RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

本実験の全体的な目的は、qPCRまたはハイスループットシーケンシングを用いて、特定の非コーディングRNAに関連するDNA領域を特定することです。これは、細胞を架橋することで、in vivoにおける天然のDNA-RNA相互作用を捕捉することにより達成されます。第2ステップとして、細胞を溶解させ、超音波処理を行うことで細胞溶解物を可溶化し、クロマチンを小さな断片に剪断します。

次に、目的のRNA-DNA複合体を特異的に濃縮するために、ビオチン化アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞溶解液に添加し、qPCRまたはハイスループットシーケンシングに基づき、結合している非コードRNAのゲノム上の部位を特定する結果を得ます。RNA-DNA FISHなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、ChIRPを用いることで、ほぼ塩基対レベルの解像度で非コードRNA結合部位のゲノムワイドなマップを作成できる点にあります。この手法は、roxRNAsなどがオスのショウジョウバエにおいてどのように用量補償を実現しているかといった、非コードRNA分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

この手法は、非コードRNAがクロマチン状態および遺伝子発現をどのように制御しているかをより深く理解することを可能にするため、非コードRNA関連疾患の治療法への展開が期待されます。このRNA精製によるクロマチン単離またはChIRP実験では、遠心分離後に40 million個の細胞を回収し、PBSをデカントした後、角度をつけて注意深く吸引して残液を除去し、ファルコンチューブの底を叩いて細胞ペレットを剥離させます。新しく調製した1% glutaraldehydeを、まず少量から加えて細胞ペレットを再懸濁させ、その後全量まで満たして転倒混和し、エンドツーエンドシェーカーまたはローテーターを用いて室温で10分間架橋します。1.25 molar glycineを1/10量加えて架橋反応を停止させ、室温のシェーカー上で5分間静置すると、細胞が鮮やかなオレンジ色になります。

次に、2000 RCFで5分間遠心分離し、上清をデカンテーションおよび吸引で除去した後、冷やしたPBS 20 millilitersでペレットを洗浄します。再度遠心分離し、上清を吸引し、洗浄した架橋ペレットを冷やしたPBSで再懸濁します。細胞を1 milliliterずつエッペンドルフチューブに移し、4 °C、2000 RCFで3分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットチップを使用して、PBSを可能な限り慎重に除去します。

すべての細胞ペレットを液体窒素で急速凍結し、-80°Cで期限なく保存します。ChIRP用の細胞溶解液を調製するには、凍結した架橋細胞ペレットを室温で解凍します。激しくタッピングして細胞ペレットを剥離させ、混合します。

ペレットを遠心分離し、1 mg単位で測定可能な電子天秤上で、鋭い 10 µL ピペットチップを用いて残っている PBS を取り除きます。空の einor チューブの質量を風袋として差し引きます。各ペレットの重量を測定し、記録してください。

新鮮なプロテアーゼ阻害剤であるPMSFおよびsuper aceを添加した溶解バッファーを、ペレットの10倍量まで各チューブに加え、再懸濁します。細胞溶解物は調製後すぐに氷上に置く必要があります。溶解物を1.5 mL以下ずつ各15 mLファルコンチューブに移し、ソニケーションプローブをしっかりと締め付けて挿入します。

次に、チューブをバイオラプチャー（超音波破砕機）にセットし、4 °Cで最高設定にて、30秒間の照射と45秒間の休止を繰り返すパルス照射でソニケーションを行います。30分ごとにライセートを確認してください。細胞ライセートの濁りがなくなるまで、ソニケーションを継続します。

チューブの数、サンプル量、バスの温度、および超音波処理の時間によって、この操作には30分から4時間かかる場合があります。ライセートが透明になったら、5 µLを新しいエッペンドルフチューブに移します。DNAプロテアーゼKバッファーとプロテアーゼKを加え、ボルテックスで混合して短時間遠心し、50 °Cで45分間インキュベートした後、PCR精製キットを用いてDNAを抽出します。

1%アガロースゲルでDNAサイズを確認します。DNAのスミアの大部分が100から500 base pairsであることは、超音波処理が完了していることを示しています。超音波処理したサンプルの1 mL分注液を、4 °Cで16,100 RCF、10分間遠心分離します。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、液体窒素で急速凍結させます。ここからChIRPの手順を開始します。一般的なChIRPサンプルとして、クロマチンの凍結チューブを室温で解凍します。

1 mLのライセートを用い、RNA入力用に10 µL、DNA入力用に10 µLを分注してエパンドルフチューブに移します。その後まで氷上で保持してください。各クロマチンサンプル1 mLを15 mLファルコンチューブに移します。

各チューブに2 mLのハイブリダイゼーションバッファーを加えます。次に、プローブを室温で解凍します。これらのビオチン標識タイリングオリゴは、RNA上の位置に従ってラベル付けされ、2つのプールに分けられています。

偶数プールには偶数番号のすべてのプローブが含まれています。そして、奇数プールには奇数番号のプローブが含まれています。すべての実験は、互いに内部コントロールとして機能するこれら両方のプールを用いて行われます。

本プロトコルにおいて最も困難な点の一つは、すべてのハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップを37°Cで行う必要があることです。実験温度を一定に保つため、すべての操作をハイブリダイゼーションオーブンの内部またはその付近で実施してください。適切な量のプローブを各チューブに加えます。よく混合し、振盪しながら37°Cで4時間インキュベートし、ハイブリダイゼーション完了の20分前に終了させます。

C one磁気ビーズを準備します。プローブ100 pico moleあたり100 µL使用してください。Dyna mag twoストリップマグネットを用いてビーズをバッファーから分離し、unsu添加溶解バッファー1 mLで3回洗浄します。

最終洗浄後、ビーズを元の容量の溶解バッファーで再懸濁し、新鮮なPMSFとプロテアーゼ阻害剤を添加します。4時間のハイブリダイゼーション反応が完了したら、各チューブに100 µLのビーズを加えて混合します。37 °Cで30分間、振盪しながらインキュベートし、最初の洗浄では37 °Cに予熱した1 mLの洗浄バッファーでビーズを洗浄します。

DynaMag 15磁気セパレーターを用いてビーズを分離し、上清を除去した後、1 mLの洗浄バッファーで再懸濁させ、1.5 mLのEORチューブに移します。37 °Cで5分間振とうしながらインキュベートします。以降の洗浄においても同様に、各チューブをミニ遠心機でスピンダウンさせ、サンプルをDynaMag 2磁気セパレーターに1分間静置して、サンプルをデカントします。液だれはキムワイプで拭き取り、1 mLで再懸濁させます。

洗浄バッファーを用い、37 °Cで5分間振とうしながらインキュベートする。この操作を計5回繰り返す。最後の洗浄後、ビーズを十分に再懸濁させ、100 µLを分取してRNA抽出用に確保し、残りの900 µLをDNA画分用として保存する。

すべてのチューブをdyna magチューブ用マグネットストリップに配置し、洗浄バッファーを除去します。短時間遠心した後、チューブを再びマグネットストリップに配置し、鋭利な10 µLピペットチップを用いて、各チューブから残りの洗浄バッファーを完全に除去します。

その後、定量およびシーケンシングのために、chirpサンプルからRNAおよびDNA画分を単離します。この図は、HELOC細胞におけるヒトテロメラーゼRNAまたはTurkの、GA dhに対する濃縮を示しています。後者は陰性対照として用いられる、豊富に存在する細胞内RNAです。

細胞内に存在するTurk RNAの大部分（約88%）がChIRPによってプルダウンされた一方で、GAPDH RNAはわずか0.46%しか回収されず、約200倍の濃縮係数が示された。通常、哺乳類細胞では発現していないLACZ RNAを標的とするプローブなどの非特異的プローブを、追加のネガティブコントロールとして使用できる。標的と結合すると予想されるDNA領域については、qPCRで測定した際、通常、ネガティブ領域よりも長鎖非コードRNAが濃縮される。

この図は、同一の細胞株でChIRP-SSEを実施して決定した、ヒト原皮膚前立腺線維芽細胞における4つのhot air結合部位のQPCR検証結果を示しており、TurkおよびGA DH DNA部位が陰性対照領域として機能しています。偶数および奇数の両方のプローブセットにおいて、陰性領域と比較して期待されるhot air結合部位の同等の濃縮が認められました。これは、真の長鎖非翻訳RNA結合部位の特徴です。

dosage compensation（用量補正）に必要な様式でX染色体と相互作用することが知られているlncRNA RoX2のデータに示されるように、ChIRPで濃縮したDNAの高スループットシーケンシングにより、長鎖非コードRNA結合部位のグローバルマップを得ることができます。偶数および奇数のサンプルの両方を個別にシーケンシングし、それぞれのユニークノイズを除去することで、各ピークがRoX2結合の強力な部位を示すオーバーラップ信号のトラックを作成しました。この手順を行う際は、正しいRNaseフリー技術を実践することが重要です。

開発後、目的の非臨床DRNAと相互作用しているタンパク質は何かといった追加の疑問に答えるために、プロテインドットブロッティングなどの他の手法を実施することが可能です。CHIは、培養細胞や固定組織におけるRNA活性をマッピングするための、RNA生物学分野の研究者に道を開きました。