RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

次の実験の全体的な目標は、QPCRまたはハイスループットシーケンシングを使用して、特定のノンコーディングRNAに関連するDNA領域を決定することです。これは、細胞を架橋してin vivoでネイティブのD-N-A-R-N-A相互作用をトラップすることによって達成されます。第2のステップとして、細胞を溶解し、超音波処理にかけ、細胞のライセートとシアークロマチンを小さな断片に可溶化します。

次に、ビオチン化アンチセンスオリゴを細胞ライセートに添加して、R-N-A-D-N-A複合体を特異的に濃縮するために、QPCRまたはハイスループットシーケンシングに基づいてノンコーディングRNA結合ゲノム部位の同一性を解明する結果が得られます。この手法がR-N-A-D-N-A FISHなどの既存の方法よりも優れている点は、チャープにより、ノンコーディングRNA結合部位のゲノムワイドマップを塩基対に近い分解能で取得できることです。この方法は、岩石、RNA、オスのハエがどのようにして線量補償を達成するかなど、ノンコーディングRNA分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の意味、ノンコーディングRNAがクロマチン状態と遺伝子発現をどのように調節するかをよりよく理解できるため、ノンコーディングNA関連疾患の治療に向けた範囲。このRNA精製またはチャープ実験によるクロマチン単離では、遠心分離後に4,000万個の細胞を採取し、PBSをデカントし、ファルコンチューブの底を軽くたたいて細胞ペレットを斜めにずらすように慎重に吸引して残りの液体を除去します。新たに調製した1%グルタルアルデヒドを少量から始めて加え、細胞ペレットのトップを全容量まで再懸濁し、次いで反転して、エンドツーエンドのシェーカーまたはローテーターで室温で10分間クロスリンクを混合し、1.25モルグリシンの10番目の容量で架橋反応をクエンチし、室温で5分間シェーカーに放置します。 セルは明るいオレンジ色に変わります。

次に2000 RCFで5分間回転し、上清をデカントして吸引し、ペレットを20ミリリットルのチルドPBSで洗浄し、再びスピンし、上清を吸引し、洗浄した架橋口蓋をチルドPBSで再懸濁します。細胞の各ミリリットルをアイノールチューブに移し、摂氏4度で2000 RCFで3分間回転させます。遠心分離後、ピペットチップを使用して、できるだけ多くのPBSを慎重に除去します。

フラッシュ、液体窒素ですべての細胞ペレットを凍結し、摂氏マイナス80度で無期限に保存。チャープ用の細胞ライセートを調製するには、凍結した架橋細胞ペレットを室温で解凍します。強く叩いてセルペレットをはがし、混合します。

ペレットをスピンダウンし、鋭利な10マイクロリットルのピペットチップを使用して、1ミリグラムの精度の電子天びんに残っているPBSを取り除きます。空のアイノールチューブの塊を引き裂きます。各ペレットの重量を量り、その重量を記録します。

新鮮なプロテアーゼ阻害剤PMSFとSuper aceを添加した10倍量の溶解バッファーを各チューブに加え、ペレットを再懸濁します。細胞溶解物は、調製後すぐに染色する必要があります。1.5ミリリットル以下のライセートを各15ミリリットルのファルコンチューブに移し、超音波処理プローブをしっかりとねじ込んで挿入します。

次に、チューブをバイオ破裂に置き、最高設定で摂氏4度で超音波処理し、パルス間隔から45秒オフで30秒で超音波処理します。ライセートを30分ごとにチェックしてください。細胞溶解物が濁らなくなるまで超音波処理を続けます。

これには、チューブの数、サンプル量、浴温度、および超音波処理時間の期間に応じて、30分から4時間かかる場合があります。ライセートが透明になったら、5マイクロリットルを新しいアイノアチューブに移します。DNAプロテアーゼKバッファーとプロテアーゼKボルテックスを添加して混合し、スピンダウンし、PCR精製キットでDNAを抽出した後、摂氏50度で45分間インキュベートします。

1%アロスゲルでDNAサイズを確認します。DNA塗抹標本の大部分は、完全な超音波処理遠心分離機を示す100〜500塩基対であるべきです。16,100 RCFで10分間、摂氏4度で超音波処理されたサンプルの1ミリリットルのアリコートは、上清を新鮮なeinor tubesに移し、液体窒素で急速凍結して、典型的なチャープサンプルの室温でクロマチンのチャープ解凍チューブの手順を開始する。

1ミリリットルのライセートを使用して、RNAインプット用に10マイクロリットル、DNAインプット用に10マイクロリットルを取り出し、アイノールチューブに入れます。さらに氷の上に保ちます。各クロマチンサンプル1ミリリットルを15ミリリットルのファルコンチューブに移します。

各チューブに2ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーを添加します。次に、プローブを室温で解凍します。これらのビオチン化タイリングオリゴは、RNAに沿った位置に従って標識され、2つのプールに分離されます。

偶数プールには、偶数番号を持つすべてのプローブが含まれます。また、奇数プールには、奇数番号のプローブが含まれています。すべての実験は、互いの内部制御として機能する両方のプールを使用して実行されます。

真のプロトコールの最も困難な側面の1つは、すべてのハイブリダイゼーションと洗浄のステップを37°Cで実行する必要があることです。実験温度を一定に保つために、すべてのステップをハビ化オーブン内またはその近くで行い、特定のチューブに適切な量のプローブを追加します。よく混ぜ合わせ、ハイブリダイゼーションが完了する20分前に振とうしながら、37度で4時間インキュベートします。

C one磁気ビーズを準備します。プローブ100ピコモルあたり100マイクロリットルを使用します。Dyna mag 2ストリップマグネットを使用して、1ミリリットルのunsu添加溶解バッファーで3回洗浄し、バッファーからビーズを分離します。

最終洗浄後、ビーズを元の容量の溶解バッファーに懸濁し、スーパーインフレッシュPMSFおよびプロテアーゼ阻害剤を補充します。4時間のハイブリダイゼーション反応が完了したら、各チューブミックスに100マイクロリットルのビーズを加えます。最初の洗浄で摂氏37度に予熱した1ミリリットルの洗浄緩衝液で振とうする洗浄ビーズを30分間よくインキュベー

dyna mag 15磁気ストリップを使用してビーズを分離し、デカントして1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、1.5ミリリットルのEORチューブに移します。摂氏37度でインキュベートし、その後の洗浄で5分間振とうし、ミニ遠心分離機で各チューブをスピンダウンし、サンプルをダイナマグ2磁気ストリップにセットして1分間のデカントサンプルにします。滴り落ちたものはキムワイプで拭き取り、1ミリリットルに再懸濁します。

緩衝液を洗浄し、摂氏37度で5分間振とうしながらインキュベートします。最後の洗濯Resusで合計5回の洗濯を繰り返します。ビーズをしっかりと懸濁し、100マイクロリットルを取り外し、DNA画分のためにRNA分離のために900マイクロリットルを取っておきましょう。

すべてのチューブをダイナマグチューブ磁気ストリップに置き、ウォッシュバッファーを取り外します。少し回転させた後、チューブをマグネットストリップに再度置き、10マイクロリットルのピペットチップを鋭利にします。残りの洗浄バッファーを各チューブから完全に取り出します。

その後、RNAおよびDNAフラクションをチャープサンプルから単離し、定量およびシーケンシングを行います。この図は、GA dh を超える HELOC 細胞からのヒトテロメラーゼ、RNA、またはトルコの濃縮を示しています。ネガティブコントロールとして機能する豊富な細胞RNA。

細胞内に存在するTulk RNAの大部分、約88%がチャープを行うことにより引き下げられたのに対し、GA DH RNAの0.46%のみが回収され、約200倍の濃縮係数が示された。これは通常、哺乳動物細胞では発現しないLAC ZRNAを標的とするプローブなどの非特異的プローブは、追加のネガティブコントロールとして使用することができる。ターゲットに結合すると予想されるDNA領域。長いノンコーディングRNAは、QPCRで測定すると、通常、負の領域に濃縮されます。

この図は、タークおよびGA DH DNA部位がネガティブコントロール領域として機能している間、同じ細胞株でチャープSSEを実行することによって決定された、初代ヒト包皮線維芽細胞の4つの熱風結合部位のQPCR検証を示しています。偶数プローブセットと奇数プローブセットの両方で、負の領域よりも予想される熱気結合部位の濃縮度が同等に得られました。真の長鎖ノンコーディングRNA結合部位の特徴。

長いノンコーディングRNA結合部位のグローバルマップは、このデータによって示されるように、チャープ濃縮DNAのハイスループットシーケンシングによって取得できます trla 長いノンコーティングRNA Rocks two、これは、投与量補償に必要な方法でX染色体と相互作用することが知られています。偶数サンプルと奇数サンプルの両方を別々に配列決定し、それらのユニークなノイズを除去して、各ピークが岩石の2つの結合を強く示している重なり合う信号のトラックを生成しましたこの手順を試みている間。この手順に従って、正しいRNAフリー技術を行使することが重要です。

タンパク質ドブロッティングなどの他の方法は、その開発後に関心のある非臨床DRNAと相互作用しているタンパク質などの追加の疑問に答えるために実施することができる。CHIは、RNA生物学分野の研究者が培養細胞や固定組織におけるRN活性をマッピングする道を開きました。