Name: バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 学ぶ高分子マイクロアレイ作成法。オンチップ光重合技術を用いてバイオマテリアルをハイスループットで検出し、細菌付着抵抗性や幹細胞培養材料を効率的にスクリーニングする方法を解説します。

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</ol>

我々は、開示することは何もない。

ポリマーマイクロアレイは、正常な生物学的アッセイにおける新規ポリマーのスクリーニング百人の新しい材料の発見のために使用され、その後に有用なデバイスにスケールアップすることができます &#39;ヒット&#39;材料を特定されています。この場合には、記載の表面特性は、生物学的アッセイに後続を用いることができるともっぱら &#39;ヒット&#39;の材料に、より詳細にこれらの材料を研究する。 HTSCはこのアプローチを採用した実験家に利用できない場合、この戦略には興味があるかもしれません。ただし、完全に生体材料の相互作用に先立って、その後、一般的な構造と機能の動向を観察するために使用することができますHTSC​​方法論を用いて、生物学的アッセイに分析されるべきである材料の何百もの配列全体を勉強するポリマーマイクロアレイを利用する。 コンタクトプリント、ピンホルダー内で自由に上下にスライドさせて金属製のピンに依存しています。ピンとピンホルダー清潔最優先は、pを確保されているrintingが正常に行われ、厳格に行われるべきである。印刷がピンホルダー内ピンの適切な運動を実行開始前に存在するNOモノマーと、予行演習を行うことによってテストすることができます。ピンの動きが再現可能に達成されるまで、洗浄工程は継続すべきである。 かなりの思考は、モノマー混合物の設計に行く必要があります。容易に重合体のコンビナトリアルライブラリーを作製するためには、共重合体の数百の異なる比率で少数のモノマーを混合することにより形成される。これはスライドガラスの構造に適している24×24アレイを形成すると、通常、我々は576のメンバーのライブラリーを作製する。最も簡単な方法は、2:1の比率でペアワイズ24モノマーを混合することで、ほとんどの組み合わせ空間を探索コンビナトリアルライブラリーを生成するために。代わりに、アレイ内の組成勾配を含めることは、最適なモノマー組成物は、dにすることができ動向の観測を可能にするために有用であるetermined。この一例として22のモノマーは、順次6第2成分の1で希釈し、共単量体混合物の最初のコンポーネントとして使用することができます。 5希釈液を使用する場合は、例えば90:10、75:25、50:50、25:75と10:90の比率で第一及び第二の成分を混合し、これは488ユニークな共重合体ソリューションをもたらすでしょう。 576に合計を表示させるには、しばしば重要な基準試料で導入することができ、使用するモノマーのホモポリマーの複製。 576モノマー溶液は2 384ウェルプレートに分注しなければならない。ロボットをプログラミングするためにそれはモノマーの位置の観点から2つの同一のプレートを持っている方が簡単で、このようにして、モノマー溶液は、二つのプレートの間で均等に分割されるべきである。 かなりの時間がマルチチャンネルピペットを使用してソース·プレートの準備のために保存することができ、ソースプレートのデザインはマルチチャンネルピペットの使用を活用するために決定されるべきである。&lt;/ P&gt; 配列の自動化された高温超電導体を達成するために、スポットの位置が正常に特性評価装置を用いて整列する必要があります。一般的にアクリルアレイのピッチは500〜1000程度であり、ポリマーのスポット径は300μmである。ほとんどのXYステージが10μm以下の分解能を持って、このように正確な寸法は、サンプルの位置決めソフトウェアへの入力が完了したら確実に配列位置にアクセスするための表面特性評価装置のための十分な耐性があります。自動位置決めに制限は実際には配列の正確な印刷です。正確な印刷を確実にするためには、適切なスライド寸法（米国およびEUの標準のスライドサイズの両方が存在することに注意してください）​​と一緒に真空吸引またはスプリングクランプを使用して、いずれかの印刷ステージ上の基板の移動を防止することが重要である。 TOF-SIMSは、試料上の任意の汚れを観察します非常に表面敏感な手法である。このように、最大​​限の注意を払わなければなりません表面との接触を避けることができます。初めてサンプルが処理されますが、興味のある表面がきれいな手袋（好ましくはポリエチレン）を使用し、新たに洗浄ピンセットで、物と接触すべきではない。我々は通常、クロロホルム、ヘキサンで洗ってください。 5スライドホルダーまたは20スライドホルダー例えば測定前に試料の保存は、最高の、離れてスライドを保持する試料ホルダーに行われます。 配列はつまり、多くの生物学的アッセイフォーマットと読み出しと互換性があるように特別に設計され、使用される基板は、理想的には蛍光スキャナーや光顕微鏡に適した顕微鏡スライドです。これは、フォーマットは、多くの材料·生物学的相互作用を探索するために最適であることを意味します。さらに、形式は材料の数百を並列にスクリーニングすることができます。これは、より多くの材料がそれぞれの新しい材料化学を個別にスクリーニングすることにより、従来の手法に比べてスクリーニングすることができます。生物学的材料の相互作用のための増加範囲は許す生物学的な表面の相互作用だけでなく、特定のアプリケーションに対して最適な素材を見つけるのメカニズムの解明のためだ。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ/モデル番号 </td></tr><tr><td>エポキシスライド</td><td> GENETIX </td><td> K2652 </td></tr><tr><td>プリンタにお問い合わせください</td><td>バイオドット</td><td> XYZ3060プラットフォーム</td></tr><tr><td>金属製のピン</td><td> ArrayIt </td><td> 946MP6B </td></tr><tr><td> TOF-SIMSの楽器</td><td> ION-TOF </td><td></td></tr><tr><td> XPSの楽器</td><td>クラトス</td><td></td></tr><tr><td> WCAの装置</td><td>クルス</td><td> DSA 100 </td></tr><tr><td> AFM </td><td>ブルカー</td><td>ディメンション·アイコン</td></tr><tr><td> RPMI-1640細胞培養培地</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R0883 </td></tr><tr><td> SYTO17 </td><td>インビトロジェン</td><td> S-7579 </td></tr></tbody></table>

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

混合は均一な混合物に2つ以上のコンポーネントを組み合わせて単位操作である。この作品は、インラインスタティックミキサーを使用して2つの粘稠な液体で流れを混合伴います。ミキサーは、コンポーネント間の界面接触を高めるためにせん断および伸長流れを採用し、分割と再結合し、デザインです。プロトタイプの分割と再結合 - （SAR）のミキサーは、PVCパイプに所定の場所に保持細いレーザーカットポリメチルメタクリレート（PMMA）板のシリーズを合わせて構築した。この装置の中で混合することを図で写真に示されている。 1。赤い色素は試験流体の一部に加えて、主要な（未染色）の成分に混入する微量成分として使用した。それは混合部を流れるようにミキサーの入口において、トレーサ液の注入された層が2層に分かれています。後続の各混合部で、水平層の数が重複しています。最終的には、色素の単一ストリームは均一に分散されているTHR装置の断面図でoughout。 0.2パーセントカルボポルと類似した組成のドープトレーサー液の非ニュートン試験流体を使用して、ユニットに混合することにより、磁気共鳴イメージング（MRI）を用いて可視化されています。 MRIは、分子の化学的および物理的な環境だけでなく、ミクロンからセンチメートルに長さのスケールで試料構造の非常に強力な実験的なプローブです。この感度は、人間からの多孔質媒体1,2〜食品に至るまで材料の物理的、化学的および/ ​​または生物学的特性を把握することは、これらの技術の広範なアプリケーションをもたらしました。ここで使用される機器や条件は、普通の水と油を含む有機液体としてNMRの携帯電話、1 H、かなりの量を含むイメージング液体に適しています。伝統的MRIは、工業環境に適しており、実験室（ 図2）内に移植できませんではありません超伝導磁石を利用している。最近の進歩In個の磁石技術は、イメージングプロセス·フローに適した大容量の工業的に互換性のある磁石の建設を許可している。ここでは、MRIは混合プロセス中に異なる軸方向位置で空間分解成分濃度を提供しています。パーソナルケア製品への応用分配混合経由して高粘性流体の混合時間、リアルタイムのこの作品はドキュメント。

オンチップ光重合技術を用いた高分子マイクロアレイの形成の説明。原子間力顕微鏡、水接触角の測定値を使用して高スループット表面特性、飛行二次イオン質量分析法と細胞接着アッセイのX線光電子分光法と時間も記載されている。

特定の生物学的応用に最適化された新規バイオマテリアルの発見は、ポリマーマイクロアレイを用いることで容易に達成され、これにより...

このビデオでは、オンチップ光重合技術を用いてポリマーマイクロアレイを作製し、利用する方法について解説します。まず、ガラススライドをポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）（FEMA）でディップコーティングし、低吸着基板を作製します。次に、モノマーをさまざまな比率で混合し、モノマー溶液のライブラリを作成します。溶液はロボットプリンティング装置を用いてガラススライド形式に転写され、UV照射により硬化させます。モノマーが重合し、溶媒は真空抽出されます。ハイスループットな表面特性評価の後、これらのマイクロアレイは細菌付着アッセイなどの材料性能のスクリーニングに使用できます。接着データの解析は、ポリマーマイクロアレイ形式の有用性を強調し、新規バイオマテリアルの発見へと導くステップとなります。異なる材料の生物学的反応を一つずつ調査する既存の手法に対するこの技術の主な利点は、単一のスライド上で容易に操作可能な数百もの材料を並行してスクリーニングできることです。この技術は、細菌の接着を抑制する材料や、幹細胞の増殖を促進する材料のスクリーニングなど、さまざまな生物学的アッセイに容易に適応させることができます。この技術は、再生医療における多能性幹細胞の増殖をサポートするための、潜在的な応用可能性を持つ材料の発見に寄与してきました。また、細菌の付着を抑制し、医療デバイスに関連する感染症の発生を減少させる可能性を持つ材料が最近発見されたことについても、非常に期待しています。一般的に、この手法に不慣れなユーザーは、最適な条件を予測することが困難であるため、マイクロアレイをプリントするために必要な条件の最適化に苦労することになります。わずかな詳細の誤りが、使用不可能なアレイにつながる可能性があります。また、接着とバイオフィルムの形態は種および培地によって異なり、大幅に変動し得るため、どの細菌株および培養条件を使用するかを検討することも不可欠です。ここでは、モデル生物としてaerogenを用い、厳密に制御された接着アッセイのために化学的に定義された培地を使用します。MITの共同研究者は、DNAおよびタンパク質マイクロアレイとの比較を通じて、この手法の着想を初めて得ました。これらは、それぞれの生物学的なコンビナトリアル空間を探索するための手法として十分に確立されています。DanとBobは、材料科学においても同様の化学的なコンビナトリアル空間が存在し、それを探索する必要があることに気づきました。本手順の実演は、ウェルカム・トラストの助成を受けたプロジェクトの博士研究員であるAndrew HookとChen Changが行います。まず、低吸着のバックグラウンドを準備することから本手順を開始します。これは、タンパク質や細胞などの生体分子の付着を防ぐ表面です。2 gのポリヒドロキシエチルメタクリレート（pHEMA）を50 mL centrifuge tubeに量り取ります。次に、95%エタノール水溶液を加えて、全量を50 mLにします。次に、ピンセットでガラスを軽く保持したまま、FEMAが完全に溶解するまで、または約24時間、チューブを回転機に入れます。エポキシ官能基化ガラスを浸し、端から5 mmを除いてすべてがFEMA溶液に浸かるように滑り込ませます。エポキシ基がFEMAコーティングと共有結合を形成します。コーティングされていない部分は、1秒間、陽性対照として利用できます。スライドをFEMA溶液から取り出し、スライドを反転させてほぼ水平な位置に置き、乾燥させます。スライドが乾いたら、スライドホルダーにセットします。溶媒を完全に蒸発させるため、FEMAコーティング済みスライドを大気条件下で1週間放置してください。次に、モノマー溶液を作成するため、光開始剤溶液 5 µLとジメチルホルムアミド可溶性アクリレート・メタクリレートモノマー 15 µLを384ウェルソースプレートにピペットで分注します。スポット形成には、合計20 µLの容量が最適です。溶液が調製されたので、X、Y、Zステージを備えたコンタクトプリンティングロボットを用いてマイクロアレイを作成します。このロボットは、溶液転送用のリザーバーとして機能するスリットが入った、直径220 µmのスロットピンを使用します。まず、ピンとピンホルダーをジクロロメタンが入った容器に10分間浸します。その後、ピンを乾燥させ、ホルダーをプリントヘッドに再装着します。次に、ピンをホルダーに装着します。次に、ブロッティング用のガラススライド10枚とFEMAコーティング済みスライドをロボットにロードします。通常、各スライドに3つのレプリケートアレイをプリントします。その後、チューブを使用して、ロボットの洗浄ステーションを2.5 litersの新鮮なジメチルホルムアミドが入ったボトルに接続します。モノマー溶液が入ったプレートをロボットにロードします。酸素レベルを 2000 PPM 未満に下げるため、ロボットのチャンバー全体にアルゴンを充填します。この低酸素レベルであれば、重合ラジカルが酸素によって失活することはありません。湿度調節装置を使用して、ロボットチャンバー内の湿度を30から40%の間で維持するように設定します。湿度を調整することでFEMAを膨潤させ、形成されたポリマーがFEMA層に相互浸透し、表面に物理的に捕捉されるようになります。プリントを開始するには、関連するコンピュータのソフトウェアで「go」をクリックします。すると、ピンが25 millimeters per secondの速度でモノマー溶液に降下します。その後、溶液中に2.5秒間保持し、毎秒25ミリメートルの速度で引き上げます。次に、ピンの先端をFEMAスライドに接触させ、ピンのキルト部分から約2.4ナノリットルの溶液を滴下します。1回あたりの合計接触時間は10ミリ秒とし、接近および引き上げ速度は毎秒175ミリメートルとします。次に、ピンの外側に付着したモノマー溶液を除去するため、ガラスブロッティングスライドに繰り返し接触させ、ブロッティングを行います。ブロッティングの手順は、清潔なガラススライドに対して33回の接触を行う構成としています。最初の4つのポジションについては、それぞれ10回、5回、4回、3回の接触を行います。続く4つのポジションは2回のコンタクトを行い、最後の3つのポジションはプリント後に1回のコンタクトを行います。ピンを撹拌したDMFの流れ浴で30秒間洗浄します。同時に、プリントしたスライドに365 nanometerの短波長UV光源を30 millivolts per centimeter squaredの密度で照射します。洗浄と照射が完了したら、次のスライドをプリントします。プリントが正常に行われたことが確認できれば、365 nanometersのUVでさらに10分間、アレイを照射します。プリント後および真空抽出後、未重合のモノマーや溶媒を除去するため、プリントしたばかりのアレイを50 milli tours以下に設定した真空乾燥機に1週間置きます。ポリマースポットの重合が成功したかどうかは、単純な光学顕微鏡を用いて、異常なスポット形態がないか確認することで評価できます。通常、スポットは本図の左側に示されているように、円形で均一である必要があります。形状が変化した主な原因としては、ピンの損傷や汚れ、あるいはモノマー溶液中のほこりによる汚染などが考えられます。このような現象が発生した場合は、少数のモノマーの組み合わせについて、工程を繰り返す必要があります。不整形なスポットが見られる場合があり、例えば、右図に示すような小さなスポットを伴う中心的なスポットや、大きな平坦なスポットの上に中心的なスポットが存在する「目玉焼き状」の形態などが挙げられます。これは、モノマーの粘度、親水性、揮発性、または表面張力の違いに関連し、印刷前の相分離によって引き起こされる可能性があり、そのモノマーの組み合わせがこのフォーマットに適していないことを示唆しています。また、ポリマースポットのさらなる化学マッピングは、スポット全体における材料化学の分布および生成されたマイクロアレイの高スループット表面特性評価（HTSC）を決定するための、重要かつ時に不可欠な品質管理ステップとなります。この手法を用いることで、生物学的性能を物理化学的特性と相関させることが可能になります。これにより、生物材料の相互作用の研究が可能となります。HTSCでは、水接触角測定、飛行時間型、二次イオン質量分析法、原子間力顕微鏡、およびX線光電子分光法が活用されています。特に、TOF-SIMSはサンプルの化学的に詳細な分析を可能にし、細胞応答と分子部位を相関させるために利用できます。場合によっては、生物学的な性能を予測することも可能です。TOF-SIMSスペクトルは、生物学的材料の相互作用における化学的依存性を実証し、HI材料の開発に有用な情報を提供します。ポリマーマイクロアレイ表面の特性評価が完了したら、生物学的相互作用の研究に使用できます。ここでは、細菌付着アッセイにおけるマイクロアレイの使用法を実演します。まず、10 millilitersのLBにGFP標識したpseudomonasの単一コロニーを接種することから始めてください。Aerogenを37°Cで200 RPMで振とうしながら一晩培養します。一晩培養した細菌培養液のOD 600を測定し、15 mLのRPMI 1640を用いて培養液をOD 600が0.01になるまで希釈します。その間に、アレイスライドを洗浄し、蒸留水で10分間滅菌し、未重合のモノマー、配位子、溶媒などのアレイからの可溶性成分を除去します。その後、スライドをエアフローキャビネット内で風乾させます。次に、洗浄済みのアレイスライドを清潔なペトリ皿に入れ、10分間UV滅菌します。細菌培養液の準備ができたら、アレイを載せたスライドをペトリ皿に移し、接種済みのRPMI 1640培地を15 milliliters加えます。別のペトリ皿に別のアレイスライドを配置し、コントロールとして15 millilitersの滅菌済みRPMI 1640を加えます。これらの皿を37 degrees Celsiusで72時間、60 RPMで振盪しながらインキュベートします。インキュベーション後、100 RPMで5分間、15 millilitersの滅菌済みPBSを用いてスライドを3回洗浄します。次に、リン酸塩を除去するために、スライドを15 mLの滅菌蒸留水で2回洗浄します。洗浄後、エアフローキャビネット内でスライドを自然乾燥させます。スライドが乾燥したら、GFPの退色を防ぐため、適切なイメージング技術とソフトウェアを用いて、速やかに蛍光スキャナーで読み取ります。細菌付着による蛍光は、接種サンプルから培地のみのコントロールの蛍光値を差し引くことで算出し、細菌の接着に耐性を持つ材料を特定します。マイクロアレイの作製および細菌付着アッセイは、本ビデオで説明する方法に従って実施しました。ここで示されているように、ポリマーマイクロアレイには、蛍光強度が低い「細菌付着性が低い」材料と、蛍光強度が高い「細菌付着性が高い」材料の両方が含まれています。ここに示されている3つのアレイは繰り返し実験であり、これら3つの繰り返しの蛍光値を平均化し、3D表現として提示しています。ここで示すように、定量的な視覚的解釈が簡略化されます。右側の強度スケールは蛍光データの値を表しています。基本的なレベルでは、蛍光強度の低い材料を特定することで、細菌の付着耐性など、特定の生物学的応用に適した材料を迅速に特定する手段が得られます。しかし、これらの結果をHTSCと組み合わせることで、材料の特定の特性と生物学的性能との相関関係を調査することが可能です。この解析により、構造と機能の関係を解明でき、したがって材料との生物学的相互作用を支えるメカニズムを特定できます。このビデオを視聴することで、ポリマーマイクロアレイの準備とプリント方法について十分に理解し、また、材料に対する細菌の応答を調べるためにポリマーマイクロアレイをどのように利用できるかについての知見を得ることができます。習得すれば、正しく実施することでポリマーマイクロアレイを2日間でプリントすることが可能です。モノマーの調製に約1日、アレイのプリントに約6時間を要します。細菌接着アッセイには5日間かかります。これは、オーバーレイ培養物を接種源として増殖させる時間、マイクロアレイを細菌培養液中で72時間インキュベートする時間、およびマイクロアレイスキャナーを用いて蛍光信号を検出する時間が含まれるためです。なお、本手順を行う際は、ピンおよびピンホルダーを清潔に保つことが重要です。ピンまたはピンホルダーの洗浄が不十分であったために、ランの途中でピンが直立したまま固定され、表面に接触できなくなることは非常にストレスフルな状況です。DMFや毒性モノマーを用いた作業は極めて危険であるため、排気装置などの予防策を常に手順に組み込むことを忘れないでください。

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JoVE Journal

Bioengineering

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