦走筋ニューロン）接続へPSIはDα7ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChRs）6に依存しています。最後に、ジャンプ（TTM）と飛翔筋（DLM）のTTMnとDLMnの神経筋接合部（NMJ）は7月12日グルタミン酸作動性である。ここでは、巨大な光ファイバシステム13とどのようにこの回路の機能に対する化合物の影響を監視するための電気生理学的な細胞内記録を得ながら、化合物のナノリットル量を注入する方法を示しています。我々は、接続をDLMnするPSIはなく、接続やジャンプや飛翔筋におけるNMJの機能をTTMnするGFを乱すmethyllycaconitineクエン酸（MLA）、のnAChR拮抗薬とのアッセイの特異性を示しています。 このビデオを開始する前に、それはあなたが注意深く見るとD.メランの巨大ファイバ経路からの&quot;電気生理学的記録と題しJoveの映像に慣れていることが重要ですオーギュら 7からogaster &quot;、ビデオはここで提示されるように、この既存の技術の拡張として意図されています。ここでは、唯一のペアnanoinjectionsとモニタリング技術のほかに詳細に電気生理学的記録法とフォーカスを使用しています。

急速な<emin vivoでの&gt;</em&gt;検定の巨大ファイバシステム（GFS）を使用して、神経調節化合物をテストするための<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;記載されています。 GFSの電気生理学的記録と一緒に動物の頭の中でNanoinjectionsは、ニューロンや筋肉に対する化合物の生物活性を明らかにすることができます。

用いて、化合物の生理活性をスクリーニングするためのペアNanoinjectionと電気生理学的アッセイキイロショウジョウバエジャイアントファイバシステム

in vivo活性の化合物スクリーニングは、薬理剤として開発される可能性のある候補物質を特定するための第一段階として利用できます1,2。私たちは...

このビデオでは、巨大繊維系から電気生理学的記録を行いながら、化合物をリットル単位で注入する方法と、この回路の機能に対する化合物の影響をモニタリングする方法を説明します。このビデオを視聴する前に、Augustine Et al. による「Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of the Melanogaster」という JoVE ビデオを注意深く視聴し、内容に習熟しておくことが極めて重要です。本ビデオは既存の手法を拡張することを目的としているため、電気生理学リグのセットアップに必要な装置については、Augustine Al. のビデオで詳細に説明されています。本ビデオでは、 previously described electrophysiology rig setup に、アゴニスト注入器を保持する6番目のマイクロマニピュレーターを追加して変更します。動物の頭部へ容易にアクセスするため、2台の刺激電極マイクロマニピュレーターの間に動物を配置します。ナノインジェクションのセットアップには、Nanoliter 2000または同種のインジェクターが必要です。インジェクターに付属のガラスマイクロピペットを用い、電極プラーで抵抗値が80から100 MΩになるまで引き伸ばして注入針を作製します。スムーズに注入を行うため、マイクロピペットの先端を45度の角度で、開口径が11から17 µmになるように面取りする必要があります。Nanoliter 2000のマニュアルに従い、ハミルトンシリンジを用いて注入用マイクロピペットに合成オイルをゆっくりとバックフィルし、気泡が入っていないことを確認します。マイクロピペットをナノインジェクターに慎重に固定し、Nanoliter 2000マニュアルのロード手順に従って余分なオイルを排出して、化合物を充填する準備をします。Nanoliter 2000マニュアルの指示に従い、化合物を充填します。この操作中にマイクロピペットのチップが折れないように注意してください。NANOLITER 2000のマニュアルの指示に従い、注入したいナノリットル量をインジェクターのコントロールボックスに設定します。なお、総注入量は100 nanolitersを超えないようにしてください。2つの刺激電極マイクロマニピュレーターの間に、Nanoliter 2000をマイクロマニピュレーターに設置します。記録の取得中は、注入操作そのものを除く限り、コントロールボックスからインジェクターを外してください。ただし、コントロールボックスへの電源供給は切らないでください。電源を切ると設定がリセットされます。既述の方法に従い、CO2または氷を用いて、羽化後2〜6日のハエを麻酔します。個体が移動可能になったら、前述の方法に従って脚を持ち上げ、ピンセットを用いて個体をソフトデンタルワックスを塗布した小型プレートに移します。ハエを背面が上になるように慎重に固定し、体の周囲にソフトデンタルワックスを配置して、胸部と頭部が動かないようにしてください。翅が胸部に対して垂直に広がるように、注意深く展開させます。固定したハエを電気生理学リグに置き、頭部を刺激電極側に向けて配置し、対応する刺激電極、接地電極、および記録電極で動物を刺入します。既述の通り、DLM筋はハエの胸部の前方背側中央毛と正中線の間に位置しています。TTM筋はハエの翼付着部付近の後方および前方内側、ならびに内側上翼毛の間に位置しています。化合物を充填した注入用マイクロピペットを、頭部内側後方に位置する3つのosliの中心に合わせますが、まだ注入は行わないでください。化合物を注入する前に、100 hertzで10刺激を10トレイン分与えて巨大繊維を活性化させ、脳刺激を介して巨大繊維系からTTMおよびDLMへの経路のベースライン記録を取得します。列車間に1秒の間隔を設けます。野生型のハエであれば、DLM経路とTTM経路の両方において、この刺激速度で1対1の追従ができるはずです。その後、ハエを廃棄します。巨大繊維からDLMへの経路および巨大繊維からTTMへの経路が、100 Hzの刺激に対して1対1の比率で追従しない場合は、巨大繊維への刺激を1 Hzの単発パルスによる連続刺激に切り替えてください。バックグラウンドノイズが1 Hzの刺激記録を妨害しますが、速やかにインジェクターをコントロールボックスに接続してください。注意深く、そのままの状態を維持してください。注入用マイクロピペットを、ハエの頭部カプセルの表皮のすぐ下に刺入します。1 Hzの刺激を維持しながら、目的量の化合物を注入してください。注入直後、注入用マイクロピペットをセットから取り外し、注入から1分後まで1 Hzの巨大繊維刺激を継続しながら、インジェクターをコントロールボックスから外します。化合物が巨大繊維系に及ぼすよりわずかな影響を明らかにするために、100 Hzの刺激を10回1セットとし、セット間に1秒の間隔を設けて10セットの刺激を与え、巨大繊維にストレスをかけます。このパラダイムを用いて、15分後まで5分ごとに巨大繊維経路の機能をテストし続けます。ここに示す例では、化合物注入後も巨大繊維からTTMへの経路は影響を受けませんでしたが、巨大繊維からDLMへの経路は影響を受けました。化合物の影響が巨大繊維系の神経筋接合部にあるかを確認し、化合物の影響範囲を絞り込むために、胸部刺激によって運動ニューロンを直接活性化させます。刺激電極を眼から外し、胸部の前側に配置して、100 hertzで10回の刺激を10トレイン分、運動ニューロンに与えます。この例では、脳経由で刺激を与えた場合、DLM経路は確実に追随しません。しかし、胸部刺激に対し100 HzでDLM神経筋接合部の反応が1対1で得られたことから、注入した化合物の標的として神経筋接合部が除外されます。これにより、化合物の標的は巨大繊維からPSIへの接続、またはPSIからDLM運動ニューロンへの接続に絞り込まれます。

paired-nanoinjection-electrophysiology-assay-to-screen-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。...

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

使用して、高頻度電気刺激、発作のような活動がで誘導することができる...

のてんかんの変異体における発作のためのアッセイをNeurocircuitショウジョウバエ</em

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

ジャイアントファイバシステムでは、成人の単純な神経回路です。...

の巨大線維経路からの電気生理学的記録 D.キイロ</em

このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。...

中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

このプロトコルは、コスト効率的かつ便利な神経蛋白質の遺伝の突然変異の薬理学的エージェントのテストを有効にするショウジョウバエ中枢神経系の降下の電気的活動を記録する方法をについて説明しますや未踏の生理学的経路の役割。...

第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。...

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

本プロトコルは、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して手作りのアリーナでのハエの動きを追跡および分析することにより、ショ ウジョウバエ...

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

このプロトコルは、従来の哺乳類モデルに代わるものとして、自発運動機能障害の定量化を通じてショウジョウバエの神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。これは、高感度で再現性があり、倫理的に有利なモデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目的としています。...

神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

学ぶナノインジェクションと電気生理学的アッセイを用いて、Drosophila melanogasterのジャイアントファイバーシステムで神経調節化合物の生理活性をスクリーニングする方法。この技術は神経回路への化合物効果をリアルタイムで評価します。

用いて、化合物の生理活性をスクリーニングするためのペアNanoinjectionと電気生理学的アッセイキイロショウジョウバエジャイアントファイバシステム

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